71
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: CÁCH PHA CHẾ PHẨM EMINA THẢO MỘC VÀ THẢO DƯỢC, DUNG DỊCH CHOLORINE
a) EMINA thảo mộc
Gồm các nguyên liệu sau:
Từ 250ml EMINA gốc + 500ml gỉ ựường (hoặc 0.5 Kg ựường ựỏ) + 9 lắt nước + Củ, cỏ, qủa xanh.Hỗn hợp thu ựược sẽ ựược sử dụng sau 7 ngày ủ.
Lấy 1ml dịch trong của hỗn hợp này + 1 lắt nước phun ựẫm cho cây trồng vào chiều tối hay sáng sớm, cứ 15 ngày phun một lần (Tránh phun vào hoa lúc cây ựang ở giai ựoạn ra hoa) .
b) EMINA thảo dược
Gồm các nguyên liệu sau:
- Hỗn hợp 1: 1 lắt EMINA gốc + 1 lắt rượu + 1 lắt dấm ăn + 1 lắt gỉ ựường. Hỗn hợp này ngâm trong vại sành ựậy nắp trong 24 giờ.
- Hỗn hợp 2: 1 lạng (100g) tỏi (xay nát ựể ngoài không khắ 15 phút) +
50g ớt ựỏ (bỏ hạt và xay nát).
Ngâm hỗn hợp 2 trong hỗn hợp 1 trong 24h trong vại sành hoặc lọ thủy tinh và ựậy nắp sẽ ựược hỗn hợp 3.
Sau 2 ngày chắt lấy nước trong từ hỗn hợp 3 ựể sử dụng trong 1-2 tuần là tốt nhất.
+ Cách phun
Dùng từ 3-5 ml dung dịch từ hỗn hợp 3 + 1 lắt nước ta có dung dịch sử dụng
(hỗn hợp 4). Phun ựịnh kỳ 1-2 tuần/lần.Ước tắnh lượng hỗn hợp 4 ựể dùng phun 1
sào khoảng 20 lắt/lần. Trong 1 ựời cây phun từ 6-10 lần. Tránh phun vào lúc cây ựang ở giai ựoạn ra hoạ Cây trồng khỏe mạnh, ựẹp mã, năng suất tăng.
c) Hướng dẫn pha dung dịch Chlorine
Pha loãng dung dịch Chlorine (từ Chlorine nước có nồng ựộ cao ra Chlorine có nồng ựộ thấp hơn)[41].
72
V1 x C1 = V2 x C2
Trong ựó:
V1, C1: lần lượt là thể tắch (lắt), nồng ựộ (ppm) của dung dịch Chlorine chuẩn ban ựầu
V2, C2: lần lượt là thể tắch (lắt), nồng ựộ (ppm) của dung dịch Chlorine cần pha
Vắ dụ: Tắnh thể tắch dung dịch Chlorine chuẩn (5000ppm) cần lấy ựể pha chế ựược 20 lắt dung dịch Chlorine có nồng ựộ 100ppm
C2 x V2 100 x 20 C1 5000
Vậy thể tắch dung dịch Chlorine cần lấy là 0.4 lắt
PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG PHÁP TRỒNG VÀ CHĂM SÓC RAU QUẢ
Cách trồng : Khoảng cách trồng 20-30 cm( ựối với cải mơ, xà lách). Mật ựộ 99,720 cây/ha
Khoảng cách trồng 30- 60 cm( ựối với Cà chua)
Nền phân bón Rau cải và xà lách: (Phân hữu cơ 1,39 tấn + 154,48 kg Ure + 390 kg Lân+ 36 kg Kaliclorua)/ha
Nền phân bón Cà chua: (Phân hữu cơ 11,7 tấn + 247,49 kg Ure + 366 kg Lân+ 163,33 kg Kaliclorua)/ha
Diện tắch 1 ô thắ nghiệm là 5m2 với 3 lần lặp lạị Khoảng cách ly của ruộng thắ nghiệm: 5m
Cách bón phân: Bón lót toàn bộ phân hữu cơ và P205 + 40% Lượng Ure + 50% Lượng K205. Bón thúc số phân còn lại khi cây ựược 10 ngàỵ
Bón phân, phun thuốc bảo vệ thực vật theo quy trình bón phân do bộ nông nghiệp và PTNT khuyến cáo cho RAT cho tất cả các công thức thắ nghiệm.
đối với su hào, dưa lê: khoảng cách trồng: 30 x 40cm, mật ựộ: 60.000 cây/ ha
V1 = =
73
Nền phân bón Su hào: (Phân hữu cơ 8,68 tấn + 266,35 kg Ure + 498,06 kg Lân+ 250,98 kg Kaliclorua)/ha
Nền phân bón Dưa lê: (Phân hữu cơ 9,25 tấn + 231,15 kg Ure + 344,44 kg Lân+ 148,33 kg Kaliclorua)/ha
Bắt ựầu phun EMINĂ thảo mộc, thảo dược), phun ựẫm toàn bộ lá vào buổi chiều mát, ựịnh kỳ 7 ngày/lần. Phun khoảng 4 Ờ 6 lần trong suốt quá trình sinh trưởng của cây su hào, Dưa lê siêu ngọt và ngừng phun trước khi thu hoạch lần 1 một tuần.
Bón phân và phun thuốc BVTV theo quy trình do bộ nông nghiệp khuyến cáo cho RAT cho tất cả các công thức thắ nghiệm( trừ công thức 7)
PHỤ LỤC 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU CỦA RAU QUẢ
a) Phương pháp ựịnh lượng Coliforms có trong rau theo tiêu chuẩn TCVN 6848:2007(ISO 4832 : 2006) bằng kỹ thuật ựếm khuẩn lạc
* Nguyên tắc:
- Chuẩn bị hai môi trường ựặc chọn lọc, và lấy một lượng mẫu thử theo quy ựịnh nếu là sản phẩm ban ựầu là chất lỏng, hoặc lấy một lượng huyền phù ban ựầu theo quy ựịnh nếu sản phẩm ở dạng khác.
- Chuẩn bị các cặp ựĩa môi trường chọn lọc khác trong cùng một ựiều kiện, dùng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban ựầụ
- Ủ các ựĩa này ở 30oc hoặc 37oc trong 24h ổ 2h.
- đếm các khuẩn lạc ựặc trưng và nếu cần, sô khuẩn lạc ựược khẳng ựịnh bằng lên men Lactozạ
* Thiết bị, dụng cụ
ỚTủ ấm 37.0 ổ 1.0oC.
74
ỚMáy ựồng nhất mẫu (Stomacher)
ỚMáy trộn mẫu (Vortex)
Ớđĩa Petri, túi PE vô trùng
ỚPipette 100ộl Ờ 1000 ộl
Ớ Kéo, kẹp vô trùng ựể lấy mẫu
Ớ Cân ựiện tử (d=0.01g)
Ớ Các vật dụng khác
* Môi trường và hóa chất
Ớ Saline pepton water (SPW).
Ớ Thạch lactoza mật ựỏ tắm (VRBL)
Ớ Canh thang mật lactoza lục sáng (BGB)
* Cấy và ủ mẫu:
- Dùng pipet vô trùng cho vào tâm của mỗi ựĩa 1ml của mẫu thử nếu là sản phẩm lỏng hoặc của các dung dịch pha loãng thắch hợp. Sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.
- Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL ở 44oc ựến 47oc vào mỗi ựĩa Petrị Thời gian tắnh từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban ựầu ựến thời ựiểm rót môi trường vào ựĩa không vượt quá 15 phút.
- Trộn ựều dịch cấy với môi trường và ựể cho hỗn hợp ựông ựặc lại bằng cách ựặt ựĩa Petri ở một mặt phảng ngang, mát.
- đồng thời chuẩn bị một ựĩa kiểm tra với 15ml môi trường ựể kiểm tra ựộ vô trùng.
- Sau khi ựông ựặc hoàn toàn, rót khoảng 4ml môi trường VRBL lên bề mặt của môi trường cấỵ để cho ựông lạị
75
* đếm các khuẩn lạc:
- Sau thời gian ủ chọn các ựĩa Petri có từ 10 Ờ 150 khuẩn lạc. đếm các khuẩn lạc màu ựỏ ánh tắm có ựường kắnh ≥ 0,5 mm (ựôi khi có vùng mật tủa hơi ựỏ bao quanh) các khuẩn lạc này ựược coi là Coliform ựiển hình nên không cần phải thử khẳng ựịnh tiếp.
- đếm và khẳng ựịnh các khuẩn lạc không ựiển hình( kắnh thước nhỏ)
* Khẳng ựịnh:
- Cấy 5 khuẩn lạc không ựiển hình vào ống nghiệm canh thang mật Lactoza lục sáng. Ủ các ống nghiệm này trong tủ ấm ở 30oc hoặc 37oc trong 24h ổ 2h. Các ống Durham cho thấy có sinh khắ thì ựược coi là chứa Coliforms. Lấy kết quả ựếm trong phép tắnh.
b) Phương pháp ựịnh lượng Ecoli có trong rau theo tiêu chuẩn TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) bằng kỹ thuật ựếm khuẩn lạc.
* Nguyên tắc:
- Cấy một lượng mẫu thử xác ựịnh hoặc với một lượng xác ựịnh huyền phù ban ựầu lên các ựĩa kép chứa môi trường trypton-mật-glucuronid (TBX).
- Sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban ựầu cấy vào hai ựĩa cho mỗi dung dịch pha loãng, trong cùng một ựiều kiện.
- Các ựĩa này ựược ủ ở 44oC ổ 1oC trong 18 h ựến 24 h rồi kiểm tra ựể phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc ựặc trưng ựược coi là Escherichia coli
dương tắnh β-glucuronidazạ
- Tắnh số lượng ựơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của Escherichia coli
dương tắnh β-glucuronidaza trên gam hoặc trên mililit mẫụ
*Thiết bị, dụng cụ
ỚThiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).
76
ỚNồi cách thuỷ, có thể duy trì ựược nhiệt ựộ từ 440C ựến 470C
ỚBình, ống nghiệm hoặc chai, có dung tắch thắch hợp.
ỚPipet hoặc micropipet, xả hết (ựầu thổi), miệng rộng và có dung tắch danh ựịnh từ 1 ml ựến 10 ml, ựược chia vạch 0,1 ml ựến 0,5 ml tương ứng.
Ớđĩa Petri, ựường kắnh khoảng 90 mm.
ỚMáy ựo pH, có ựộ chắnh xác ựến ổ 0,1 ựơn vị pH.
Ngưỡng ựo tối thiểu của máy ựo pH phải là 0,01 ựơn vị pH. Máy ựo pH có thể ựược gắn với hệ thống cân bằng nhiệt tự ựộng hoặc ựiều chỉnh bằng taỵ
* Môi trường và hóa chất
ỚSaline pepton water (SPW).
ỚMôi trường thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)
* Cấy và ủ mẫu:
- Dùng pipet vô trùng cho vào tâm của mỗi ựĩa 1ml của mẫu thử nếu là sản phẩm lỏng hoặc của các dung dịch pha loãng thắch hợp. Sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.
- Rót khoảng 15 - 20 ml môi trường TBX ở 44oc ựến 47oc vào mỗi ựĩa Petrị Thời gian tắnh từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban ựầu ựến thời ựiểm rót môi trường vào ựĩa không vượt quá 15 phút.
- Trộn ựều dịch cấy với môi trường và ựể cho hỗn hợp ựông ựặc lại bằng cách ựặt ựĩa Petri ở một mặt phảng ngang, mát.
- đồng thời chuẩn bị một ựĩa kiểm tra với 15ml môi trường ựể kiểm tra ựộ vô trùng.
- Sau khi ựông ựặc hoàn toàn lật ngược ựĩa ựã cấy và ựể vào tủ ẩm ở 44oc ổ 1oc trong 24h ổ 2h.
* đếm các khuẩn lạc:
- Sau thời gian ủ chọn các ựĩa Petri có từ 10 Ờ 150 khuẩn lạc. đếm các khuẩn lạc màu xanh. đây chắnh là những khuẩn lạc ựiển hình.
77
* Tắnh kết quả: (theo ISO 7218:1996) cho cả hai chỉ tiêu Coliforms và Ecolị
+ Trường hợp chung: Các ựĩa có số khuẩn lạc thuộc khoảng 15 Ờ 300.
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu ựược tắnh theo công thức:
N = ∑C
(n1+0,1n2).d Trong ựó:
N: số khuẩn lạc/g hay số khuẩn lạc trên ml.
∑C: Tổng các khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa n1:Số ựĩa ựếm ựược ở nồng ựộ pha loãng thứ nhất n2: Số ựĩa ựếm ựược ở nồng ựộ pha loãng thứ hai d: độ pha loãng cho số ựếm thứ nhất
+ Nếu ở nồng ựộ ban ựầu (10-1), hai ựĩa có số khuẩn lạc nhỏ hơn 15.
Tắnh số khuẩn lạc trung bình, y, của hai ựĩạ Kết quả ựược tắnh theo công thức N = y/d (d là nồng ựộ dịch mẫu ban ựầu) và ựược biểu diễn là số vi sinh vật ước tắnh (CFU Est./g)
+ Nếu ở nồng ựộ ban ựầu (10-1), hai ựĩa không có khuẩn lạc
Kết quả ựược biểu diễn là < 1/d (d là nồng ựộ dịch mẫu ban ựầu)
+ Không có ựĩa nào có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15 Ờ 300
Nếu không có ựĩa nào có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15- 300 nhưng ắt nhất có một ựĩa nhiều hơn 300 và một ựĩa < 15. Khi ựó kết quả ựược tắnh dựa vào ựĩa có số khuẩn lạc gần với 300.
- Làm tròn số (theo ISO 7218:2007)
Kết quả số khuẩn lạc sau khi tắnh phải ựược làm tròn ựến hai con số có nghĩạ Làm tròn theo nguyên tắc sau:
- Nếu số thứ ba (từ trái tắnh sang) là 5,6,7,8 hoặc 9 thì tăng số thứ hai lên một ựơn vị và các số từ thứ ba trở ựi (sang phải) ựều là số 0. Vắ dụ số tắnh ựược là 1,27 x 104 và sau khi làm tròn số là 1.3 x 104
78
- Nếu số thứ ba (từ trái tắnh sang) là 1,2,3 hoặc 4 thì giữ nguyên số thứ hai và các số từ thứ ba trở ựi (sang phải) ựều là số 0. Vắ dụ số khuẩn lạc tắnh ựược 1.22 x 104 và sau khi làm tròn số là 1.2 x 104
c) Phương pháp ựịnh tắnh Salmonella có trong rau theo tiêu chuẩn TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002).
* Nguyên tắc:
Quy trình tăng sinh hai giai ựoạn ựược sử dụng. Mẫu thực phẩm ựược ựồng nhất và ủ trong canh tăng sinh không chọn lọc. Sau 24 giờ, cấy chuyển sang 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc thứ cấp. Việc phân lập ựược tiến hành ựồng thời trên hai loại môi trường thạch chọn lọc. Các ựặc tắnh hình thái, sinh lý, sinh hoá ựược dùng ựể ựịnh danh.
* Thiết bị, dụng cụ
ỚTủ ấm 41,5+1,0oC, 37+1,0oC.
ỚBể ựiều nhiệt
ỚMáy ựồng nhất mẫu (Stomacher)
Ớđĩa Petri, bao PE vô trùng, bút viết kắnh
ỚPipette, Micropipette 100ộl Ờ 1000 ộl, ựầu tip vô trùng
ỚKéo, kẹp vô trùng ựể lấy mẫu
ỚCân ựiện tử (d=0.01g)
ỚCác vật dụng khác
* Môi trường và hóa chất
- Môi trường tăng sinh sơ bộ không chọn lọc: dung dịch ựệm pepton - Môi trương tăng sinh chọn lọc thứ nhất: Môi trường Rappaport Ờ Vassiliadis với ựậu tương(môi trường RVS)
- Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ 2: Mềi trường Novobioxin tetrathionat Muller−Kauffmann (môi trường MKTTn)
79
+ Môi trường thứ nhất: Thạch deoxycholat lyzin xyloza (thạch XLD) + Môi trường thứ hai: Thạch (BPLS)
- Thạch dinh dưỡng
- Thạch TSI (triple sugar/iron agar) - Thạch Ure (Christensen)
- Môi trường L-Lyzin khử Cacboxyl - Thuốc thử phản ứng Indol
- Thạch dinh dưỡng nửa ựặc - Dung dịch muối sinh lý
f) Xác ựịnh dư lượng thuốc BVTV bằng phương pháp ựịnh tắnh( thử nhanh)
* Bộ dụng cụ thử nhanh
- Hộp nhựa nhỏ ựựng pipette
- Chai nhựa ựựng mẫu dung tắch 30ml( 05 chai) - Miếng dán decal(1 bịch)
- pipette nhựa 12 cái, thủy tinh 05 cái - Ống nghiệm thủy tinh 18 ống
- Nhiệt kế 01 cái
- Giá ựể ống ngiệm 01 cái - Khay nhôm 01 cái
- Bóng ựèn tròn 25W (2 bóng) - Bơm sục khắ 01 cái
- Hộp ựèn 01 cái
- Cọ rửa ống nghiệm loại nhỏ 01 cái - Quả bóp cao su nhỏ 01 cái
80
* Dung dịch thuốc thử gồm :
(1) Dung môi 1 (4)Thuôc thử GT-2 (7)Thuôc thử GT-3.1 (2) Dung môi 2 (5)Thuôc thử GT-2.1 (8)Thuôc thử GT- 4 (3)Thuôc thử GT-1 (6)Thuôc thử GT-3 (9)Thuôc thử GT- 5
* Nguyên tắc của phương pháp:
Dựa vào ựặc tắnh ức chế men acetylcholinesterase của các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm Phospho hữu cơ, Carbamate
- Khi cho men acetylcholinesterase vào trong dung dịch chiết mẫu rau quả có chứa dư lượng thuốc trừ sâu Phospho hữu cơ, Carbamate thì 1 phần men này bị ức chế chỉ còn lại một phần thừạ
- Men acetylcholinesterase tự do không bị ức chế thủy phân acetylcholin tạo acid acetic và cholin.
- Dựa vào phản ứng tạo màu củaacetylcholin còn thừa với thuốc thử GT mà xác ựịnh ựược mức ựộ thuốc trừ sâu trong rau quả.
* Các bước tiến hành:
- Chiết mẫu:
a) đặt khay nhôm lên hộp ựèn, cắm ựiện cho ựèn sáng, ựổ nước 1 phần nước sôi + 05 nước lạnh. Nhúng nhiệt kế sao cho nhiệt ựộ khoảng 35 ổ 2 oc . Sau ựó lấy thuốc thử GT Ờ 1 ựặt lên khay rồi hâm cho tan.
b) Mẫu thử ựã ựược cắt nhuyễn và trộn ựều cho vào chai ựựng mẫu ựến khoảng vạch thứ 2( khoảng 5g).
c) Dùng pipet thêm dung môi 1 vào chai ựựng mẫu sao cho dung môi ngập xâm xấp mẫụ đậy nắp, lắc kỹ trong 1 phút.
d) Dùng pipet nhựa cho 1ml nước vào ống nghiệm mới ựể làm mực so sánh cho bước tiếp theọ
81
(c) vào ống nghiệm mới( khoảng 1ml). ựể luôn pipet trong ống nghiệm ựể làm thắ nghiệm tiếp.
f) Dùng pipet nhựa rút 1ml dung môi 2 vào ống nghiệm chứa dung dịch chiết mẫu ( ống nghiệm ựược thực hiện ở bước (e)). Lúc này trong ống nghiệm chia thành 2 phần:
+ Phần trên là dung môi 2: không màu
+ phần dưới là dung dịch chiết mẫu ( dung môi 1 và chất ựộc ựược hòa tan): có màu tuy theo mẫu vật.
h) đặt ống nghiệm vào giá trên khay nước ấm. Nối ựầu trên của Pipet thủy tinh ựã thực hiện ở bước (e) với ống nhựa của máy bơm sục khắ, khóa chặt van ựiều chỉnh, cắm ựiện cho máy bơm hoạt ựộng( mở nhẹ van ựiều chỉnh, không sục mạnh ựể tránh dung dịch tràn ra ngoài). Sục khắ cho ựến khi dung môi 1 ở phắa dưới bay hơi hoàn toàn nghĩa là trong ống nghiệm chỉ còn dung môi 2. Bây giờ mẫu chiết ựã chuyển sang dung môi 2. Quá trình chiết mẫu ựã ựược hoàn tất.
- Bước thử nghiệm dư lượng: Lưu ựồ của thử nghiệm
Ống nghiệm 1 (Quyết ựịnh) Ống nghiệm 2 (đối chứng) Ống nghiệm 3 (Mẫu thử) Bước 1 Dung mối 2 0,25ml Dung mối 2 0,25ml Dịch chiết (ở bước h) 0,25ml Bước 2 GT -1 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Lắc ựều,ựể yên 10 phút trên khay nước ấm
82 GT2+GT2.1= GT-2Ỗ Lắc ựều Bước 3 GT3+GT3.1= GT-3Ỗ Lắc ựều Bước 4 GT-2Ỗ 0,375 ml 0,25ml 0,25ml