3. NỘI DUNG, NGUYấN LIỆU
3.3.2.2. Phương phỏp kiểm tra vi sinh vật cú trong thịt
* Phương phỏp xỏc ủịnh tổng số vi khuẩn hiếu khớ trong mẫu thịt
Xỏc ủịnh tổng số vi khuẩn hiếu khớ (TCVN - 5667, 1992) [43]; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN – 4833 – 1ữ 2, 2002) [44].
- Nguyờn lý: trờn mụi trường thạch thường, ở ủiều kiện hiếu khớ, ở 370C, sau 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phỏt triển riờng rẽ là một ủiểm xuất phỏt của vi khuẩn. ðếm số khuẩn lạc trờn ủĩa thạch chớnh là số vi khuẩn chứa trong mẫu phõn tớch.
- Chuẩn bị mẫu: cõn 25g thịt (loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) cho vào tỳi P.E chuyờn dụng vụ trựng, bổ sung thờm 225 ml dung dịch ủệm peptone. ðồng nhất mẫu bằng mỏy Stomacher trong 1 phỳt. Hỗn dịch thu ủược cú tỷ lệ mẫu pha loóng 10-1, từ hỗn dịch này cú thể pha loóng 10-2, 10-3,…tuỳ theo mức ủộủỏnh giỏ ụ nhiễm ủể xỏc ủịnh mức pha loóng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………47
- Phương phỏp nuụi cấy: với một mẫu kiểm nghiệm phải nuụi cấy ớt nhất 3 ủậm ủộ, mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch riờng. Lấy 1 ml dung dịch ủồng nhất mẫu pha loóng ở những ủậm ủộ khỏc nhau chuyển vào ủĩa peptri. ðỗ vào mỗi ủĩa 12 – 15 ml mụi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hoà tan (ủó ủược hấp vụ khuẩn, ủể nguội khoảng 450C), trộn ủều bằng cỏch xoay nhẹ ủĩa 1 – 2 vũng theo chiều kim ủồng hồ và ngược lại. ðể ủĩa thạch ủụng tự nhiờn trờn mặt phẳng nằm ngang, sau ủú lật ngược ủĩa chuyển vào tủấm 370C, trong 24 giờủọc kết quả.
- Tớnh kết quả: ủếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trờn ủĩa thạch. ðể trỏnh nhầm lẫn cần ủưa ủĩa thạch lờn giỏ kớnh chia ụ ủể ủếm. Nếu vượt quỏ 300 khuẩn lạc /ủĩa Petri thỡ loại bỏ và mẫu cần ủược pha loóng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khớ trong 1g thịt ủược tớnh theo cụng thức sau:
∑C
N =
(W1 + 0.1W2) d Trong ủú:
N: Số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phõn giữa 1,0 – 9,0 nhõn với 10w (w là số mũ thớch hợp của 10).
C: Số khuẩn lạc ủếm ủược trờn cỏc ủĩa ủó chọn.
W1, W2: Sốủĩa ở 2 ủộ pha loóng liờn tiếp ủó chọn thứ nhất và thứ 2. d: Hệ số của ủậm ủộ pha loóng ủó chọn thứ nhất.
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli trong 1 gram thịt
Xỏc ủịnh vi khuẩn E.coli (TCVN - 5155, 1990) [39]; lấy mẫu (TCVN - 5153, 1990) [38].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………48
- Nguyờn lý: dựa vào ủặc ủiểm E.coli phỏt triển tốt ở ủiều kiện 420C trờn mụi trường CLP (Canh thang Lactose ủỏ Phenol) và khuẩn lạc E.coli cú màu ỏnh kim trờn mụi trường Endo.
- Phương phỏp nuụi cấy: mẫu pha loóng ở cỏc ủậm ủộ khỏc nhau: 10-1, 10-2, 10-3,…tuỳ theo dự ủoỏn mức ủộ ụ nhiễm. Mỗi ủậm ủộ pha loóng nuụi cấy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 5 ml mụi trường CLP, ủể tủ ấm 420C, 24 - 48 giờ.
- ðọc kết quả: sau 24 - 48 giờ, cỏc ống mụi trường chuyển từ màu hồng ủỏ sang màu vàng và sinh hơi trong ống Durham, từ cỏc ống CLP dương tớnh ria cấy chuyển sang mụi trường thạch Endo ủể tủ ấm 420C, 24 giờ, khuẩn lạc
E.coli cú màu ỏnh kim.
Dựng hệ thống phản ứng IMVIC ủểủịnh danh vi khuẩn:
+ Phản ứng ủỏ Methyl: dương tớnh (M+), mụi trường cú màu ủỏ. + Phản ứng Indol: (I+), mụi trường cú màu ủỏ.
+ Phản ứng Simmons – Citrat: õm tớnh (C-).
+ Phản ứng Voges-prokauer: õm tớnh (V-), khụng màu, hoặc màu vàng. Kết quả thu ủược tớnh theo cụng thức sau:
1 1
X (vk/g) = Số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng nuụi cấy mẫu thử
* Phương phỏp xỏc ủịnh vi khuẩn Salmonella cú trong 25 gram thịt
Xỏc ủịnh vi khuẩn Salmonella (TCVN - 5153, 1990) [38]; FAO (1992) [59]. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN - 4833 - 1ữ 2, 2002) [44].
- Nuụi cấy tăng sinh: Cõn 25g thịt (loại bỏ mỡ, gõn, bạc nhạc) nghiền nhuyễn trong cối sứ, sau ủú cho vào bỡnh tam giỏc vụ trựng cú chứa 225 ml mụi trường Selenit, ủể tủấm 370C, 24 giờ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………49
- Phõn lập trờn mụi trường chọn lọc: dựng que cấy vụ trựng, ria cấy canh trựng từ mụi trường tăng sinh sang mụi trường thạch Brilliant green và MacConkey, ủể tủ ấm 370C, 24 giờ. Cần cấy thưa ủể tạo ra cỏc khuẩn lạc riờng rẽ. Trờn mụi trường MacConkey những khuẩn lạc nghi ngờ là
Salmonella thường mọc thành những khuẩn lạc trũn, trong, khụng màu, nhẵn búng và hơi lồi ở giữa. Trờn mụi trường thạch Brilliant green những khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella cú màu hồng, nhỏ, trong trờn nền ủỏ sỏng.
- Kiểm tra ủặc tớnh sinh hoỏ của vi khuẩn Slamonella:
+ Nuụi cấy trờn mụi trường mụi trường tam sắt (TSI): lấy khuẩn lạc nghi ngờ trờn mụi trường chọn lọc cấy chuyển sang mụi trường TSI theo phương phỏp cấy trớch sõu, ủể tủ ấm 370C, 24 giờ, ủọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella mặt nghiờng ống mụi trường TSI cú màu ủỏ (nghĩa là khụng phõn giải lactose và sucrose); thõn và ủỏy cú màu vàng, cú bọt khớ và vết nứt (phõn giải glucose, sinh hơi); cú màu ủen (sinh H2S).
+ Nuụi cấy trờn mụi trường Lysin decarboxylase: phản ứng dương tớnh cú màu tớm, õm tớnh màu vàng.
+ Nuụi cấy trờn mụi trường urờ (Christensen): cấy trờn mặt nghiờng thạch, ủ 370C, 24 giờ. Salmonella cú phản ứng õm tớnh, mụi trường khụng chuyển màu (dương tớnh màu ủỏ).
+ Phản ứng Indol: nuụi cấy vi khuẩn vào mụi trường peptone, ủ 370C, 24 – 48 giờ, sau ủú nhỏ vào 1 ml thuốc thử, ủọc kết quả. Salmonella cú phản ứng õm tớnh, màu vàng nhạt; dương tớnh màu ủỏ.
+ Phản ứng VP ( Voges-Proskauer): cấy vi khuẩn vào mụi trường peptone glucose, ủ 370C, 48 giờ. Chuyển 1 ml canh trựng vào một ống nghiệm khỏc, bổ sung 0,6 ml dung dịch cồn Anpha naphtol và 0,2 ml Kalihydroxyt 40%, lắc và ủọc kết quả sau 5 – 15 phỳt. Salmonella cú phản ứng õm tớnh khụng màu hoặc vàng nhạt; dương tớnh màu ủỏ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………50
+ Phản ứng β - Galactosidase (O.N.P.G): nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25 ml nước muối ủẳng trương với khuẩn lạc, lắc ủều, ủ cỏch thuỷ 370C, 15 phỳt; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử lắc ủều, ủ cỏch thuỷ 370C, 24 giờ. Salmonella phản ứng õm tớnh khụng chuyển màu, dương tớnh màu vàng.
Chọn khuẩn lạc ủiển hỡnh cú thể giỏm ủịnh bằng phản ứng ngưng kết với khỏng nguyờn.
* Phương phỏp xỏc ủịnh và tớnh số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus cú trong 1 gram thịt
Xỏc ủịnh vi khuẩn Staphylococcus aureus (TCVN - 5156, 1990) [41]; lấy mẫu (TCVN - 5153, 1990) [38].
- Chuẩn bị mẫu: cõn 25g mẫu cho vào bỡnh hoỏ lỏng vụ trựng, thờm 225 ml dung dịch pha loóng pepton, trộn ủều trong 1 - 2 phỳt ở tốc ủộ 10.000 - 12.000 vũng/ phỳt. Sử dụng dung dịch pha loóng liờn tục từ 10-6 - 10-7 bằng cỏch di chuyển liờn tục 10 ml của dung dịch pha loóng trước vào bỡnh chứa 90 ml pepton.
- Phương phỏp nuụi cấy: lấy 1 ml dung dịch pha loóng ở mỗi ủậm ủộ cần kiểm tra cho vào trung tõm ủĩa thạch Baird parker ủó ủược hong khụ, xoay và nghiờng ủều về cỏc phớa ủể dung dịch ủều trờn mặt thạch, lật ỳp ủĩa thạch, ủể vào tủấm 370C ± 10C, trong 24 - 48 giờ.. Mỗi ủậm ủộ cấy vào 2 ủĩa thạch.
Sau ủú lựa chọn cỏc ủĩa thạch cú từ 30 – 300 khuẩn lạc màu ủen, lồi, trũn, bờ ủều, bang, cú vũng trong suốt ở xung quanh. Sử dụng mỏy ủếm khuẩn lạc ủểủếm số khuẩn lạc nghi ngờ.
- Giỏm ủịnh Staphylococcus aureus bằng cỏch thực hiện cỏc phộp thử kiểm tra ủặc tớnh làm ủụng huyết tương của vi khuẩn.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………51
+ Phản ứng ủụng vún trờn phiến kớnh: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lờn phiến kớnh, dựng que cấy lấy vi khuẩn vừa ủủ trộn thành huyễn dịch ủục ủều, nhỏ tiếp 1 giọt huyết tương vào (thớ nghiệm ủối chứng 1 giọt nước muối sinh lý, 1 giọt huyết tương), sau ủú ủọc kết quả quan sỏt khả năng ủụng huyết tương trờn phiến kớnh bằng kớnh hiển vi.
+ Phản ứng ủụng vún trong ống nghiệm: chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi ngờ Staphylococcus aureus nuụi cấy trong mụi trường BHI, ủể tủ ấm 35 – 370C, trong 20 – 24 giờ. Sau ủú lấy canh trựng cho vào huyết tương theo tỷ lệ 1:3 (0,1 ml canh trựng với 0,3 ml huyết tương thỏ), ủể tủ ấm 370C trong 2, 4, 6, 8 - 24 giờ và ủọc kết quả. Nuụi cấy trờn mụi trường thạch Chapman, khuẩn lạc Staphylococcus aureus trũn, hơi ủục, mặt nhẵn, viền mộp gọn, màu vàng.
Kết quả thu ủược tớnh theo cụng thức sau:
1 1
X (vk/g) = Số khuẩn lạc ủếm ủược x x
Khối lượng mẫu Bội số pha loóng nuụi cấy mẫu thử
ðỏnh giỏ kết quả theo Sperber và Tantini
Huyết tương ủụng cứng sau 4 – 6 giờ
khú di ủộng 4 (+)
Xỏc ủịnh là
Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng chắc sau 6 giờ dễ di
ủộng 3 (+)
Khụng ủược xem là
Staphylococcus aureus
Huyết tương ủụng thành cục nhỏ sau
24 giờ 2 (+) Khụng ủược xem là Staphylococcus aureus Huyết tương ủụng thành cục nhỏ khụng liờn kết thành khối 1 (+) Khụng ủược xem là Staphylococcus aureus
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………52