Luận văn nghiên cứu sự phân bố của e coli gây bệnh tiêu chảy theo kiểu gene ở lợn con sau cai sữa tại một số tỉnh phía bắc

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------------- NGUYỄN THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA E.COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY THEO KIỂU GENE Ở LỢN CON SAU CAI SỮA TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS NGUYỄN VIẾT KHÔNG HÀ NỘI, 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN ơ - Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Tác giả Nguyễn Thị Mỹ Hạnh Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Nhân dịp này cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Viết Không đã cung cấp những kiến thức chuyên môn bổ ích và dẫn dắt tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và viết luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ, nhân viên – Bộ môn Hóa sinh, Miễn dịch, Bệnh lý, Viện Thú y đã tạo điều kiện, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Bộ môn Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã dạy dỗ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, các cán bộ viên chức thuộc Trung tâm kiểm tra Vệ sinh thú y trung ương I đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành quá trình nghiên cứu và viết luận văn của mình. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Mỹ Hạnh Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU A/E Attaching-and-Effacing cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate cGMP Cyclic Guanosine monophosphate CT Cholerae toxin DAEC Diffusely adherent Escherichia coli E.coli Escherichia coli EAggEC hay EAEC Enteroaggregative E.coli EAST1 Enteroaggregative E.coli STI-Like Toxin EHEC Enterohemorrhagic E.coli EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli HUS Hemolytic uremic syndrome LT Heat-labile toxin PCR Polymerase chain reaction ST Heat-stable toxin STEC Shiga toxin-producing Escherichia coli STx Shiga-like toxin VT Vero toxin Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục các từ viết tắt iii Mục lục iv Danh mục bảng vii Danh mục hình viii ðẶT VẤN ðỀ .1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Tình hình nghiên cứu về E.coli gây tiêu chảy ở lợn con 2 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 2 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .3 1.2. Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) 3 1.2.1. Đặc điểm hình thái .3 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy .4 1.2.3. Đặc tính sinh hóa 4 1.2.4. Sức đề kháng 5 1.2.5. Các kháng nguyên 6 1.2.6. Các yếu tố gây bệnh chung của vi khuẩn E.coli 7 1.2.7. Phân loại E.coli 10 1.3. Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa 19 1.3.1. Nguyên nhân gây bệnh .19 1.3.2. Cơ chế sinh bệnh 19 1.3.3. Triệu chứng 21 1.3.4. Bệnh tích 21 1.3.5. Chẩn đoán .22 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… v 2. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP .23 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu .23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 23 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .23 2.3. Vật liệu nghiên cứu .24 2.3.1. Mẫu bệnh phẩm 24 2.3.2. Môi trường, hoá chất, sinh phẩm .24 2.3.3. Máy móc, trang thiết bị 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu .25 2.4.1. Phương pháp thu thập mẫu 25 2.4.2. Phân lập vi khuẩn .25 2.4.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học .26 2.4.4. Phương pháp PCR – xác định đặc tính gene học .27 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 29 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 3.1. Tình hình tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh nghiên cứu 30 3.1.1. Tình hình lợn con tiêu chảy .30 3.1.2. Tình hình lợn con cai sữa mắc tiêu chảy 33 3.2. Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy 35 3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy 35 3.2.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của E.coli phân lập 37 3.3. Kết quả nghiên cứu xác định gene mã hóa một số yếu tố độc lực 39 3.3.1. Kết quả xác định một số gen mã hóa yếu tố độc lực .39 3.3.2. Tần số xuất hiện gene mã hóa cho từng yếu tố độc lực .41 3.3.3. Kết quả xác định tổ hợp kiểu gene của các chủng E.coli 45 3.3.4. Sự phân bố của E.coli theo kiểu gene gây tiêu chảy 48 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vi 4. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 52 4.1. Kết luận .52 4.2. Đề nghị 53 4.3. Phụ lục 01. Tình hình tiêu chảy trên đàn lợn tại Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình từ 2006 đến 2010 64 4.4. Phụ lục 02. Tình hình tiêu chảy trên đàn lợn sau cai sữa tại Bắc Ninh, Bắc Giang, Ninh Bình từ 2006 đến 2010 .65 . Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa chung của E.coli [20] 5 Bảng 2.1. Trình tự nucleotid các cặp mồi sử dụng trong PCR 28 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của PCR 29 Bảng 3.1. Tổng hợp tình hình lợn con tiêu chảy và chết do tiêu chảy . 30 Bảng 3.2. Tình hình hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa .33 Bảng 3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân lợn sau cai sữa bị tiêu chảy . 36 Bảng 3.4. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của các chủng E.coli phân lập 38 Bảng 3.5. Tỷ lệ E.coli mang gene mã hóa cho các yếu tố độc lực 40 Bảng 3.6. Tần số xuất hiện gene mã hóa các yếu tố độc lực riêng rẽ 42 Bảng 3.7. Kết quả xác định sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Bắc Ninh 46 Bảng 3.8. Kết quả xác định sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Bắc Giang .47 Bảng 3.9: Kết quả xác định sự liên kết gene trong các chủng E.coli phân lập tại Ninh Bình .48 Bảng 3.10. Sự phân bố của E.coli gây tiêu chảy ở lợn con theo kiểu gene .49 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ phân lập E.coli 25 Hình 3.1. Biến động tỷ lệ lợn con tiêu chảy từ 2006 đến 2010 31 Hình 3.2. Biến động tỷ lệ tiêu chảy ở lợn sau cai sữa từ 2006 đến 2010 .34 Hình 3.3. Tần số kiểu gene theo nhóm (trái) và tần số 9 kiểu gene gây tiêu chảy (phải) 50 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… 1 ðẶT VẤN ðỀ Chăn nuôi lợn là nghề truyền thống lâu đời ở nước ta. Tính đến tháng 10 năm 2010, tổng đàn lợn cả nước có 27,37 triệu con. Hình thức chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ, phân tán là phổ biến chiếm 81,4% số lợn được nuôi; các hình thức chăn nuôi tập trung đã hình thành và đang trên đà phát triển, hiện cả nước có khoảng 8.500 trang trại chăn nuôi lợn quy mô bán công nghiệp và công nghiệp. Song hành với sự phát triển của chăn nuôi lợn luôn luôn là vấn đề dịch bệnh. Dịch bệnh gây chết lợn, giảm thiểu sự tăng trọng và là trở ngại lớn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi. Trong số những dịch bệnh phổ biến, hội chứng tiêu chảy ở lợn con nói chung và lợn sau cai sữa nói riêng thực sự là vấn đề tồn tại lâu dài và dai dẳng ở tất cả mọi hình thức chăn nuôi. Tiêu chảy ở lợn con là một hội chứng đa nguyên nhân. Trong số các nguyên nhân vi sinh vật, E.coli là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở lợn con giai đoạn sau cai sữa. E.coli gây tiêu chảy dựa vào hai yếu tố độc lực chính: yếu tố bám dính và độc tố đường ruột. Xét về bản chất sinh hóa, các yếu tố độc lực này là những protein do các gene mã hóa tương ứng quyết định. Nghiên cứu về kiểu gene của E.coli gây tiêu chảy và sự phân bố của chúng sẽ cung cấp thông tin căn bệnh đặc thù cho từng khu vực. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự phân bố của E.coli gây bệnh tiêu chảy theo kiểu gene ở lợn con sau cai sữa tại một số tỉnh phía Bắc” nhằm phát hiện các tổ hợp gene mã hóa cho các yếu tố độc lực chính ở đối tượng E.coli phân lập từ lợn con sau cai sữa, bước đầu nhận định về sự phân bố của căn bệnh tại địa bàn của ba tỉnh miền Bắc. Mục ñích của ñề tài: Xác định được các tổ hợp gene quyết định yếu tố bám dính và độc tố đường ruột của các chủng E.coli phân lập từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy tại ba địa phương khác nhau. . Escherichia coli E. coli Escherichia coli EAggEC hay EAEC Enteroaggregative E. coli EAST1 Enteroaggregative E. coli STI-Like Toxin EHEC Enterohemorrhagic E. coli EIEC. NGUYỄN THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY THEO KIỂU GENE Ở LỢN CON SAU CAI SỮA TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG