Sử dụng chỉ thị ssr để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan sớ liê ̣u và kết trình bày luận văn trung thực, đồng ý cán hướng dẫn và chưa công bố bấ t kỳ cơng trình nào Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Hoàng Thị Trang iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt q trình tơi tiến hành nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà tạo điều kiện giúp đỡ tơi hoàn thành thí nghiệm Tơi xin cảm ơn ThS Hồng Phú Hiệp thầy, Bộ mơn Di truyền Sinh học đại, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho tơi q trình tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cán khoa Khoa học sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tận tình dạy dỗ, bảo truyền cho niềm đam mê nghiên cứu khoa học Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp nhiệt tình động viên cho tơi thêm động lực hồn thành tốt trình học tập nghiên cứu khoa học Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Trang iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh đậu tương 1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.2.1 Bệnh gỉ sắt đậu tương 1.2.2 Tính chống chịu bệnh gỉ sắt đậu tương 11 1.2.3 Tình hình nghiên cứu bênh ̣ gỉ sắ t và tính kháng bênh ̣ gỉ sắ t đậu tương 12 1.3 MỘT SỐ CHỈ THI ̣ SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 15 1.3.1 Chỉ thị hình thái 15 1.3.2 Chỉ thi ho ̣ ́ a sinh 16 v 1.3.3.Chỉ thị phân tử 17 1.3.4 Bản đồ QTL 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Vật liệu 23 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị địa điểm nghiên cứu 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu tách chiết DNA tổng số 25 2.2.2 Tuyển chọn tổng hợp cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 26 2.2.3 Phản ứng PCR-SSR 27 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 28 2.2.5 Phương pháp phân tích xử lý liệu PCR-SSR 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 29 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương 29 3.1.2 Kết nhân bản các phân đoa ̣n DNA phản ứng PCR- SSR 30 3.2 PHÂN TÍCH TÍ NH ĐA DẠNG TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮ T KHÁC NHAU 36 3.3 THẢO LUẬN CHUNG 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI 44 ̣ Kết luận 44 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều ABC ATP - binding cassette AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa dạng chiều dài phân đoạn nhân ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic acid S-methyl ester AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan AUDPC Area Under Disease Progress Curve Bp Base pair cs Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lương giới ISSR Inter - Simple Sequence Repeat kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection – Chỉ thị phân tử PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi tr ùng hợp polymerase QTL Quantitative Trait Loci - Bản đồ locus kiểm sốt tính trạng số lượng RAPD Random Amplified Polymorphism DNA - DNA đa hình nhân ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế vii SDS Sodium Đoecyl Sulphat SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản STSs Sequence Tagged Site TAE Tris – Acetate – EDTA Tris Trioxymetylaminometan XK Xuất USDA United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ UPGMA Phương pháp phân nhóm viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích thu hoạch đậu tương số nước giới Bảng 1.2 Sản lượng sản xuất đậu tương số quốc gia giới Bảng 1.3 Năng suất đậu tương số nước giới Bảng 1.4 Diện tích, suất, tổng sản lượng đậu tương nước ta năm 2011, 2012, 2013 dự báo năm 2014 -2015 Bảng 2.1 Ký hiệu, xuất xứ đặc điểm giống đậu tương nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi SSR sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-SSR 28 Bảng 3.1 Số phân đoạn DNA nhân phản ứng PCR-SRR từ cặp mồi SSR 35 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân đoạn đa hình sử dụng cặp mồi SSR 36 Bảng 3.3 Hê ̣ số khác giữa các giố ng đâ ̣u tương dựa các dữ liê ̣u phân tích SSR (%) 37 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Diện tích trồng sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) …8 Hình 1.2 Lá đâ ̣u tương nhiễm bênh ̣ gỉ sắt 11 Hình 3.1 Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ mầm đậu tương của 12 giống đậu tương nghiên cứu 29 Hình 3.2 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR với cặp mồi Satt009F/Satt009-R 30 Hình 3.3 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR với cặp mồi Sat_640 –F /Sat_640-R 31 Hình 3.4 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR với cặp mồi Sct_187-F /Sct187-R 32 Hình 3.5 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R 33 Hình 3.6 Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR với cặp mồi Satt460-F /Satt460-R 34 Hình 3.7 Sơ đồ hin ̀ h về mố i quan ̣ di truyề n của 12 giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt dựa dữ liê ̣u phân tích SSR 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid vitamin cần thiết cho thể Các sản phầm từ đậu tương sử dụng rộng rãi cho mục đích khác làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, đậu tương cịn có khả cố định đạm nhờ vi khuẩn R japonicum sống cộng sinh rễ tạo thành nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu Do đó, đậu tương quan tâm trồng phát triển mạnh nhiều quốc gia giới Ở Việt Nam, đậu tương nhóm trồng ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô lạc Việt Nam nước xuất đậu tương vào năm 1980, nhiên nước ta trở thành nước nhập đậu tương với số lượng lớn với hàng triệu khô dầu đậu tương nhập hàng năm Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm suất thấp sản lượng đạt không ổn định, khả chống chịu bệnh stress Sâu bệnh nói chung bệnh gỉ sắt nói riêng nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng làm giảm suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn kinh tế Bệnh gỉ sắt đậu tương loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây coi mối đe dọa đậu tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% suất chất lượng đậu tương nhiều nước giới có Việt Nam 36 Bảng 3.2 Số phân đoạn và kic ́ h thước các phân đoạn DNA được nhân bản từ các giố ng đâ ̣u tương sử dụng cặp mồi SSR Số phân đoạn Chỉ thị SSR DNA nhân Kích thước 180 bp: NR1 Satt009 190bp: DT96, DT2000, DV14 200bp: DT8, DT12 210bp: NR2 Sat_064 100bp: DT22, DT26, DT51, DT84 110bp: DT96, DT2000, NR1, NR2 140bp: DT4, DT8, DT12, DT22 Sct_187 10 150bp: DT26, DT51, DT96 170bp: DT2000, DVN14, NR1 200bp: DT4, DT8 Satt431 210bp: DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14 Satt460 100bp: DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1 3.2 PHÂN TÍCH TÍ NH ĐA DẠNG TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.0 phân tích tính đa dạng 12 giống đậu tương có khả kháng bênh ̣ gỉ sắ t khác dựa kết 37 phân tích SSR với chỉ thi ̣đã lựa cho ̣n, kết xác định hệ số sai khác di truyề n cặp giống đậu tương nghiên cứu đươ ̣c triǹ h bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3 Hê ̣ số khác giữa các giố ng đâ ̣u tương dựa các dữ liê ̣u phân tic ́ h SSR (%) DT4 DT8 DT12 DT22 DT26 DT51 DT84 DT96 DT4 0,00 DT8 0,00 0,00 DT12 8,96 8,96 0,00 DT22 1,43 1,43 1,04 0,00 DT26 5,49 5,49 3,47 2,88 0,00 DT51 4,05 4,05 8,96 1,44 1,44 0,00 DT84 8,96 8,96 0,00 3,47 3,47 2,03 0,00 DT96 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 DT DVN 2000 14 DT2000 2,55 2,55 4,58 1,12 1,12 2,55 4,58 0,00 0,00 DVN14 1,44 1,44 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 0,00 NR1 NR2 NR1 5,49 5,49 3,47 2,89 2,89 5,49 1,04 1,12 1,12 2,89 0,00 NR2 8,96 8,96 0,00 3,47 1,04 8,96 6,93 4,58 4,58 1,04 3,47 0,00 Kết bảng 3.3 cho thấy hệ số sai khác di truyền 12 giống đậu tương giao động khoảng 0% đến 8,96% Trong có mơ ̣t cặp giống có hệ số sai khác di truyền nhỏ cặp DT4 DT8 với hệ số sai khác 0% Các cặp có hệ số di truyền cao DT4 DT12, DT8 DT12, DT51 DT12, DT4 DT84, DT8 DT84, NR2 DT4, NR2 DT8, NR2 38 DT51, hệ số sai khác di truyền 8,96% Từ kết phân tích dữ liêụ SSR với chỉ thi ̣sơ đồ hình thiết lập biểu thị mố i quan hệ di truyền 12 giống đậu tương khác về khả kháng bê ̣nh gỉ sắ t (Hình 3.7) Nhóm phụ Nhóm Nhánh phụ Nhóm phụ thứ hai Nhánh thứ hai Nhóm Nhánh phụ thứ Nhánh thứ Hin ̀ h 3.7 Sơ đồ hin ̀ h về mố i quan ̣ di truyề n 12 giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt dựa dữa liê ̣u phân tích SSR Phân tích sơ đồ hình hình 3.7 cho thấy 12 giống đậu tương nghiên cứu chia thành hai nhánh chính, nhánh thứ chỉ có giống nhiễm bệnh ĐT12, còn nhánh chính thứ hai gồ m 11 giố ng còn la ̣i, bao gồm giống kháng bệnh giống trung gian giống nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắt Hai nhánh có khoảng cách di truyền hai nhánh 60% (1-0,40) 39 Nhánh thứ hai chia làm hai nhánh phụ, nhánh phụ thứ chỉ có giống đậu tương NR2 có khoảng cách di truyền so với nhánh phu ̣ còn la ̣i 58% Nhánh phụ thứ hai chia làm hai nhóm với khoảng cách di truyền giữa chúng 52% Nhóm gồm ba giớ ng DT84, DT51, DT26 , nhóm chia làm hai nhóm phụ với khoảng cách di truyền 36% Nhóm phụ gồm giống NR1, DVN14, DT2000, DT96 và nhóm phụ gồm giống DT4, DT8, ĐT22 Trên sơ đồ hình còn nhâ ̣n thấ y ở nhóm phu ̣ 1, hai giố ng ĐT96 và DT2000 đề u kháng bê ̣nh gỉ sắt mức độ tốt có ̣ số tương đồ ng là 100%, ở nhóm phu ̣ 2, giống ĐT4 và ĐT8 kháng bệnh gỉ sắ t ở mức trung bình có ̣ số tương đờ ng 100%, Sơ đồ hình 3.7 cho thấy giống đậu tương khác mặt di truyền phân bố theo khả kháng bệnh gỉ sắt Như vậy, giống thị phân tử khác, kỹ thuật SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giống đậu tương tham gia thí nghiệm, điều có ý nghĩa kinh tế việc chọn tạo giống trồng Như vâ ̣y, cả cặp mồi SSR sử dụng phân tích ̣ gen của 12 giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt biểu tính đa hình Số giớ ng đâ ̣u tương có phân đoạn DNA nhân từ các cặp mồi SSR dao động từ đến 10 Trong cặp mồi có cặp mồi cho tính đa hình cao với hệ số đa dạng di truyền cao Phân tích đa dạng di truyền sơ đồ hình cho thấy khoảng cách di truyền hai nhánh 60% Những thông tin sở cho việc tuyển chọn giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời sở cho việc lựa chọn cặp bố mẹ khác xa mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống 40 Để khẳng định cách chắn nhận định cần tiến hành số nghiên cứu lây nhiễm nhân tạo, thực phép lai cá thể bố mẹ thuộc giống/dịng khác phân tích theo dõi mức độ phân ly phân đoạn DNA đặc trưng hệ để đánh giá mức độ liên kết thị với tính kháng bệnh gỉ sắt nấm Phakopsora pachyrhizi gây 3.3 THẢO LUẬN CHUNG Bệnh gỉ sắt đậu tương bệnh hại đậu đỗ gây thiệt hại suất trồng khó phịng trừ tận gốc nguồn bệnh Bệnh gây ảnh hưởng đến cây, giảm hoạt động quang hợp thực vật, gây rụng lá, chết sớm, suất Mầm bệnh xuất trồng tiêu biến đậu tương chết nông dân thu hoạch đậu tương Loại bệnh xuất Mỹ vào năm 2004, chủ yếu bang miền nam Phun thuốc diệt nấm cách để kiểm sốt bệnh nhà khoa học chưa lai tạo giống đậu tương kháng bệnh Các bào tử gây bệnh gỉ sắt đậu tương Châu Á gây mối đe dọa nghiêm trọng đến ngành sản xuất đậu tương Mỹ mầm bệnh lây lan qua gió từ khoảng cách xa Các nhà nghiên cứu trường Đại học Illinois tìm phương pháp giúp xác định xuất bào tử môi trường Các nước giới Việt Nam có nhều cơng trình nghiên cứu bệnh gỉ sắt đậu tương [1], [4], [7], [18], [37], [38], [41], [43] Trong nghiên cứu Vũ Thanh Trà cộng (2006), mười giống đậu tương bao gồm giống nhập nội DT2000 (có khả kháng bệnh gỉ sắt), DT12, VX92 VX93 (có suất cao), giống địa phương Cúc Vàng, Vàng Mường Khương CBU8325 (có khả chịu sâu, nấm chịu hạn tốt) 41 giống tạo từ phương pháp đột biến DT84, DT95, M103 DT96, lai DT84 DT90 (có khả kháng bệnh gỉ sắt) đánh giá khả kháng bệnh gỉ sắt dựa số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp phân tích phản ứng bệnh, khả tạo bào tử tạo quầng [17] Hiện chưa tìm cách hay thuốc bảo vệ thực vật đặc dụng để trừ bệnh gỉ sắt đậu tương, người dân trồng đậu tương chọn biện pháp phòng trừ trước trồng sau thu hoạch hạt nhằm hạn chế thiện hại thấp bệnh gỉ sắt gây Các biện pháp phòng trừ chủ yếu như: Chọn giống chịu bệnh, chống bệnh sản xuất giống bệnh để sử dụng sản xuất, chọn thời vụ trồng; Luân canh với lúa nước hay hòa thảo; Xử lý giống Bayphidan 10 - 100g a.i./1 hạt giống; Có thể phun thuốc hạn chế bệnh loại thuốc trừ gỉ sắt đặc biệt như: Bayleton 250 g a.i./ha; Baycor 125 - 375 g a.i./ha; phun nước lưu huỳnh vôi 0,3 – 10 Bômê Bằng phát triển mạnh khoa học kỹ thuật có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh gỉ sắt gen kháng bệnh gỉ sắt công bố vào năm gần đây, để xác định gen kháng bệnh gỉ sắt giống đậu tương Mỹ Brazil, sử dụng phương pháp lập đồ liên kết thị phân tử (map-based cloning) nhà khoa học phát có sáu gen liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt đậu tương bao gồm: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 số thị SSR liên kết gần với gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộc nhóm liên kết G NST số 18; Rpp3 thuộc nhóm liên kết C2 NST số 6; Rpp3 thuộc nhóm J NST số 16 Rpp5 thuộc nhóm N NST số [4], [14], [15], [17], [21], [26], [31], [40] Hiện nay, có nhiều nghiên cứu bệnh gỉ sắt sử dụng phương 42 pháp sinh ho ̣c hiêṇ đa ̣i thiế t lâ ̣p thị phân tử RFLP, RAPD, AFLP, SSR….cho kết cao, không tốn thời mà lượng mẫu khơng địi hỏi nhiều, lúc phân tích nhiều mẫu Chỉ thị SSR sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn giống hay lập đồ liên kết gen, SSR áp dụng đối tượng động vật thực vật có độ đa hình cao xác Những năm gần có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh gi sắt đã sử du ̣n chi thị phân tử SSR hay RAPD đâ ̣u đỗ Việt Nam Ứng dụng kỹ thuật này, Vũ Thanh Trà Trần Thị Phương Liên (2006) phân tích tính đa dạng di truyền số giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt, nhằm cung cấp thông tin di truyền, góp phần lưu giữ trì nguồn gen số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc các giống trồng đại trà Việt Nam [8], [13], [12], [14], [15], [17], [18] Hạt đậu tương chứa hàm lượng protien cao, có nhiều nghiên cứu liên quan tới hệ protien đậu tương, nhiều protein phát có khả chống chịu hạn, stress, kháng phòng vệ, chữa bệnh…Vũ Thanh Trà (2012) thiết lập đồ đồ điện di 2-DE hệ protein đậu tương giống DT2000 kháng bệnh gỉ sắt với 119 điểm protein gel, có 35 protein định danh phân loại theo nhóm chức Đặc biệt phát có protein liên quan đến khả kháng bệnh/phòng vệ, chống stress, chịu hạn [17], [20], [24] Qua kết nghiên cứu thu được, sơ đờ hiǹ h (Hình 3.7) cho thấ y ở nhóm phu ̣ hai giố ng ĐT96 và DT2000 đề u kháng bênh ̣ gỉ sắt mức độ tốt có ̣ số tương đồ ng là 100%, ở nhóm phu ̣ giố ng ĐT4 và ĐT8 đề u kháng bê ̣nh gỉ sắ t ở mức trung bình có ̣ số tương đồ ng là 100% Kết 43 cũng đã đươ ̣c thông báo nghiên cứu Vũ Thanh Trà (2012) giống đậu tương DT2000 Ngoài đã bổ sung thêm giống DT4 và DT8, DT22 có mức kháng gỉ sắ t ở mức trung bình vào phân tích, đờ ng thời phát giống NR1 giống địa phương cung cấp Trung tâm giống trờ ng Na Rì-Bắc Kạn kháng bệnh gỉ sắt ở mức cần nghiên cứu phát triển bổ sung vào bô ̣ giố ng đâ ̣u tương kháng bênh ̣ gỉ sắ t Nhìn chung, việc phát triển giống đậu tương mang tính kháng bệnh gỉ sắt nước ta chậm chủ yếu dựa vào phương pháp chọn tạo truyền thống nhiều thời gian Việc áp dụng kỹ thuật đại chọn tạo nhờ dấu chuẩn phân tử MAS giới hạn nghiên cứu bước đầu Do đó, cần đẩy mạnh tiến hành nghiên cứu sâu toàn diện nhằm phát triển giống đậu tương có suất cao có khả kháng bệnh gỉ sắt để đáp ứng cầu ngày cao sản xuất công nghiệp làm thực phẩm cho người, lấy dầu làm thức ăn cho chăn nuôi 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ Kết luận 1.1 Kết nhân phân đoạn DNA phản ứng PCR-SSR với cặp mồi thu 40 phân đoạn từ hệ gen 12 giống đậu tương khác về khả kháng bệnh gỉ sắt Tấ t cả thị SSR (Satt009, Sat_640, Sct187, Satt431, Satt460) đề u biể u hiê ̣n tính đa hình 1.2 Sơ đồ hình thể hiêṇ mố i quan ̣ di truyề n của các giống đậu tương khác về khả kháng bênh ̣ gỉ sắ t đươ ̣c thiế t lâ ̣p dựa kế t quả phân tích SSR Khoảng cách di truyền giữa giố ng ĐT12 các giống đâ ̣u tương còn la ̣i là 60% Các giố ng đâ ̣u tương nghiên cứu phân bố nhóm thuô ̣c hai nhánh chính Hai giống DT2000 DT96 kháng bệnh gỉ sắt tốt phân bố mô ̣t nhóm có hệ số tương đồng di truyề n là 100%, hai giớ ng ĐT4 và ĐT8 thuộc nhóm kháng bệnh gỉ sắt trung bình phân bố cùng mô ̣t nhóm có hệ số tương đồng di truyề n là 100% Đề nghị 2.1 Tiế p tu ̣c nghiên cứu xác đinh ̣ chỉ thi ̣ SSR liên kế t với gen liên quan đế n tiń h kháng bệnh gỉ sắ t ở đâ ̣u tương bằ ng kỹ thuâ ̣t phân tử kế t hơ ̣p với lai giớ ng 2.2 Có thể sử dụng giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt phu ̣c vu ̣ sản xuất làm nguyên liệu lai tạo giống 2.3 Có thể sử dụng thơng tin đa dạng di truyền mức DNA làm sở cho việc lai tạo giống, nhiên cần mở rộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật SSR với số lượng mồi giống nghiên cứu nhiều 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiế ng Viêṭ Nguyễn Thị Bình (1990) Nghiên cứu đánh giá khả chống chịu bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi sydow) tập đoàn đậu tương Miền Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T, Bùi Chí Bửu Bùi Bá Bổng (2001), “Chọn giống nhờ Marker Phân tích QTL”, Viện lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long, tr 44 – 58 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương Nxb Nơng Nghiệp Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), “Đánh giá đa dạng di truyền mức độ phân tử số giống đậu tương (Glycine max (L) Merrill) địa phương”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên Nguyễn Đăng Khôi (1997), "Các đậu ăn hạt Việt Nam", Tạp chí Sinh học,19:5-10 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội Chu Hồng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội Chu Hồng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng Nxb Đại học Thái Nguyên Đinh Thị Ngọc (2008), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn số giống đậu tương địa phương trồng vùng Tây Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 46 10 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vignaradiata (L) Wilczek) Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 11 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên 12 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Nguyễn Văn Thắng, Trần Văn Dương (2003),“Đánh giá tính đa dạng số giống lạc tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt kỹ thuật RAPD” Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, tr 805-809 13 Nguyễn Đức Thuận Nguyễn Thị Lang (2006) “Đánh giá đa dạng di truyền đậu tương phương pháp RAPD marker phân tử”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ tháng 3/2006: 65-68, 87 14 Vũ Thanh Trà Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ tháng 11/2006: 3032, 43 15 Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên Vũ Hoài Thu (2006), “Đánh giá chất lượng hạt số giống đậu tương Việt Nam có khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ tháng 10/2006: 33-37 16 Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài, Nguyễn Thúy Điệp, Trần Thị Thúy (2010) “Nghiên cứu xác định thị chép có trình tự đơn giản (Marker SSR) nhận dạng số giống lúa Nếp, lúa Nương địa Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triể n nông thôn, số 153, tr 15-21 47 17 Vũ Thanh Trà (2012), Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương có khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Sư Phạm-ĐHTN 18 Lê Thị Ngọc Vi Nguyễn Thị Lang (2006) “Nghiên cứu gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương phương pháp phân tử microsatellite”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 9/2006: 36-39 19 Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh (2008), "Đánh giá đa hình DNA số giống khoai tây (Solanumtuberosum L.) kỹ thuật RAPD", Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, số tháng 1/ 2008: 20 -25 Tiế ng Anh 20 Akkaya M S., Bhagwat A A., & Cregan P B (1992), “Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean”, Genetic 132:1131-1139 21 Abe J., Xu H., Suzuki Y., Kanazawa A , & Shimamoto Y (2003), “Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs”, Theor Appl Gener 106: 445-453 22 Brown-Guedira, J.A Thompsonb, R.L Nelsoncand M.L Warburton (2000), “Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American Ancestors Using RAPD and SSR Markers”, Crop Science 40:815823 23 Bates L S (1973), “Rapid determinatin of tree protein for water-stress studies”, Plant and Soil, 39, pp 205-207 24 Chen T.H., Murant N (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant dehydrin proteins”, Physiol Plant, pp 795-803 48 25 Cregan P B., Javik T., Bush A L., Shoemaker R C., Lark K G., Kahler A L., Kaya N., Van Toai T T., Lohnes D G., Chung J.,&Specht J E (1999), “An integrated genetic linkage map of the soybean genome”, Crop Sci.39: 1464-1490 26 Hartman GL, Wang TC & Tschanz AT (1991) “Soybean rust development and the quantitative relationship between rust severity and soybean yield”, Plant Dis 75:596-600 27 Kashi, Y and D G King (2006) “Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolutio”, TRENDS in Genetic 22 (5), 253259 28 Litt M., & Luty J A.(1989), “A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiae muscle actin gene”, Am J.Hum Genet.44(3): 397 -401 29 Lawson, M J and L Zhang (2006), “Distinct pattern of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genome”, Genome Biology (2): R14 30 Morgante, M., M Hanafey, W Powell (2002) “Microsatellites are preferentially asscociated with non repetitive DNA in plant genomes”, Nature Genetic 30, 194-200 31 McCouch, S R., L Teytelman, Y Xu, K B Lobos(2002) “Development and mapping of 2240 new SSR maker for rice (Oryzae sativa L.)”, DNA Research 9, 199-207 32 Nuntapunt M, Surin P & Achavasmit P (1984), “Evaluation of rate-reducing rust resistance and tolerance in advanced soybean lines”, Journal of Agriculture Research and Extension (Thailand) 2:15-19 49 33 Garcia A., Calvo E S., Kiihl R A S., Harada A., Hiromoto D , & Vieira L G (2008), “Molecular Mapping of Soybean Rust (Phakopsora pachyrhizi) Resistance Genes: Discovery of a Novel Locus and Alleles”, Biomedical and Life Sciences 117(4): 545- 553 34 Perez, M A, F.J.Gallego, I.Martinez, P Hidalgo (2001) “Detection, distribution and selection ofmicrosatellites (SSRs) in the genome of yeast Saccharomyces cerevisiae as molecular markers”, mApplied microbiology 33, 461-466 35 Tschanz AT & Tsai BY (1982) “Effect of maturity on soybean rust development”, Soybean Rust Newsl 5:38-4 36 Tschanz AT & Tsai MC (1983) “Evidence of tolerance to soybean rust in soy beans”, Soybean Rust Newsl 6:28-31 37 Tschanz AT & Wang TC (1980) “Soybean rust development and apparent infection rates at five locations in Taiwan”, Prot Ecol 2:247-250 38 Tschanz AT, Wang TC, Cheng YH, Montha N & Chen CM (1985) “International screening trials for soybean rust tolerance”, Soybean Rust Newsl 7:22-25 104 39 Sholihin, & Hautea D M (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(1-2): 17-61 40 Silva D C G, Yamanaka N., Brogin R L., Arias C A A., Nepomuceno A L., Mauro A D., Pereira S S., Nogueira L M., Passianotto A L L., & Abdelnoor R V (2008), “Molecula mapping of two loci that confer resistance to Asian rust in soybean.Theor”, Appl Genet 117:57-63 50 41 Verma D P S., & Shoemaker R C (1996), “Soybean, genetics, molecular biology and biotechnology”, Cab International, pp 37-40 42 Welsh J., & McClelland M (1990), “Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers”, Nucleic Acids Res 18: 7213-7218 43 Wang K J., & Takahata Y (2007), “A preliminary comparative evaluation of genetic diversity between Chinese and Japanese wild soybean (Glycine soja) germplasm pools using SSR markers”, Genetic Resources and Crop Evolution 44 Yorinori J T., Paiva W M., Frederick R D., Costamilan L M , Bertagnoli P F., Hartman G L., Godoy C V., & Nunes J J.(2005), “Epidemics of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003”, Plant Dis.89: 675-677 45 Zhou S.,Sauve R., &Thannhauser T W.(2009), “Proteome changes induced by aluminium stress in tomato roots”, JExp Bot.60: 1849- 1857 46 http://soybase.org/ 47 http://www.ca.uky.edu/agcollege/plantpathology/extension/soybean_rust/ pics.html 48 http://www.exetersoft ware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html 49 https://www.ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/44233/Fanglin_Lu.pdf ?sequence=1 50 http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/444627/1/id1291.pdf ... khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau? ?? Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá mức độ đa dạng di truyền số giống đậu tương có khả kháng bệnh gỉ sắt khác thị SSR Nội dung nghiên cứu - Tách nhân phân đoạn SSR. .. kháng bệnh mà cịn có ý nghĩa quan trọng công tác chọn tạo giống có chất lượng cao Xuất phát từ lý lựa chọn thực đề tài: ? ?Sử dụng thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền số giống đậu tương có khả. .. bệnh mà chưa trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả kháng bệnh gỉ sắt Việc nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn đậu tương có phản ứng khác bệnh gỉ sắt khơng có ý nghĩa việc bảo tồn giống có khả kháng