Luận văn Thạc sĩ: SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tương chứa 3055% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 1225% lipid và các vitamin cần thiết cho cơ thể. Các sản phầm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R. japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả. Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc. Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm 1980, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm những năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 1080% năng suất và chất lượng đậu tương ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn bố chưa được ai công . Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Hoàng Thị Trang LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà đã tạo mọi điều kiệ ệm. Tôi x Hoàng Phú Hiệp và các thầy, cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trường Đại học Sư phạm – Đại học Th i Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ khoa Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. . Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN........................................................................................ i LỜI CẢM ƠN............................................................................................ iii MỤC LỤC................................................................................................. iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................vi DANH MỤ.............................................................................................. viii DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................ix MỞ ĐẦU.................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề.............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu..............................................................................2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3 1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG................................................................................. 3 1.1.1....................................................................................... Cây đậu tương 3 1.1.2.....................................................Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 9 1.2. BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG........................................................................................ 10 1.2.1................................................................... Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 10 1.2.2........................................Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương 12 1.2.3 ở cây đậu tương......................................................................................................... 13 1.3. DẠNG DI PHÂN TÍCH ĐA TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG............................................................17 1.3.1. Chỉ thị hình thái.................................................17 ..................................................................................................... ....18 1.3.3.......................................................................................Chỉ thị phân tử 18 1.3.4.......................................................................................... Bản đồ QTL 23 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................25 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. 25 2.1.1..................................................................................................Vật liệu 25 2.1.2................................................................................................ Hóa chất 26 2.1.3..............................................................Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 27 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................27 2.2.1.............................Phương pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số 27 2.2.2...................Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 28 2.2.3................................................................................Phản ứng PCR-SSR 30 2.2.4.............................................Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 31 2.2.5...................................Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR 31 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................32 3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 32 3.1.1.................................Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương 32 3.1.2.............Kết quả 33 ằng phản ứng PCR- SSR ỀN CỦA CÁC GIỐ TƯƠNG KHÁNG BỆ ........................................ 41 ......................................................................... 44 KẾT LUẬ................................................................................................. 49 1. Kết luận................................................................................................ 49 2. Đề nghị................................................................................................. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................50 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều ABC ATP - binding cassette AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7- carboxylic acid S-methyl ester AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan AUDPC Area Under Disease Progress Curve Bp Base pair cs Cộng sự CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lương thế giới ISSR Inter - Simple Sequence Repeat kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection – Chỉ thị phân tử PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi tr ùng hợp polymerase QTLQuantitative Trait Loci - Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng RAPD Random Amplified Polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế SDS Sodium Đoecyl Sulphat SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản STSs Sequence Tagged Site TAE Tris – Acetate – EDTA Tris Trioxymetylaminometan XK Xuất khẩu USDA United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ UPGMA Phương pháp phân nhóm Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới...................... 4 Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới............... 5 Bảng 1.3. Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới..................................... 7 Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của nước ta trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015.......................................................................................................... 8 Bảng 2.1. Ký hiệu, xuất xứ và đặc điểm của các giống đậ ............25 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu .................................................................................................................... 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-SSR ...................................................................................................................... 31 Bảng 3.1. Số phân đoạn DNA được nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 5 cặp mồi SSR .................................................................................................................... 39 Bảng 3.2. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 cặp mồi SSR ...................................................................................................................... 40 SSR (%) ...................................................................................................................... 41 DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (20112015)......…9 Hình 1.2. gỉ sắt .................................................................................................................... 12 ệ ổng số tách từ mầm đậ 12 giống đậu tương nghiên cứu .................................................................................................................... 32 ới cặp mồi Satt009- F/Satt009-R ............................................................................................................................... 33 ới cặp mồi Sat_640 –F /Sat_640-R ...................................................................................................................... 34 với cặp mồi Sct_187-F /Sct187-R ...................................................................................................................... 35 với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R .................................................................................................................... 36 với cặp mồi Satt460-F /Satt460-R ...................................................................................................................... 38 12 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ ...................................................................................................................... 42 MỞ ĐẦU - Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tương chứa 30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid và các vitamin cần thiết cho cơ thể. Các sản phầm từ đậu tương được sử dụng rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R. japonicum sống cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả. Do đó, cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc. Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm 1980, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm những năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: “Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”. - Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR. - Nội dung nghiên cứu - Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR. - Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu tương dựa trên chỉ thị SSR. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1. Cây đậu tương Đậu tương hay đỗ tương, đậu tương (tên khoa học Glycine max) là loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa của Đông Á. Cây đậu tương được thuần hóa và trồng nhiều ở Trung Quốc vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên. Sau đó cây đậu tương được truyền bá và du nhập sang các nước Nhật Bản, Thái Lan, Philipppin, Việt Nam....vài thế kỷ sau đó. Cây đậu tương được trồng ở châu Âu và ở Hoa Kỳ vào khoảng thế kỷ XVII và XVIII. Loài này giàu hàm lượng chất đạm protein. Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao từ 20% – 45% dễ tan và hầu hết chứa các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không thay thế, vitamin E, muối khoáng, lipid...vì vậy người ta đã chế biến đậu tương thành hơn 600 sản phẩm dinh dưỡng có giá trị khác nhau. Sản phẩm của đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cải tạo đất trồng rất tốt. Về đặc điểm hình thái, đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm, lá nguyên và lá kép. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm. Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều lông khi chín có màu nâu. Hạt có nhiều hình dạng: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Về đặc điểm di truyền, đậu tương có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo. Bộ gen đơn bội của đậu tương có từ 1,29 -1,8 x 109 bp. Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm, chín trung bình và chín muộn. Trên thế giới cây đậu tương được coi là một trong những cây lương thực chiến lược của nhiều quốc gia như Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan...do khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập chung nhiều tại Châu Mỹ, sau đó là Châu Á. Hoa Kỳ là nước có diện tích trồng cây đậu tương lớn nhất thế giới và được đầu tư sản xuất cây đậu tương với quy mô công nghiệp. Diện tích đậu tương của các quốc gia những năm gần đây luôn biến động, các nước như Hoa Kỳ, Barazil, Argentina tăng theo từng năm, còn các nước thuộc lục địa Châu Á lại giảm như Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc lại giảm trong các năm gần đây được thể hiện qua bảng 1.1. Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới Quốc gia Diện tích thu hoạch (Nghìn ha) Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013 Hoa kỳ 78849447 79260943 80359578 85632823 Brazil 23327296 23968663 24975258 27864915 Nhật Bản 137700 136700 131100 128800 Argentina 18130799 18746227 17577320 19418825 Ấn Độ 9554190 10180000 10840000 12200000 Trung Quốc 8516115 7889055 6750080 6600100 Indonesia 660823 620928 567871 550793 Việt Nam 197800 181390 120751 119600 * Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) (http://faostat.fao.org). Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất trong các cây lấy dầu. Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích, tuy có biến động qua các năm. Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha. Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới. Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới Quốc gia Sản lượng ( nghìn tấn) Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013 Hoa Kỳ 227932,4 224594 203008,3 240826,1 Brazil 68756,3 74815,5 65848,9 81699,8 Argentina 52677,4 48878,8 40100,2 49306,2 Trung Quốc 15083,2 14485,1 13050,2 12500,2 Ấn Độ 12736,8 12214 14666 11948 Indonesia 907 843,8 843,2 780 Thái Lan 177,1 176,2 180 190 Việt Nam 298,1 266,5 175,3 173,7 * Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) (http://faostat.fao.org). Hàng năm diện tích và sản lượng cây đậu tương luôn được các nước quan tâm và đầu tư mở rộng. Trong đó Hoa Kỳ là nước có diện tích gieo trồng cây đậu tương lớn nhất. Tuy diện tích và sản lượng có tăng nhưng luôn biến động giữa các năm trở lại đây nguyên nhân có thể kể đến là do kỹ thuật canh tác, biến đổi khí hậu gây hạn hán, hay dịch bệnh như phấn trắng, gỉ sắt... đã làm ảnh hưởng tới năng suất và sản lượng đậu tương không nhỏ. Năng suất đậu tương của các nước cũng biến động tăng giảm theo từng năm 1.3). Bảng 1.3. Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới Quốc gia Năng suất (tấn/ha) Năm 2010 Năm 21011 Năm 2012 Năm 2013 Brazil 2947,5 3121,4 2636,6 2932,0 Hoa kỳ 2922,4 2819,9 2664,2 2914,5 Argentina 2905,4 2607,4 2281,4 2539,1 Thái Lan 1972,5 1963,1 1800,0 1792,5 Trung Quốc 1771,1 1836,1 1933,3 1893,9 Indonesia 1372,6 1359,0 1484,8 1416,1 Ấn Độ 1333,0 1199,8 1353,0 979,3 Việt Nam 1509,6 1469,4 1451,7 1452,3 * Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) (http://faostat.fao.org). Ở Việt Nam, hiện nay đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [4]. Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển. Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta. tăng trƣờng, lƣợng xuất khẩu đậu tƣơng đƣợc dự đoán sẽ lên 600 nghìn kinh tế, tổng lƣợng khô đậu tƣơng nhập khẩu tăng trở lại đạt 2,97 triệu tăng 19% so với năm trƣớc. Đây là lĩnh vực tiếp tục đƣợc cải thiện và dự đoán sẽ tăng nhẹ, đạt 3,1 triệu tấn vào năm 2014 và 3,2 triệu tấn nhu cầu thấp hơn so với dự kiến, lƣợng xuất khẩu cũng giảm xuống còn so với năm 2012 do sản lƣợng thấp. Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của nước ta trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015 Năm (nghìn ha) Năng suất (tấn/ha) Tổng sản lượng (nghìn tấn) 2011 2012 2013 2014* 2015* 181,1 119,6 117,8 120 130 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4 Điề nguyên nhân khiến ngành đậu tƣơng vẫn không đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu trong nƣớc. Tổ chức USDA dự báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện gieo trồng đậu tƣơng năm 2013 và 2014 lần lƣợt đạt 120 nghìn và 130 héc-ta, với mức sản lƣợng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả héc-ta trồng đậu tƣơng thấp hơn so với trồng ngô. Khu vực trồng đậu 1.1: Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) * Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo Sự biến động sản lượng, năng suất hay diện tích đậu tương của nước ta là không cao, dự kiến các năm tiếp theo 2014 và 2015 cũng tăng không đáng kể, nguyên nhân là người dân và nhà nước vẫn chưa đầu tư sâu sắc tới cây đậu tương, bên cạnh đó bệnh dịch hại cây hay điều kiện khí hậu....làm thiện hại đáng kể sản lượng đậu tương. 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương Hạt đậu tương có thành phần chủ yếu là protein, lipid, glucid, các vitamin và các chất khoáng. Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm từ 30-55%. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình nảy mầm của hạt. Loại potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin.. Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E. Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade, muối khoáng, nucleic acid, kích thích sinh trưởng. Các protein của lá đậu tương chủ yếu là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Đó là các protein có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử, các enzyme, các protein dự trữ, hoặc các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress. Một số nghiên cứu phân tích hệ protin lá đậu tương đã đưa ra nhận xét rằng một số đoạn protein có chức năng bảo vệ, một số protein có liên quan đến tính khàng bệnh gỉ sắt [17], [47]. Tóm lại, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng rất cao, giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protien và lipid. Trong đó do hàm lượng protein cao là yếu tố quan trọng làm cho cây đậu tương trở thành nguồn thực phẩm quan trọng cho người, động vật và ngoài ra cây đậu tương còn dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có mầu đen. 1.2. BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương. Hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương [50]. Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng trên cây đậu tương không được bảo vệ bằng thuốc trị nấm và ở một số vùng, bệnh gỉ sắt là một yếu tố làm giới hạn việc sản xuất đậu tương vụ xuân. Do sự thiếu thông tin về bệnh gỉ sắt đậu tương ở Tây Bán cầu và nguy cơ tiềm năng ảnh hưởng đến việc sản xuất đậu tương ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ, Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Bệnh Thực vật và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á (AVRDC) đã khởi động một dự án hợp tác vào năm 1978 để nghiên cứu dịch tể học của bệnh gỉ sắt đậu tương. Dự án hợp tác này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương được tiếp tục tiến hành ở AVRDC cho đến năm 1992. Ngoài ra, FAO đã thiết lập một mạng lưới nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương liên kết các nước Châu Á. Chương trình quốc gia của Thái Lan đã và đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các chương trình lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [34]. Ở Indonesia, bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương, xuất hiện cả ở mùa mưa và mùa khô. Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng , thử nghiệm thuốc trị nấm, sự tồn lưu của hạ bào tử trên đồng ruộng, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các nghiên cứu về sự phát tán bào tử. Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở phiến lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh. Ở mặt dưới phiến lá xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm, khi bệnh phát triển rộng ra trên các lá nó sẽ làm rách phiến lá, các bào tử được phát tán nhờ gió. Ở điều kiện thích hợp (15-300C), ẩm ướt nó sẽ nảy mầm và xâm nhập vào lá qua các lỗ khí khổng. Vết bệnh có thể hình thành ở các bộ phận của cây. Bệnh thường phát triển mạnh vào thời điểm cây đậu tương ra hoa, từ lá tầng thấp rồi lan lên lá tầng trên, làm lá vàng khô rồi rụng hàng loạt. Bệnh này xảy ra quanh năm và gây thiệt hại tới 40-50% năng suất hạt. Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đường kính 5-400 µm) cho đến khi sợi áp hình thành. Tùy vào điều kiện thời tiết mà thời gian lây nhiễm bệnh kéo dài theo từ 15 tuần tới 20 tuần. 1.2.2. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương Tính chống chịu bệnh gỉ sắt là khả năng cho năng suất tương đối của cây dưới áp lực của bệnh gỉ sắt. Để so sánh năng suất tương đối, người ta so sánh một dòng được trồng trên ô được và không được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm. Mặc dù cần có thêm diện tích ruộng, tính chống chịu cần được đánh giá vào mỗi mùa vụ chứ không giống như việc thu thập dữ liệu đường cong tiến triển bệnh, sự rụng lá và đếm nốt bệnh cho tính kháng gây giảm tốc độ phát bệnh. Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tương tác gen đối gen (gen for gen). Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương bao gồm: gen Rpp1, gen Rpp2; gen Rpp3; gen Rpp4; gen Rpp5 và gen Rpp6. Các nghiên cứu về gen cho thấy sáu gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và Rpp6 đã được phát hiện và mô tả có khả năng liên quan tới tính kháng đối với một số chủng nấm P.pachyrhizi. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào công bố giống đậu tương nào kháng được với tất cả các chủng nấm P.pachyrhizi. 1.2.3 ở cây đậu tương Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [35], [36], [37], [38], [39], [40], [43], [44]. Ở các nước trên thế giới, bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và một số cây trồng khác, làm hạn chế năng suất đậu tương vụ xuân. Vì vậy ở nhiều quốc gia trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khắc phục và chọn tạo nhiều giống đậu tương có tính kháng bệnh gỉ sắt cao và năng suất vợt trội như: giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác. Các nước đã đầu tư rất nhiều kinh phí và thời gian vào các dự án nghiên cứu, có dự án kéo đài tới chục năm như: Mỹ, Brazil, Trung Quốc… Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [34]. Dựa trên phần trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các dòng tính chống chịu cao hoặc có thể kháng một phần.Thiệt hại năng suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn so với các dòng có năng suất cao khác. Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt. Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặc có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết bệnh trên mắt lá. Gần đây, cùng với mức độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra thành bốn nhóm. Mặt phẳng X -Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y. Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm. Bằng kỹ thuật phân tử, những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền được tìm thấy ở đậu tương. Verma và cộng sự (1996) đã công bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [41]. Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương. Akkaya và cộng sự(1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD [20].. Ngoài ra, Abe và cộng sự (2003) đã phân tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen. Họ cũng đã nhận ra sự khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn giống đậu tương ở Nhật Bản và Trung Quốc [21].. Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các giống đậu tương của các nước Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt nguồn từ Trung Quốc. Trong khi đó, Cregan và cộng sự (1999) đã sử dụng đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập được bản đồ gen với 20 nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần lai của các trường đại học Iowa, Utah và Nebraska [25]. Hiện nay ở Việt Nam, mặc dù cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp và nền kinh tế quốc dân, nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn còn rất thấp so với các nước trên thế giới. So với năm 2001, diện tích trồng đậu tương ở nước ta trong năm 2005 tăng 24,16%, sản lượng tăng 29,10%. Nhưng đáng chú ý là năng suất đậu tương gần như không tăng hoặc tăng không đáng kể, do nhiều nguyên nhân như hạn chế về giống và điều kiện canh tác, bên cạnh đó là các bệnh sương mai, phấn trắng, gỉ sắt… là những loại bệnh thường xuyên xuất hiện gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới tình hình sản xuất đậu tương. Thực tiễn này đòi hỏi phải có sự đánh giá, lựa chọn các giống đậu tương mới có năng suất cao, chất lượng tốt đồng thời có khả năng kháng được các bệnh, đặc biệt là bệnh gỉ sắt [12]. Trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương đã được tiến hành nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [17], [32], [33], [34], [35], [36], tuy nhiên việc nghiên cứu một các hệ thống về bệnh gỉ sắt và khả năng kháng bệnh này ở cây đậu tương còn ít được đề cập đến. Ở nước ta, kết quả thí nghiệm của một số tác giả thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tương trồng đều bị nhiễm bệnh với các mức độ khác nhau. Các giống ít bị bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42. Các giống nhiễm bệnh nặng là V74 (DT74) và DH4. Trong nghiên cứu về mối quan hệ di truyền của 19 giống đậu tương Việt Nam với 25 cặp mồi bằng chỉ thị RADP, tác giả Đinh Thị Phòng và cộng sự cho thấy có 17/25 mồi có tính đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình) dao động từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồi có tính đa hình cao (PIC>0,5). Ngoài ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường như giống HL92 (kháng bệnh xoăn lá và thối quả) và HL203 (chống chịu khá với sâu bệnh) đều nằm trong cùng nhóm phụ III và có hệ số sai khác di truyền 0,114. Hoặc hai giống M103 (chịu nóng) và giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số sai khác di truyền 0,082 [12]. Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ -Viện Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: DT2000, CBU8325, DT95. Giống DT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR bước đầu khả quan. Như vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chúng có thể cung cấp những dẫn chứng chính xác và tin cậy trong nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền học và lai tạo giống cây trồng. Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà và cộng sự (2006), mười một giống đậu tương bao gồm các giống nhập nội như DT2000 (có khả năng kháng bệnh gỉ sắt), DT12, VX92 và VX93 (có năng suất cao), các giống địa phương như Cúc Vàng, Vàng Mường Khương và CBU8325 (có khả năng chịu sâu, nấm và chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phương pháp đột biến như DT84, DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh gỉ sắt) được đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17]. Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có chỉ số AUDPC thấp khả khả năng kháng bệnh gỉ sắt gần tương đương với giống kháng đối chứng (DT2000). Hạt giống của các giống này được tiếp tục nghiên cứu về chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh và cho thấy chúng có hàm lượng protein và lipid từ trung bình đến cao, có mặt đầy đủ các loại dự trữ chính, đảm bảo là nguồn cung cấp thực phẩm có chất lượng dinh dưỡng cao cho con người và gia súc. 1.3. M T S C PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG Hiện nay trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có thể tiến hành thực hiện ở các cấp độ và phương pháp khác nhau, từ các đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh đến đặc điểm của phân tử DNA, protein. Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tương dựa trên một số phương pháp như chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA. 1.3.1. Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ... Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen. Các nhân tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật. Biểu hiện khả năng kháng và nhiễm bệnh về mặt hình thái ở thực vật được xác định theo các tiêu chí nhất định. Đây là chỉ thị quan trọng để tìm kiếm và tạo giống kháng bệnh. Ví dụ như bệnh gỉ sắt được xác định trên cơ sở đánh giá vết bệnh trên lá, mức độ tạo quầng, mức độ tạo bào tử, từ đó có thể phân biệt được các giống đậu tương kháng tốt, kháng trung bình và mẫn cảm với bệnh. Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người thông qua đột biến. Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch tạng... có hại cho cơ thể của thực vật. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước được giải quyết [17]. 1.3 Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozymevà các protein dự trữ (stograge protein). Các isozymecó thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozymeamylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một loại chỉ thị đồng trội. Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định quá trình phát triển của cá thể. Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền. Hiện nay, kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai) . Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [17]. 1.3.3.Chỉ thị phân tử Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [42]. RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tách bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của các đối tượng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu. Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi. Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một mạch (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA của hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa dạng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i)Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyềnvà thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu. Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với các sinh vật khác loài, khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau. Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn. Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng hoặc thiết lập bản đồ di truyền. Có rất nghiều nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới và Việt Nam sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học như ở Brazil về nghiên cứu trên đối tượng ngô, ở Hy Lạp trên đối tượng chè, ở Việt Nam trên nhiều đối tượng cây trồng [12], [13], [19]. Chỉ thị SSR Kỹ thuật SSR do Litt và Luty (1989) [28], phát hiện lần đâu tiên người. SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật. Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau). Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR. SSR là công cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Song nhược điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài nhất định [25], [31], [33]. Trong thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại. Kỹ thuật này được sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ đa hình các alen thuộc cùng một locus. Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực. Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã được nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ước tính dòng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40]. Mặc dù các chỉ thị SSR có tính ưu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng bản đồ liên kết… Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một số lượng rất ít các công trình nghiên cứu công bố về một số lượng không lớn các chỉ thị SSR trong nghiên cứu genome đậu tương. Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu đa dạng trên cả đối tượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài như lạc, mơ, lúa mì [10], [12], [16], và đang phát triển ở các giống cây trồng khác như đậu tương [17]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ thị (markerassistedselection). Chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như: lúa, mía, đậu tương hay xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ. Các chỉ thị RFLP và AFLP Các chỉ thị phân tử như RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa hình DNA. Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên vị và cố định trên màng lai. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung). Trong khi đó, AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân. Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên. Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [39]. Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp. Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [20]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết [17]. 1.3.4. Bản đồ QTL Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số lượng đang được quan tâm. Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không. Các bước để lập bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300 -600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ. Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS -Marker Assisted Selection). Năm 2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định khối lượng hoặc tính chịu hạn ở đậu xanh đã được mô tả [20], [39]. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu Sử dụng 12 giống đậu tương do , như: Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ - Viện cây lương thực và thực phẩm nông n ồng Na Rì – Bắc Kạn, giống do Viện bảo vệ thực vật cung cấp. Ký hiệu, xuất xứ và đặc điểm của các giống đậu tương được trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1. Ký hiệu, xuất xứ và đặc điểm của các giống đậu tương TT giống 1 ĐT4 2 ĐT8 3 4 ĐT12 ĐT22 Xuất xứ Đặc điểm Kháng bệnh gỉ sắt Viện cây lương thực và cây thực phẩm chọn Việntạo cây lương thực và Kháng bệnh gỉ sắt cây thực phẩm chọn tạo tâm NCTN Đậu Trung Có khả năng chống đổ tốt đỗ - Viện Cây lương vì thân to, năng suất cao, thực và cây thực phẩm chịu nóng, nhiễm nhẹ chọn tạo Viện cây lương thực và thực Kháng bệnh bệnh gỉ sắt, chống đổ tốt. phẩm chọn tạo từ ột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) 5 DT26 Viện cây lương thực và Kháng bệnh khá, chống đổ thực phẩ tốt, phục hồi sau bị đục thân. ĐT2000 x ĐT12. Viện cây lương thực và 6 DT51 cây thực phẩm chọn lọc từ tổ hợp lai giữa LS17 x DT84 Nhiễm nhẹ bệnh đến trung bình,chống đổ Chống đổ tốt, nhiễm nhẹ với Viện Di DT2001. truyền nông 7 Chống ngập úng, năng suất cao. nghiệp chọn tạo sâu bệnh, năng suất cao, chiu nóng tốt. Viện Di truyền nông nghiệp lai tạo từ 2 giống đậu tương 8 DT96 DT90 và DT84. Chống chịu được bệnh sương mai, gỉ sắt ở mức độ tốt, vi khuẩn, đốm nâu. Chống đổ khá, chịu 9 DT2000 10 ĐVN14 11 NR1 12 NR2 Viện Di truyền nông nghiệp chọn tạo Kháng gỉ sắt ởlạnh, mức độ hạn khá,chịu tốt Viện cây lương thực và Chịu hạn,chống đổ, chống cây thực phẩm bệnh tốt, năng suất cao Kháng khá bệnh gỉ sắt, chịu lạnh Na Rì, Bắc Kạn Trung Na Rì, Bắc Kạn Nhiễm bệnh gỉ sắt, chịu hạn khá 2.1.2. Hóa chất Các hoá chất thông dụng, có độ tinh sạch được mua của các hãng Merck, Invitrogen, Amersham Pharmacia Biotech, New England Biolabs, như: Ethanol, NaH2PO2, Sobitol, Tris-HCl, NaCl, Phenol, Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, ddH2O... Bộ Kit tách chiết DNA tổng số “GeneJET Plant Genomic DNA Puification Mini Kit”, EDTA, TAE (Tris-Base, Glacial acetic acid, EDTA, ddH2O), CTAB, TE, PCR Master mix, Agarose, DNA Loading Dye (Bromphenol blue, xylene cyanol FF, glycerol, ddH2O), Ethydium bromide mua từ hãng Invitrogen 2.1.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu Đề tài đã sử dụng các dụng cụ như: Micro Pipet và đầu côn các cỡ, ống eppendorf loại 0,2ml; 1,5ml, 2ml. Các thiết bị bao gồm: máy điện di DNA, bộ nguồn, tủ lạnh (300C; - 850C), máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức), máy quang phổ, máy PCR, máy đo pH, cân điện tử (Đức, Thuỵ sỹ), tủ sấy (Carbolite, Anh), bể ổn nhiệt, nồi hấp khử trùng (TOMY, Nhật), bếp điện, máy soi gel và máy chụp ảnh gel điện di. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết từ mầm đậu tương, mầm hạt được chuẩn bị bằng cách ngâm hạt khô trong nước cất 1 giờ, cho hạt nẩy mầm trên giấy lọc trong hộp lồng ở buồng tối, khi mầm dài khoảng 2cm, tách riêng lấy phần thân mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sâu (200C). : (1) Nghiền 0,5g mầm với nitro lỏng bằng cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 4ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 5mM, pH8; NaH2PO4 0,4%; Sobitol 350 mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp dung dịch vào đầy 2 ống eppedorf loại 1,5ml. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch (lặp lại 1 lần nữa thao tác này). (2) Bổ sung vào 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH8; EDTA 20mM, pH8; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H2O) vào mỗi ống eppendorf chứa mẫu. Ủ mẫu ở 650C trong vòng 45 phút, khoảng 10 phút đảo ngược ống eppendorf 2 – 3 lần. Ủ xong để ở nhiệt độ phòng 5 phút. (3) Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. (4) Bổ sung Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lượng dung dịch mẫu, đảo ống 2 – 3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lượng dung dịch mẫu, đảo ống 2-3 lần. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch pha trên, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. (5) Bổ sung Isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với lượng dung dịch mẫu, bảo quản ở -200C trong vòng 2 giờ. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch.(6) Bổ sung 500 µl ethanol 70%, mix nhẹ bằng tay. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C, đổ dịch, để khô. Bổ sung 45 µl nước khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -200C. 2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu Tuyển chọn các chỉ thị SSR (2012) [17] dụng 5 đậu chúng tôi đã chọn và sử SSR cho việc phân tích đa dạng di truyền của các giống tương. Năm cặp mồi sử dụng trong các phản ứng PCR-SSR nghiên cứu được đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự các cặp mồi được trình bày trong bảng 2.2 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu Tên cặp mồi Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) từ đầu 5’ – 3' Tm Tan thực tế Kích thước (bp) Kiểu base Satt009 F CCA ACT TGA AAT TAC TAG AGA AA GTA TTA ACC CTT 46 163 51,3 R CTT ACT AGC 49,0 (ATT)14 Sat_064 F GTA TGC AAGG GATT AATT AAG 56,0 R TAG CTT TAT AAT GAG TGT GAT AGA T 64,0 54 146 (AT)34 Sct_187 F CT TG CT CCC ATT CT CT 48,0 R AAC ATT GGC TTT TTA CTT AG 52,0 46 136 (CT)10 Satt431 F GCG TGG CAC CCT TGA TAA ATA A 61,8 R GCG CAC GAA AGT TTT TCT GTA ACA 63,3 58 230 (ATT)21 Satt460 F GCG CGA TGG GCT GTT GGT TTTNTAT 73,9 R GCG CTA ACG ATTT GGCA TTTTT CTA TTG 73,5 58 156 (ATT)24 * Tm: Nhiệt độ mồi bắt cặp theo lý thuyết; Tan: Nhiệt độ mồi bắt cặp trên thực tế 2.2.3. Phản ứng PCR-SSR Phản ứng PCR-SSR được thực hiện trên máy PCR với thể tích phản ứng 25µl. Mỗi ống phản ứng PCR-SSR bao gồm các thành phần được trình bày cụ thể như trong bảng 2.3. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Biến tính hoàn toàn ở 950C trong 4 phút; lặp lại 33 chu kỳ với: (i) biến tính ở 950C trong 45 giây, (ii) tiếp hợp mồi ở 470C – 590C (tùy từng cặp mồi) trong 45 giây, (iii) tổng hợp kéo dài sợi mới ở 720C trong 1 phút; Hoàn thiện các sợi chưa tổng hợp hết ở 720C trong 9 phút; Bảo quản mẫu ở 40C, thời gian ∞. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR-SSR TT Thành phần 1 H2O 2 PCR Master mix Thể tích (µl) 8 12,5 3 Primer (Xuôi) (10pmol/µl) 1 4 Primer (Ngược) (10pmol/µl) 1 5 DNA template (25ng/µl) 2,5 Tổng 25 2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Điện di 5µl sản phẩm PCR-SSR trên gel agarose 4% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di được nhuộm với ethidium bromide trong 15 phút sau đó soi dưới đèn UV và chụp ảnh. 2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR Phân tích hệ số tương đồng các giống được phương pháp UPGMA trong NTSYS 2.0 theo quy ước: 1 = phân đoạn DNA xuất hiện và 0 = phân đoạn DNA không xuất hiện khi điện di sản phẩm PCR. Xác định hệ số sai khác di truyền và lập biểu đồ hình cây để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR- SSR 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương Sau khi tách chiết và thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium bromide 3.1). ảnh điện di 3.1 cho thấy ở tất cả các giếng điện di đều cho một DNA sắc nét, rõ ràng và ít bị đứt gãy độ tinh sạ sinh học phân tử. Hình 3.1. điện di DNA tổng số tách từ mầm đậu tương 12 giống đậu tương nghiên cứu 1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. DT51; 7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2 3.1.2. Kết quả SSR g PCR- Để phân tích tính đa hình DNA của 12 giống đậu tương nghiên cứ ằng phản ứng PCR- SSR Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt460, Satt431, sản phẩm PCRSSR được điện di trên gel agarose (4% thang DNA chuẩn 0,5kb. Các phân đoạn DNA được nhân bản với : Kết quả nhân bản với chỉ thị Satt009 Phản ứng PCR với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R được sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tương, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA được trình bày ở hình 3.2. Hình 3.2. Satt009-F/ Satt009-R M. DT51; 0,5kb; 1. DT4; 2. DT8; 3. DT12; 4. DT22; 5. DT26; 6. 7. DT84; 8. DT96; 9. DT2000; 10. DVN14; 11. NR1; 12. NR2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Satt009 cho thấy với cặp mồi Satt009-F/ Satt009-R cho sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tương DT8, DT12, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. Các băng có kích thước từ 180bp – 210bp, băng có kích thước 180bp là giống NR1, băng có kích thước 190bp gồm các giống DT96, DT2000, DVN14, băng DT12 có kích thước 200bp có hai giống là DT8, có một băng có kích thước lớn nhất là 210bp. Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sat_640 Phản ứng PCR với cặp mồi Sat_640 –F/Sat_640-R kết quả nhân bản các phân đoạn DNA ở hình 3.3. Hình 3.3. Sat_640 –F /Sat_640-R M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sat_640 – F/Sat_640-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tương DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2 từ 100bp – 110bp. Băng DT84, băng có kích thước 100bp DT51, giống DT22, DT26, có kích thước 110bp gồm các giống DT96, DT2000, NR1, NR2. Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Sct187 Kết quả nhân bản các phân đoạ cặp mồi Sct_187-F/ Sct_ được trình bày ở hình 3.4. - hản ứng PCR với 12 giống đậu tương, Hình 3.4. với cặp mồi Sct_187-F /Sct187-R M. ; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5.DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị Sct_187-F/ Sct_187-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tương DT4, DT8, DT12, DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1 kích thước từ 140bp – 170bp. Băng giống DT4, DT8, DT12, DT22, băng có kích thước 140bp có kích thước 150bp gồm các giống DT26, DT51, DT96, băng có kích thước 170bp có giống là DT2000, DVN14 NR1. Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R ệ gen của 12 giống đậ PCR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R được hản ứng ở hình 3.5. Hình 3.5. với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R M. 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi Satt431-F/ Satt431-R cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện ở các giống đậu tương DT4, DT8, DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Các băng có kích thước từ 200bp – 210bp, băng có kích thước DT4, DT8, băng có kích thước 200bp là giống 210bp gồm các giống DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. Kết quả phản ứng PCR-SSR với cặp mồi Satt460-F/Satt460-R Phản ứng PCR với cặp mồi Satt460-F/Satt460-R đ sử dụng phân tích hệ gen của 12 giống đậu tương, kết quả nhân bản các phân đoạn DNA được trình bày ở hình 3.6. /Satt460-R với cặp mồi Satt460-F 0,5kb; 1.DT4; 2.DT8; 3.DT12; 4.DT22; 5. DT26; 6.DT51; 7.DT84; 8.DT96; 9.DT2000; 10.DVN14; 11.NR1; 12.NR2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-SSR Satt460- F/Satt460-R cho thấy cặp mồi có kích thước như nhau là 100bp xuất hiện ở các giống đậu tương DT12, DT26, DT96, DT2000, DVN14, NR1. 5 chỉ thị SSR được sử dụng đều cho tính đa hình. Chỉ thị satt009 cho tỷ lệ đa hình cao nhất là 4 loại băng có kích thước khác nhau, chỉ thị Satt460 cho các băng của các giống xuất hiện có kích thước giống nhau. Các băng, vị trí và số phân đoạn của mỗi Bảng 3.1. mồi được thể hiện ở bảng 3.1. phân đoạn DNA bằng phản ứng PCR-SRR từ 5 cặp mồi SSR TT C SSR 1 Satt009 Dạ ng SS R Phân đoạn DNA xuất hiện ở các giống đậu tương DT8, DT12, iống đậu tương không xuất hiện (ATT)14 DT96, DNV14, 5 4 4 2 2 3 3 2 6 1 DT2000, NR1, NR2. DT22, DT26, 2 Sat_064 (AT)34 DT51, DT84, DT96, DT2000, NR1, NR2. DT4, DT8, DT12, 3 Sct_187 (CT)10 DT22, DT26, DT51, DT96, DT2000, DVN14, NR1, NR2. DT4, DT8, DT22, 4 Satt431 (ATT)21 DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, DVN14. DT12, DT26, 5 Satt460 (ATT)24 DT98, DT2000, DVN14, NR1. Qua phân tích sản phẩm điện di của phản ứng PCR-SSR với 5 cặp mồi đặc hiệu cho đậu tương với 12 giống đậu tương nghiên cứu nhận thấy có 4 chỉ thị SSR: Satt009, Sat_064, Sct_187, Satt431, Satt460 cho độ đa hình cao chỉ thị Satt460 cho đa hình thấp (Bảng 3.2). Bảng 3.2. phân đoạn DNA khi sử dụng 5 cặp mồi SSR Số phân đoạn DNA được Kích thước nhân bản 180 bp: NR1. Satt009 7 190bp: DT96, DT2000, DV14. 200bp: DT8, DT12 210bp: NR2 Sat_064 8 100bp: DT22, DT26, DT51, DT84. 110bp: DT96, DT2000, NR1, NR2. 140bp: DT4, DT8, DT12, DT22. Sct_187 10 150bp: DT26, DT51, DT96. 170bp: DT2000, DVN14, NR1. 200bp: DT4, DT8. Satt431 210bp: 9 DT22, DT26, DT51, DT84, DT96, DT2000, Satt460 DVN14. 100bp: DT12, DT26, DT96, 6 DT2000, DVN14, NR1. 3.2. PHÂN TÍCH TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG TƯƠNG KHÁNG BỆNH KHÁC NHAU Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.0 trong phân tích tính đa dạng của 12 giống đậu tương dựa trên kết quả phân tích SSR với 5 , kết quả đã xác định hệ số sai khác di của từng cặp giống đậu tương nghiên cứu ảng 3.3. 3.3. (%) DT 4 DT4 0,0 0 DT 8 DT 12 DT 22 DT 26 DT 51 DT 84 DT 96 D D T V 20 N NR 1 NR 2 DT8 DT12 DT22 DT26 DT51 DT84 DT96 DT2000 DVN14 NR1 NR2 0,0 0 8,9 6 1,4 3 5,4 9 4,0 5 8,9 6 2,5 5 2,5 5 1,4 4 5,4 9 8,9 6 0,0 0 8,9 6 1,4 3 5,4 9 4,0 5 8,9 6 2,5 5 2,5 5 1,4 4 5,4 9 8,9 6 0,0 0 1,0 4 3,4 7 8,9 6 0,0 0 4,5 8 4,5 8 3,4 7 3,4 7 0,0 0 0,0 0 2,8 8 1,4 4 3,4 7 1,1 2 1,1 2 2,8 9 2,8 9 3,4 7 0,0 0 1,4 4 3,4 7 1,1 2 1,1 2 2,8 9 2,8 9 1,0 4 0,0 0 2,0 3 2,5 5 2,5 5 5,4 9 5,4 9 8,9 6 0,0 0 4,5 8 4,5 8 1,0 4 1,0 4 6,9 3 0,0 0 0,0 0 1,1 2 1,1 2 4,5 8 0,0 0 1,1 2 1,1 2 4,5 8 0,0 0 2,8 9 1,0 4 Kết quả bảng 3.3 cho thấy hệ số sai khác di truyền của 12 giống đậu tương giao động trong khoảng 0% đến 8,96%. Trong đó có cặp giống có hệ số sai khác di truyền nhỏ nhất là cặp DT4 và DT8 với hệ số sai khác là 0%. Các cặp có hệ số di truyền cao nhất là DT4 và DT12, DT8 và DT12, DT51 và DT12, DT4 và DT84, DT8 và DT84, NR2 và DT4, NR2 và DT8, NR2 và DT51, hệ số sai khác di truyền đều là 8,96%. Từ kết quả phân tích được thiết lập biểu thị m sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa 12 giống đậu tươn (Hình 3.7) 0,0 0 3,4 7 0,0 0 Nhánh thứ hai có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ 12 giống đậu tương Phân tích sơ đồ hình cây ở hình 3.7 cho thấy 12 giống đậu tương nghiên cứu được chia thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhấ ống nhiễm bệ , bao gồm các giống kháng bệnh và các giống trung gian và giống nhiễm nhẹ bệnh gỉ sắ khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60% (1- 0,40). Nhánh thứ hai được chia làm hai nhánh phụ, nhánh phụ thứ nhất giống đậ khoảng cách di truyền là 58%. Nhánh phụ thứ hai được chia làm hai nhóm với khoảng cách di truyền là 52%. Nhóm 1 gồm DT84, DT51, DT26 , nhóm 2 được chia làm hai nhóm phụ với khoảng cách di truyền là 36%. Nhóm phụ 1 gồm các giống NR1, DVN14, DT2000, DT96 nhóm phụ 2 gồm các giống DT4, DT8, ĐT22. 1, DT2000 ỉ sắt ở mức độ tốt 2, 8 100%, Sơ đồ hình 3.7 cho thấy các giống đậu tương khác nhau về mặt di truyền phân bố theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Như vậy, cũng giống như các chỉ thị phân tử khác, kỹ thuật SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tương tham gia thí nghiệm, điều này rất có ý nghĩa kinh tế trong việc chọn tạo giống cây trồng. 5 cặp mồi SSR được sử dụng 12 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt đều biểu hiện tính đa hình. Số DNA được nhân bản từ phân đoạn cặp mồi SSR dao động từ 6 đến 10 . Trong 5 cặp mồi có 4 cặp mồi cho tính đa hình cao nhất với hệ số đa dạng di truyền cao. Phân tích đa dạng di truyền trên sơ đồ hình cây cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 60%. Những thông tin này là cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn cặp bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống. Để khẳng định một cách chắc chắn nhận định trên cần tiến hành một số các nghiên cứu tiếp theo như lây nhiễm nhân tạo, thực hiện các phép lai các cá thể bố mẹ thuộc các giống/dòng khác nhau và phân tích theo dõi mức độ phân ly của phân đoạn DNA đặc trưng ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá mức độ liên kết của chỉ thị với tính kháng bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra . CHUNG Bệnh gỉ sắt ở đậu tương là một trong những bệnh hại cây đậu đỗ gây thiệt hại năng suất cây trồng và khó phòng trừ tận gốc nguồn bệnh. Bệnh gây ảnh hưởng đến lá cây, giảm hoạt động quang hợp thực vật, gây rụng lá, chết sớm, và mất năng suất. Mầm bệnh chỉ xuất hiện trên cây trồng và tiêu biến khi cây đậu tương chết hoặc khi nông dân thu hoạch đậu tương. Loại bệnh này xuất hiện tại Mỹ vào năm 2004, chủ yếu ở các bang miền nam. Phun thuốc diệt nấm là cách duy nhất để kiểm soát bệnh vì các nhà khoa học chưa lai tạo được giống đậu tương kháng bệnh. Các bào tử gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương Châu Á đang gây mối đe dọa nghiêm trọng đến ngành sản xuất đậu tương của Mỹ do mầm bệnh có thể lây lan qua gió từ khoảng cách rất xa. Các nhà nghiên cứu của trường Đại học Illinois đã tìm ra phương pháp giúp xác định sự xuất hiện của các bào tử này trong môi trường. Các nước trên thế giới và cả Việt Nam đã có rất nhều công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương [1], [4], [7], [18], [37], [38], [41], [43]. Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà và cộng sự (2006), mười một giống đậu tương bao gồm các giống nhập nội như DT2000 (có khả năng kháng bệnh sắt), DT12, VX92 và VX93 (có năng suất cao), các giống địa phương như Cúc Vàng, Vàng Mường Khương và CBU8325 (có khả năng chịu sâu, nấm và chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phương pháp đột biến như DT84, DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh sắt) được đánh giá khả năng kháng bệnh sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17]. Hiện nay vẫn chưa tìm được cách hay thuốc bảo vệ thực vật đặc dụng để trừ bệnh gỉ sắt trên đậu tương, vì thế người dân trồng cây đậu tương chỉ có thể chọn các biện pháp phòng trừ trước khi trồng và sau thu hoạch hạt nhằm hạn chế thiện hại thấp nhất do bệnh gỉ sắt gây ra. Các biện pháp phòng trừ chủ yếu như: Chọn giống chịu bệnh, chống bệnh và sản xuất giống sạch bệnh để sử dụng trong sản xuất, chọn đúng thời vụ trồng; Luân canh với lúa nước hay các cây hòa thảo; Xử lý giống bằng Bayphidan 10 - 100g a.i./1 tấn hạt giống; Có thể phun thuốc hạn chế bệnh bằng các loại thuốc trừ gỉ sắt đặc biệt như: Bayleton 250 g a.i./ha; Baycor 125 375 g a.i./ha; phun nước lưu huỳnh vôi 0,3 – 10 Bômê. Bằng sự phát triển mạnh về khoa học kỹ thuật hiện nay có rất nhiều các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt và gen kháng bệnh gỉ sắt đã được công bố vào những năm gần đây, để xác định gen kháng bệnh gỉ sắt trên các giống đậu tương của Mỹ và Brazil, sử dụng phương pháp lập bản đồ liên kết chỉ thị phân tử (map-based cloning) các nhà khoa học đã phát hiện có sáu gen chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương bao gồm: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 và một số chỉ thị SSR liên kết gần với các gen từ Rpp1 đến Rpp5: Rpp1và Rpp4 thuộc nhóm liên kết G trên NST số 18; Rpp3 thuộc nhóm liên kết C2 trên NST số 6; Rpp3 thuộc nhóm J trên NST số 16 và Rpp5 thuộc nhóm N trên NST số 3 [4], [14], [15], [17], [21], [26], [31], [40]. Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu về bệnh gỉ sắt sử dụng các phương pháp như các chỉ thị phân tử như RFLP, RAPD, AFLP, SSR….cho kết quả cao, không tốn thời mà lượng mẫu không đòi hỏi nhiều, và một lúc có thể phân tích được rất nhiều mẫu. Chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, trong chọn giống mới hay lập bản đồ liên kết gen, SSR được áp dụng trên các đối tượng động vật và thực vật vì nó có độ đa hình cao và chính xác. Những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh gi sắt chi thị phân tử SSR hay RAPD ở đỗ tại Việt Nam. Ứng dụng kỹ thuật này, Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006) đã đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệ sắt, nhằm cung cấp thông tin di truyền, góp phần lưu giữ và duy trì nguồn gen của một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc cũng như giống được trồng đại trà ở Việt Nam [8], [13], [12], [14], [15], [17], [18]. Hạt đậu tương chứa hàm lượng protien rất cao, cho nên có rất nhiều nghiên cứu liên quan tới hệ protien ở đậu tương, nhiều protein được phát hiện có khả năng chống chịu hạn, stress, kháng và phòng vệ, chữa bệnh…Vũ Thanh Trà (2012) đã thiết lập được bản đồ bản đồ điện di 2-DE của hệ protein lá đậu tương ở giống DT2000 kháng bệnh gỉ sắt với 119 điểm protein trên gel, trong đó có 35 protein đã được định danh và phân loại theo 9 nhóm chức năng. Đặc biệt phát hiện có 3 protein liên quan đến khả năng kháng bệnh/phòng vệ, chống stress, chịu hạn [17], [20], [24]. Qua kết quả nghiên cứu thu đượ 3.7) (Hình ỉ sắt ở mức độ tố 2 100%. Kết quả này trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà (2012) trên giống đậu tương DT2000. Ngoài ra chúng tôi đ bổ sung thêm các giố DT8, DT22 có mức kháng trung bình vào đã phát hiện giống NR1 là giống địa phương được cung cấp bởi Trung tâm giống sắt ức khá cần được Na Rì-Bắc Kạn kháng bệnh gỉ nghiên cứu và phát triển . Nhìn chung, việc phát triển các giống đậu tương mang tính kháng đối với bệnh gỉ sắt ở nước ta còn chậm và chủ yếu dựa vào phương pháp chọn tạo truyền thống mất nhiều thời gian. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại như chọn tạo nhờ dấu chuẩn phân tử MAS mới chỉ giới hạn ở những nghiên cứu bước đầu. Do đó, cần đẩy mạnh và tiến hành các nghiên cứu sâu và toàn diện hơn nhằm phát triển các giống đậu tương có năng suất cao và có khả năng kháng bệnh sắt để đáp ứng như cầu ngày càng cao trong sản xuất công nghiệp làm thực phẩm cho con người, lấy dầu và làm thức ăn cho chăn nuôi. KẾT LUẬN VÀ 1.1. Kết luận 1.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng phản ứng PCR-SSR với 5 cặp mồi đã thu được 40 phân đoạn từ hệ gen của 12 giống đậu tương khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Sat_640, Sct187, Satt431, Satt460 5 chỉ thị SSR (Satt009, tính đa hình. 1.3. S tương giống đậu . Khoảng cách di truyền c 60%. . Hai giống DT2000 và DT96 kháng bệnh gỉ sắt tốt nhất hệ số tương đồng d Đ8 thuộc nhóm kháng bệnh gỉ sắt trung ệ số tương đồ 1.4. 100%. Đề nghị 2.1. . 2.2. Có thể sử dụng những giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt sản xuất hoặc làm nguyên liệu trong lai tạo giống. 2.3. Có thể sử dụng thông tin về sự đa dạng di truyền ở mức DNA làm cơ sở cho việc lai tạo giống, tuy nhiên cần mở rộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật SSR với số lượng mồi và giống nghiên cứu nhiều hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO T 1. Nguyễn Thị Bình (1990). Nghiên cứu và đánh giá khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi sydow) của tập đoàn đậu tương Miền Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội. 2. Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T, Bùi Chí Bửu và Bùi Bá Bổng (2001), “Chọn giống nhờ Marker và Phân tích QTL”, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr. 44 – 58. 3. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương. Nxb Nông Nghiệp. 4. Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), “Đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của một số giống đậu tương (Glycine max (L) Merrill) địa phương”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. 5. Nguyễn Đăng Khôi (1997), "Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam", Tạp chí Sinh học,19:5-10. 6. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội. 7. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 8. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng. Nxb Đại học Thái Nguyên. 9. Đinh Thị Ngọc (2008), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh và phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương trồng ở vùng Tây Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. 10. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vignaradiata (L) Wilczek). Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội. 11. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên. 12. Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Nguyễn Văn Thắng, Trần Văn Dương (2003),“Đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt bằng kỹ thuật RAPD”. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 805-809. 13. Nguyễn Đức Thuận và Nguyễn Thị Lang (2006). “Đánh giá đa dạng di truyền của đậu tương bằng phương pháp RAPD marker phân tử”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kỳ 1 tháng 3/2006: 65-68, 87. 14. Vũ Thanh Trà và Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kỳ 1 tháng 11/2006: 3032, 43 15. Vũ Thanh Trà, Trần Thị chất lượng hạt của một số giống đậu tương Việt Nam có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kỳ 2 tháng 10/2006: 33-37 16. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài, Nguyễn Thúy Điệp, Trần Thị Thúy (2010). “Nghiên cứu xác định các chỉ thị sao chép có trình tự đơn giản (Marker SSR) nhận dạng một số giống lúa Nếp, lúa Nương bản địa Việt Nam”, T ôn, số 153, tr 15-21. ông nghiệp và P 17. Vũ Thanh Trà (2012), Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Sư Phạm-ĐHTN. 18. Lê Thị Ngọc Vi và Nguyễn Thị Lang (2006). “Nghiên cứu gen kháng bệnh gỉ sắt trên cây đậu tương bằng phương pháp phân tử microsatellite”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 9/2006: 36-39 19. Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh (2008), "Đánh giá sự đa hình DNA một số giống khoai tây (Solanumtuberosum L.) bằng kỹ thuật RAPD", Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 1 tháng 1/ 2008: 20 -25. T 20.Akkaya M. S., Bhagwat A. A., & Cregan P. B. (1992), “Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean”, Genetic 132:1131-1139. 21.Abe J., Xu H., Suzuki Y., Kanazawa A . , & Shimamoto Y (2003), “Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs”, Theor. Appl. Gener. 106: 445-453. 22.Brown-Guedira, J.A. Thompsonb, R.L. Nelsoncand M.L. Warburton (2000), “Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American Ancestors Using RAPD and SSR Markers”, Crop Science 40:815- 823. 23.Bates L. S. (1973), “Rapid determinatin of tree protein for waterstress studies”, Plant and Soil, 39, pp 205-207. 24.Chen T.H., Murant N. (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant dehydrin proteins”, Physiol. Plant, pp. 795-803. 25.Cregan P. B., Javik T., Bush A. L., Shoemaker R. C., Lark K. G., Kahler A. L., Kaya N., Van Toai T. T., Lohnes D. G., Chung J.,&Specht J. E. (1999), “An integrated genetic linkage map of the soybean genome”, Crop Sci.39: 1464-1490 26.Hartman GL, Wang TC & Tschanz AT (1991). “Soybean rust development and the quantitative relationship between rust severity and soybean yield”, Plant Dis. 75:596-600. 27. Kashi, Y. and D. G. King (2006). “Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolutio”, TRENDS in Genetic. 22 (5), 253- 259. 28.Litt M., & Luty J. A.(1989), “A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiae muscle actin gene”, Am. J.Hum. Genet.44(3): 397 -401 29.Lawson, M. J. and L. Zhang (2006), “Distinct pattern of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genome”, Genome Biology. 7 (2): R14. 30.Morgante, M., M. Hanafey, W. Powell (2002). “Microsatellites are preferentially asscociated with non repetitive DNA in plant genomes”, Nature Genetic. 30, 194-200. 31.McCouch, S. R., L. Teytelman, Y. Xu, K. B. Lobos(2002). “Development and mapping of 2240 new SSR maker for rice (Oryzae sativa L.)”, DNA Research. 9, 199-207. 32.Nuntapunt M, Surin P & Achavasmit P (1984), “Evaluation of ratereducing rust resistance and tolerance in advanced soybean lines”, Journal of Agriculture Research and Extension (Thailand) 2:15-19 33. Garcia A., Calvo E. S., Kiihl R. A. S., Harada A., Hiromoto D ., & Vieira L. G. (2008), “Molecular Mapping of Soybean Rust (Phakopsora pachyrhizi) Resistance Genes: Discovery of a Novel Locus and Alleles”, Biomedical and Life Sciences 117(4): 545- 553. 34.Perez, M. A, F.J.Gallego, I.Martinez, P. Hidalgo (2001). “Detection, distribution and selection ofmicrosatellites (SSRs) in the genome of yeast Saccharomyces cerevisiae as molecular markers”, mApplied microbiology. 33, 461-466. 35.Tschanz AT & Tsai BY (1982). “Effect of maturity on soybean rust development”, Soybean Rust Newsl. 5:38-4 1 36.Tschanz AT & Tsai MC (1983). “Evidence of tolerance to soybean rust in soy beans”, Soybean Rust Newsl. 6:28-31 37.Tschanz AT & Wang TC (1980). “Soybean rust development and apparent infection rates at five locations in Taiwan”, Prot. Ecol. 2:247250 38.Tschanz AT, Wang TC, Cheng YH, Montha N & Chen CM (1985). “International screening trials for soybean rust tolerance”, Soybean Rust Newsl. 7:22-25 104. 39.Sholihin, & Hautea D. M. (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(1-2): 17-61 40.Silva D. C. G, Yamanaka N., Brogin R. L., Arias C. A. A., Nepomuceno A. L., Mauro A. D., Pereira S. S., Nogueira L M., Passianotto A. L. L., & Abdelnoor R. V. (2008), “Molecula mapping of two loci that confer resistance to Asian rust in soybean.Theor”, Appl. Genet. 117:57-63. 41.Verma D. P. S., & Shoemaker R. C. (1996), “Soybean, genetics, molecular biology and biotechnology”, Cab International, pp. 37-40 42.Welsh J., & McClelland M. (1990), “Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers”, Nucleic Acids Res. 18: 7213-7218. 43.Wang K. J., & Takahata Y. (2007), “A preliminary comparative evaluation of genetic diversity between Chinese and Japanese wild soybean (Glycine soja) germplasm pools using SSR markers”, Genetic Resources and Crop Evolution. 44. Yorinori J. T., Paiva W. M., Frederick R. D., Costamilan L. M. , Bertagnoli P. F., Hartman G. L., Godoy C. V., & Nunes J. J.(2005), “Epidemics of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003”, Plant Dis.89: 675-677. 45.Zhou S.,Sauve R., &Thannhauser T. W.(2009), “Proteome changes induced by aluminium stress in tomato roots”, JExp. Bot.60: 18491857. 46.http://soybase.org/. 47.http://www.ca.uky.edu/agcollege/plantpathology/extension/soybean_r ust/ pics.html. 48.http://www.exetersoft ware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html. 49. https://www.ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/44233/Fanglin_L u.pdf ?sequence=1 50.http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/444627/1/id1291.pdf [...]... dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau - Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR - Nội dung nghiên cứu - Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR - Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu tương dựa trên chỉ thị SSR Chương 1... hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền. .. con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh gỉ sắt) được đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử và tạo quầng [17] Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có chỉ số AUDPC thấp khả khả năng kháng bệnh gỉ sắt gần tương đương với giống kháng đối chứng (DT2000) Hạt giống của các giống này... của phân tử DNA, protein Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tương dựa trên một số phương pháp như chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh và chỉ thị phân tử DNA 1.3.1 Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng. .. nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: DT2000, CBU8325, DT95 Giống DT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR bước đầu khả quan Như vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chúng có thể cung cấp những dẫn chứng chính... chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có mầu đen 1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương Hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của. .. những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [39] Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [20] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong... tiết mà thời gian lây nhiễm bệnh kéo dài theo từ 15 tuần tới 20 tuần 1.2.2 Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương Tính chống chịu bệnh gỉ sắt là khả năng cho năng suất tương đối của cây dưới áp lực của bệnh gỉ sắt Để so sánh năng suất tương đối, người ta so sánh một dòng được trồng trên ô được và không được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm Mặc dù cần có thêm di n tích ruộng, tính chống chịu cần được đánh... gen của sinh vật nhân thực Trong thập kỷ qua, các chỉ thị này đã được nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách di truyền, ước tính dòng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40] Mặc dù các chỉ thị SSR có tính ưu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền. .. 1.3.3 .Chỉ thị phân tử Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [42] RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có ... PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THI T BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Vật liệu 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thi t bị địa điểm nghiên cứu 27 2.2 PHƯƠNG... (Glycine max) Châu Á gây thi t hại đáng kể suất nước trồng đậu tương Hầu nhiệt đới cận nhiệt đới ghi nhận có xuất bệnh gỉ sắt đậu tương địa phương [50] Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt gây thi t hại nghiêm trọng... bước sau: (i )Thi t kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân gel agarose; (iv) Phân tích kết phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyềnvà thi t lập sơ