Tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu tạp D (Ramipril diketopiperazin) của Ramipril

Ramipril là thuốc ức chế men chuyển angiotensin (ACE) được sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim và các bệnh về thận. Ramipril diketopiperazin (tạp D trong USP 41 và BP 2018) là tạp phải kiểm tra trong cả nguyên liệu lẫn thành phẩm của ramipril. Tuy nhiên, chuẩn tạp này đang được bán với giá rất đắt và chưa có trong ngân hàng chất đối chiếu Việt nam, điều này gây khó khăn, bị động thiết cho công tác kiểm nghiệm nguyên liệu và thành phẩm của ramipril.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TẠP D (RAMIPRIL DIKETOPIPERAZIN) CỦA RAMIPRIL Nguyễn Trần Thiên Thanh*, Ngơ Thị Thanh Diệp* TĨM TẮT Mở đầu: Ramipril thuốc ức chế men chuyển angiotensin (ACE) sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim bệnh thận Ramipril diketopiperazin (tạp D USP 41 BP 2018) tạp phải kiểm tra nguyên liệu lẫn thành phẩm ramipril Tuy nhiên, chuẩn tạp bán với giá đắt chưa có ngân hàng chất đối chiếu Việt nam, điều gây khó khăn, bị động thiết cho cơng tác kiểm nghiệm nguyên liệu thành phẩm ramipril Tại Việt Nam chưa có cơng trình cơng bố nghiên cứu tổng hợp tạp D Do đó, việc tổng hợp tạp D có độ tinh khiết cao làm sở cho việc thiết lập chất đối chiếu cần thiết Đối tượng nghiên cứu: Ramipril diketopiperazin (tạp D ramipril) Phương pháp nghiên cứu: Ramipril diketopiperazin tổng hợp từ nguyên liệu ramipril phản ứng đóng vòng môi trường toluen Sản phẩm sau tổng hợp tinh chế xác định cấu trúc kỹ thuật phổ nghiệm IR, MS, NMR, xác định độ tinh khiết phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic thiết lập chất đối chiếu Kết quả: Tạp D tổng hợp thành cơng với hiệu suất tồn qui trình 57,5% Sản phẩm thu đạt độ tinh khiết sắc ký 99%, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu Tạp D có giá trị ấn định 99,27% tính theo ngun trạng Kết luận: Đã tổng hợp tinh chế thành công tạp D Tạp D đánh giá thiết lập làm chất đối chiếu Từ khóa: ramipril diketopiperazin, ramipril, tạp D ABSTRACT SYNTHESIS AND ESTABLISHMENT OF RAMIPRIL DIKETOPIPERAZINE (IMPURITY D) REFERENCE STANDARD OF RAMIPRIL Nguyen Tran Thien Thanh, Ngo Thi Thanh Diep * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No - 2020: 107 - 113 Background - Objectives: Ramipril is an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor, used to treat high blood pressure, heart failure, and diabetic kidney diseases The BP 2018 and USP 41 require conducting ramipril diketopiperazine (as related compound D) impurity test in ramipril pharmaceutical substances and corresponding finished products However, this related compound is costly with limited accessibility that affects implementation of this impurity test There have been no published local studies on chemical synthesis of ramipril diketopiperazine so far Therefore, this study was conducted with aim of synthesis of ramipril diketopiperazine with high purity that conforms to establish reference standard Method: Impurity D was synthesized from ramipril by cyclization reaction in toluene media The obtained product was determined chemical structure from its IR, MS, NMR spectroscopic data, purified by HPLC and established as reference standard Results: Ramipril diketopiperazine was successfully synthesized with 57.7% yield By using HPLC-PDA, its chromatographic purity was determined over 99% on the basic of peak area normalization method and Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Ngơ Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 * B - Khoa học Dược Email: ngothithanhdiep@ump.edu.vn 107 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 conformed to establish reference standard The assigned value of impurity D is 99.27% Conclusion: Ramipril diketopiperazine (impurity D) was successfully synthesized and standardized as reference standard Key words: ramipril diketopiperazine, ramipril, impurity D dioxodecahydro-2H-cyclopenta[4,5]pyrrolo[1,2-a] ĐẶT VẤNĐỀ pyrazin-2-yl]-4-phenyIbutanoat Tăng huyết áp tình trạng bệnh lý mãn tính gây biến chứng tim mạch như: tai biến mạch máu não, suy tim, bệnh tim mạch vành, nhồi máu tim Nhóm thuốc đối kháng thụ thể angiotensin, có ramipril sử dụng phổ biến để điều trị tăng huyết áp Theo USP 41(1) BP 2018(2), ramipril có tạp chất liên quan cần phải kiểm sốt, đó, ramipril diketopiperazin (tạp D theo BP 2018 USP 41) tạp bắt buộc phải kiểm tra nguyên liệu thành phẩm ramipril Hiện hệ thống ngân hàng chất đối chiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chưa có chất đối chiếu tạp D Điều gây khó khăn việc thực công tác kiểm nghiệm tạp chất liên quan nguyên liệu chế phẩm chứa ramipril phải mua với giá cao từ nước ngồi Do đó, việc tổng hợp, thiết lập chất đối chiếu tạp D cần thiết Ngun liệu, dung mơi, hóa chất, trang thiết bị ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Tạp D tổng hợp từ ramipril phản ứng đóng vịng mơi trường toluen theo Hình Ramipril diketopiperazin (tạp D ramipril): ethyl(2S)-2-[(3S,5aS,8aS,9aS)-3-methyl-l,4- Nguyên liệu Ramipril đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ (USP 41) Nhà sản xuất: Trung Quốc Số lô: 5654 – 19 -122M Hạn dùng: – 2022 Dung môi, hóa chất: Nước cất, acetonitril (ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng Toluen, cloroform (CF), dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EA), methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn phân tích Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Waters Alliance e2695 kết nối với đầu dò Waters PDA 2998, buồng soi UV Vilber Loumart CN-15LC, máy khuấy từ gia nhiệt IKA C-Mag HS 10, máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart SMP-10, tủ sấy Memmert WM500CO, mỏng silica gel F254 Merck, máy quang phổ hồng ngoại Shimadzu 00556, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Advance II Hình Quy trình tổng hợp tạp D ramipril 108 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Ramipril nguyên liệu (1g; 2,40 mmol) cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm vào bình cầu 50 ml toluen, khuấy từ - 12 nhiệt độ 120 - 130 oC, sau quay chân không hỗn hợp phản ứng nhiệt độ 45 - 50 oC để loại hết dung môi, thu cắn khô Sản phẩm bảo quản lạnh chai thủy tinh màu, tránh ánh sáng Tinh chế Sản phẩm tổng hợp tinh chế kỹ thuật kết tinh lại MeOH nhiệt độ thấp, - oC Thử sơ bộ tinh khiết sản phẩm tinh chế Sản phẩm sau tinh chế sơ kiểm tra độ tinh khiết nhiệt độ nóng chảy sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi có độ phân cực khác Sắc ký lớp mỏng: mỏng silica gel F254 (Merck) Ba hệ dung môi sử dụng CF – EA (4:6); DCM – EA (4:6); ACN – H2O (1 : 1) Mẫu thử pha CF với nồng độ 1mg/ml Xác định cấu trúc Sản phẩm sau tinh chế thử sơ tinh khiết xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm IR, MS NMR, đồng thời so sánh kết phổ nghiệm với tài liệu tham khảo Xác định độ tinh khiết bằng HPLC-PDA Độ tinh khiết sản phẩm tinh chế xác định phương pháp HPLC qui 100% diện tích pic Quy trình xác định độ tinh khiết tạp D kỹ thuật HPLC-PDA thẩm định theo hướng dẫn ICH(3) Điều kiện sắc kí Cột sắc ký Eurospher II 100- C18 (150 x 4,6 mm; µm) -Nhiệt độ cột: 40 oC, bước sóng phát 210 nm Tốc độ dịng: ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Thời gian sắc ký: 20 phút Mẫu thử pha ACN – H2O (50:50) với nồng độ 300 ppm B - Khoa học Dược Nghiên cứu Bảng Chương trình gradient xác định độ tinh khiết tạp D Thời gian Acetonitril Nước 0–5 45 55 5–9 90 10 – 17 90 10 17 – 19 45 55 19 – 20 45 55 Quy trình chạy sắc kí lỏng với điều kiện sử dụng để xác định giá trị ấn định độ tinh khiết sắc ký thiết lập chất đối chiếu tạp D phịng thí nghiệm thuộc Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Đánh giá tạp D Tạp D đánh giá theo tiêu cảm quan, độ tan, điểm chảy, định tính phương pháp phổ nghiệm độ tinh khiết Thiết lập chất đối chiếu tạp D Đánh giá độ đồng q trình đóng lọ Các mẫu lấy ngẫu nhiên theo cơng thức N tổng số lọ Việc xác định độ tinh khiết tạp D lọ tiến hành theo phương pháp HPLC xây dựng thẩm định, lọ xác định lần Việc đánh giá độ đồng trình đóng lọ dựa hướng dẫn ISO 34:2009(4) Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm Tạp D sau đóng gói đánh giá đồng lọ đạt yêu cầu lấy mẫu ngẫu nhiên tiến hành xác định độ tinh khiết ba phịng thí nghiệm độc lập Các phịng thí nghiệm lựa chọn để gửi mẫu phải đạt GLP ISO/IEC 17025 Mỗi phịng thí nghiệm nhận sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo qui trình phân tích tài liệu liên quan Trước phân tích, phịng thí nghiệm kiểm tra tính phù hợp hệ thống với yêu cầu hệ số bất đối pic tạp D nằm khoảng 0,8 – 1,5 RSD lần đo lặp lại không 2% Nếu đạt yêu cầu, tiến hành xác định độ tinh khiết tạp D mẫu nhận, mẫu 109 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 xác định lần Các phịng thí nghiệm lựa chọn để gửi mẫu Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu (PTN1), Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm (PTN2), Khoa Nghiên cứu Phát triển (PTN3) thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Việc đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm thực phép phân tích phương sai yếu tố ANOVA Xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo Việc xác định giá trị ấn định phiếu kiểm nghiệm tạp D độ không đảm bảo đo thực theo hướng dẫn ISO 13528:2005(5), dựa theo 18 kết xác định độ tinh khiết tạp D phịng thí nghiệm KẾT QUẢ Tổng hợp Sản phẩm sau tổng hợp thu 0,84 g (2,11 mmol) bột có màu trắng ngà, có mùi nhẹ Hiệu suất tổng hợp 87,9% Tinh chế Sản phẩm tổng hợp đem tinh chế phương pháp kết tinh lại MeOH Hiệu suất trình tinh chế 65,4% Kết từ 1,0 g (2,40 mmol) nguyên liệu Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế Phổ MS m/z: [M+H]+ tìm thấy: 399,2132 ([M+H]+ dự kiến: 399,2284) Phổ FT-IR cho đỉnh hấp thụ phù hợp với công thức cấu tạo ramipril diketopiperazin: νmax (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 2944 (2945, C-H sp3), 1735 (1736, -O-C=O), 1659 (1660, -NC=O), 1415 (1415, C-O-), 1314 (1314, N-C-H), 1250 (1251, C-N amin bậc 3), 750 700 (751 701, nhân thơm mono) Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,29 – 7,83 (m, 2H, H3, H5); 7,16 – 7,27 (m, 3H, H1, H2, H6); 4,25 (m, 1H, H28); 4,21 (m, 1H, H25); 4,04 – 4,18 (m, 3H, H24, H33); 3,99 (m, 1H, H30); 2,59 – 2,65 (m, 2H, H7); 2,17 – 2,32 (m, 4H, H8, H18); 1,47 – 1,71 (m, 7H, H19, H20, H21, H29); 1,29 (d, J = 7, 3H, H27); 1,03 (t, J =7 , 3H, H34); phù hợp liệu phổ 1H NMR LGC Standard(6) Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 169,99 (C26); 168,21 (C12); 166,27 (C15); 141,31 (C4); 128,30 (C2, C6); 128,1 (C3, C5); 125,83 (C1); 62,25 (C16); 60,23 (C9); 59,20 (C14); 56,34 (C33); 55,71 (C11); 39,00 (C17); 33,11 (C7); 31,45 (C21); 31,67 (C18); 30,87 (C19); 29,7 (C8); 23,13 (C20); 15,19 (C27); 13,83 (C34) Từ kết kết luận sản phẩm tinh chế tạp D (ramipril diketopiperazin), công thức phân tử: C23H30N2O4 ramipril tiến hành tổng hợp theo sơ đồ tinh chế phương pháp kết tinh lại MeOH thu khoảng 0,55 g (1,38 mmol) sản phẩm tinh thể màu trắng Hiệu suất tồn q trình tổng hợp tinh chế 57,5% Thử sơ tinh khiết sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế đo nhiệt độ nóng chảy lần Khoảng nhiệt độ nóng chảy đo 121 – 122 oC, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy Hình Ramipril diketopiperazin (tạp D ramipril) tạp D tài liệu tham khảo Kết Xác định độ tinh khi0ết tạp D bằng HPLC-PDA khai triển SKLM ba hệ dung mơi có độ phân Quy trình xác định độ tinh khiết tạp D thẩm định tiêu: Tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại độ xác trung gian (6) cực khác cho thấy sản phẩm cho vết Sơ kết luận sản phẩm tinh chế đạt tinh khiết SKLM 110 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Tính phù hợp hệ thống Tính phù hợp hệ thống xác định cách tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch tạp D 300 ppm Kết trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống (n = 6) Giá trị thống kê tR (phút) S (µV x giây) Trung bình RSD 9,005 0,244 4138178 0,764 T N 1,3 23398 1,551 RSD thông số thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) số đĩa lý thuyết (N) nhỏ 2%, hệ số kéo đuôi (T) khoảng 0,8 – 1,5, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Kết khảo sát tính đặc hiệu (Hình 3) cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic có Nghiên cứu thời gian lưu tương đương với thời gian lưu pic tạp D sắc ký đồ mẫu thử Sắc ký đồ mẫu phân hủy HCl 0,1N; NaOH 0,1N; H2O2 3%, sấy 80 oC 24h, UV 254 nm ánh sáng mặt trời có xuất pic phân hủy, pic tách hoàn toàn với pic tạp D Pic tạp D sắc ký đồ mẫu trước sau phân hủy tinh khiết Như quy trình xác định độ tinh khiết tạp D có tính đặc hiệu cao Khoảng tuyến tính Phương trình biểu diễn tương quan diện tích pic theo nồng độ phân tích tạp D bước sóng 210 nm ŷ = 19426x, hệ số tương quan R = 0,9999; khoảng tuyến tính 50 – 500 ppm Hình Kết khảo sát tính đặc hiệu B - Khoa học Dược 111 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Đợ xác Độ lặp lại: Tiến hành với mẫu thử tạp D Kết cho thấy quy trình phân tích có độ lặp lại tốt với giá trị độ tinh khiết sắc ký tạp D trung bình 99,76%, RSD 0,59% Độ xác trung gian: Giá trị trung bình độ tinh khiết tạp D ngày 99,76%, RSD 0,59% Giá trị trung bình độ tinh khiết tạp D ngày 99,93%, RSD 0,18% Kết giá trị trung bình độ tinh khiết hai ngày (n=12) 99,81%, RSD 0,16% Độ sai khác kết độ tinh khiết tạp D hai ngày 0,17%