Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS VŨ NGỌC ÚT TS PHẠM ANH TUẤN NĂM 2020 i TÓM TẮT Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng nhiều quốc gia nuôi tôm thế giới, đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này Tác nhân gây AHPND là một số chủng Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB gây hoại tử gan tụy cấp Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp có tính đối kháng mạnh với V parahaemolyticus để phòng chống AHPND nuôi tôm công nghiệp Để đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp đã được phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học cảm nhiễm tôm, 12 chủng V parahaemolyticus đã được xác định, đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân gây AHPND Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng Bacillus sp Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B subtilis (11 chủng), B velezensis (8 chủng), B siamensis (5 chủng) và B licheniformis (2 chủng) Tiếp đó, phương pháp khuếch tán đĩa thạch đã được sử dụng để phân lập hai chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây AHPND Ngoài khả tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rộng về nhiệt độ, pH và độ mặn Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 106 cfu/mL Khi thử nghiệm mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt là 85,56% và 76,67% Ở quy mô 1000 lít khoảng thời gian theo dõi đến 35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B subtilis BRB2.1 không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm Khả đối kháng của chủng B subtilis BRB2.1 có thể liên quan đến sự có mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng Do tính an toàn của B subtilis đã được công nhận nên chủng B subtilis BRB2.1 có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND nuôi tôm nước lợ ii ABSTRACT Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam) The causative agent of AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps To this end, we have isolated 149 presumptive Bacillus sp isolates and 51 Vibrio sp isolates from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces By detecting toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to be the direct cause of AHPND Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26 Bacillus isolates The results showed major clusters, corresponding to Bacillus species, namely B subtilis (11 isolates), B velezensis (8 isolates), B siamensis (5 isolates) B licheniformis (2 isolates) Additionally, agar diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B subtilis BRB2.1 and B siamensis BĐK2.3 to V parahaemolyticus (including strain BĐB1.4v causing AHPND) These two Bacillus isolates could not only secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity Results showed that when inoculated at 106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V parahaemolyticus BĐB1.4v When tested on Litopenaeus vannamei cultured in tanks of 100L, B subtilis BRB2.1 and B siamensis BĐK2.3 strains were proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates) In larger model (1000L), B subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate The antagonistic activity to V parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin Since B subtilis is considered as GRAS, B subtilis BRB2.1 could be used directly to produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming iii iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii CAM KẾT KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu 1.5 Tính mới của luận án: 1.6 Thời gian thực hiện Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát trạng nuôi tôm sú tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) 2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ thế giới 2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam 2.2 Tình hình dịch AHPND tôm nuôi thế giới và Việt Nam 2.3 Tác nhân gây AHPND tôm nuôi 2.4 Chẩn đoán AHPND và biện pháp phịng, trị bệnh tơm ni 2.4.1 Chẩn đoán AHPND 2.4.2 Phịng chớng AHPND ở tôm nuôi 2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 12 2.5.1 Đặc tính chủng V parahaemolyticus 12 2.5.2 Các độc tố của V parahaemolyticus 14 2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V parahaemolyticus 18 2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18 2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH 18 2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn 18 2.6 Khái quát chung Bacillus subtilis 19 2.6.1 Sơ lược về B subtilis 19 2.6.2 Ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của B subtilis 20 2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống 22 2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử 22 2.6.5 Ứng dụng của B subtilis công nghiệp nuôi trồng thủy sản 26 2.7 Bacteriocin 29 2.7.1 Khái niệm 29 2.7.2 Phân loại Bacteriocin 31 2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus thủy sản 31 v 2.7.4 Subtilosin A 33 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 35 3.2 Phương pháp nghiên cứu 35 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 36 3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp và xác định V parahaemolyticus từ ao nuôi tôm 37 3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở chủng Vibrio sp phân lập được 37 3.2.3.1 pirA 39 3.2.3.2 pirB 39 3.2.3.3 toxR 39 3.2.3.4 tdh 40 3.2.3.5 trh 40 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V parahaemolyticus 40 3.2.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 41 3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 41 3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm 41 3.2.6 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp 42 3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính đới kháng V parahaemolyticus 42 3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính protease cao 42 3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính amylase cao 42 3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính cellulase cao 43 3.2.7 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus 43 3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 43 3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 43 3.2.8.2 PCR khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 44 3.2.8.3 Tách dòng giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 44 3.2.8.4 Xây dựng phả hệ trình tự nucleotide trình tự axít amin của subtilosin A 44 3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp phân lập được 45 3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trình tự 16S rDNA 45 3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa phân tích MLST 46 3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp 47 vi 3.2.11 Kiểm tra khả gây AHPND của chủng V parahaemolyticus BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v TTCT 48 3.2.12 Nghiên cứu đợc tính của chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v tôm 49 3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp ở quy mô phòng thí nghiệm 50 3.2.13.1 Lựa chọn chủng Bacillus sp có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus hoạt tính enzyme ngoại bào cao 50 3.2.13.2 Khảo sát khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus của chủng vi khuẩn Bacillus sp hệ thống bể nuôi tôm 100 lít 51 3.2.14 Phương pháp khảo sát khả kháng vi khuẩn Vibrio của chủng vi kh̉n Bacillus hệ thớng bể ni tơm 1000 lít 52 3.2.14.1 Bớ trí thí nghiêm: 52 3.2.14.2 Phương thức thực hiện: 52 3.2.14.3 Cho ăn và quản lý 52 3.2.14.4 Các tiêu theo dõi 53 3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu 53 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 54 4.1 Phân lập chủng thuộc chi Vibrio ao nuôi tôm công nghiệp 54 4.2 Kết phát gen độc lực chủng Vibrio sp phân lập bằng PCR 55 4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V parahaemolyticus 55 4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh 58 4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh 59 4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA 60 4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB 60 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển V parahaemolyticus 62 4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 62 4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 63 4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus BĐB1.4v 64 4.4 Phân lập chủng thuộc chi Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh học ứng dụng ni tôm công nghiệp 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính đới kháng V parahaemolyticus 67 4.5.2 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính sinh protease cao 68 4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh amylase cao 69 4.5.4 Tuyển chọn chủng vi kh̉n Bacillus sp có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt gen mã hóa bacteriocin chủng BRB2.1 72 4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 72 4.6.2 Xây dựng phả hệ so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 75 vii 4.6.2.1 Xây dựng phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng BRB2.1 75 4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A 76 4.6.3 Xây dựng phả hệ so sánh trình tự nucleotide gen sboA chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu 77 4.6.3.1 Xây dựng phả hệ trình tự nucleotide gen sboA 77 4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA 77 4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST 78 4.7.1 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA 78 4.7.2 Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST 79 4.8 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sự phát triển chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 85 4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 85 4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 86 4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 86 4.9 Kiểm tra khả gây AHPND chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v TTCT 87 4.10 Nghiên cứu độc tính chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v tôm 89 4.11 Thử nghiệm tính đối kháng Bacillus sp với V parahaemolyticus BĐB1.4v quy mơ phịng thí nghiệm 91 4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 đối với chủng V parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND môi trường nước nuôi tôm 91 4.11.2 Thử nghiệm khả phòng chống AHPND của chủng B subtilis BRB2.1 và B siamensis BĐK2.3 thùng nuôi 100 Lít 93 4.12 Thử nghiệm khả bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V parahaemolyticus gây bệnh AHPND quy mơ ni 1000 lít 95 4.12.1 Sự biến động của các tiêu môi trường quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio quá trình thử nghiệm 97 4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm quá trình thử nghiệm 99 Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT 101 5.1 Kết luận 101 5.2 Đề xuất 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 128 PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 149 PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN LẬP 150 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA 161 viii BRK 5.4 BRK 6.1 BRK 7.3 BDK 2.3 BDK 9.2 BNK 2.2 BNK 2.3 BNK 7.1 BNK 8.1 B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% B subtilis NR_102783.2 99.7% B vallismortis NR_024696.1 99.6% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_112725.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_112725.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B subtilis NR_102783.2 99.8% B vallismortis NR_024696.1 99.7% B subtilis NR_113265.1 100.0% B tequilensis NR_104919.1 99.9% B mojavensis NR_118290.1 99.8% B halotolerans NR_115063.1 99.8% B velezensis NR_075005.2 99.8% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.7% B subtilis NR_102783.2 99.6% B nakamurai NR_151897.1 99.5% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.8% B velezensis NR_116240.1 99.7% B siamensis NR_117274.1 99.7% B subtilis NR_102783.2 99.6% B velezensis NR_116240.1 99.9% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B subtilis NR_102783.2 99.8% B vallismortis NR_024696.1 99.7% B amyloliquefaciens NR_117946.1 99.9% B velezensis NR_116240.1 99.9% 163 B subtilis NR_102783.2 99.7% B siamensis NR_117274.1 99.7% PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ E1: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn Vibrio Bảng E1.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 243.206 48.6412 Within groups 0.280067 12 0.0233389 Total (Corr.) 243.486 17 2084.13 Bảng E1.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 10 1.17 X 20 8.23 X 26 8.21 X 30 8.55333 37 8.39 45 X XX X Bảng E1.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt đợ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 247.43 49.4859 1877.63 0.0000 Within groups 0.316267 12 0.0263556 Total (Corr.) 247.746 17 Bảng E1.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Nhiet Count Mean Homogeneous Groups 10 1.30667 X 20 8.42667 X 26 8.43333 X 164 30 8.46 X 37 8.58667 X 45 X Bảng E1.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 131.741 32.9353 371.79 0.0000 Within groups 0.885867 10 0.0885867 Total (Corr.) 132.627 14 Bảng E1.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h pH Count Mean Homogeneous Groups X 7.32 X 7.60667 X 7.5 7.37 X 7.32 X Bảng E1.7: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 157.273 39.3183 0.0000 Within groups 0.516867 10 0.0516867 Total (Corr.) 157.79 14 760.71 Bảng E1.8: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h pH Count Mean Homogeneous Groups X 7.52667 X 8.12 XX 7.5 8.18 XX 8.42 XX Bảng E1.9: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h 165 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 274.324 54.8649 0.0000 Within groups 0.334533 12 0.0278778 Total (Corr.) 274.659 17 1968.05 Bảng E1.10: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 24 h NaCl Count Mean Homogeneous Groups X X 10 0.3 20 7.46333 30 8.11 X 40 8.10667 X X X Bảng E1.11: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 301.481 60.2961 1243.50 0.0000 Within groups 0.581867 12 0.0484889 Total (Corr.) 302.063 17 Bảng E1.12: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Vibrio sau 48 h NaCl Count Mean Homogeneous Groups X X 10 0.566667 20 8.39333 X 30 8.44667 X 40 8.25333 X X E2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp Bảng E2.1: Phân tích ANOVA về khả đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp Source Sum of Squares Df Between groups 590.667 29 Mean Square F-Ratio P-Value 20.3678 0.0000 166 32.73 Within groups 37.3333 60 Total (Corr.) 628.0 89 0.622222 Bảng E2.2: Kiểm định LSD về khả đối kháng của Bacillus sp với Vibrio sp Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups BNB11.1-BDB1.4v 4.33333 X BNB11.1-CNB6v 4.33333 X BNB11.1-BDB1.3v 5.0 XXX BNB11.1-BNB3.1v 7.33333 XXX BNB11.1-BDB1.1v 8.33333 XX BNK6.1-BDB1.3v 4.66667 XX BNK6.1-BDB1.4v 5.0 XXX BNK6.1-CNB6v 5.66667 XXX BNK6.1-BNB3.1v 8.66667 XX BNK6.1-BDB1.1v 9.66667 XX BRK4.4-CNB6v 5.0 XXX BRK4.4-BDB1.3v 5.33333 XXX BRK4.4-BDB1.4v 6.0 XXX BRK4.4-BDB1.1v 6.66667 XXX BRK4.4-BNB3.1v 7.0 XXX BNK7.1-CNB6v 6.66667 XXX BNK7.1-BDB1.3v 7.0 XXX BNK7.1-BNB3.1v 7.33333 XXX BNK7.1-BDB1.4v 8.0 XXX BNK7.1-BDB1.1v 8.33333 XX BRB2.1-CNB6v 8.66667 XX BRB2.1-BDB1.3v 9.0 XX BRB2.1-BDB1.1v 11.3333 XXX BRB2.1-BNB3.1v 11.6667 XX BRB2.1-BDB1.4v 13.3333 X 167 Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-BDB1.3v 10.3333 XX BĐK2.3-BNB3.1v 10.6667 XXX BĐK2.3-CNB6v 11.0 XXX BĐK2.3-BDB1.1v 11.6667 XX BĐK2.3-BDB1.4v 12.0 X E3: Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn Bacillus Bảng E3.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups Total (Corr.) 0.903533 2.60433 3.50787 0.301178 0.325542 0.4716 11 0.93 Bảng E3.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc BĐK 2.3-26oC BĐK 2.3-30oC BĐK 2.3-37oC BĐK 2.3-40oC BRR 2.1-26oC BRR 2.1-30oC BRR 2.1-37oC BRB 2.1-40oC Count 3 3 3 3 Mean 9.39 9.46 9.57 9.51 9.32 9.39 9.55 9.49 Homogeneous Groups X X X X X X X X Bảng E3.3: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.20483 0.0227589 6.50 0.0003 Within groups 0.07 20 0.0035 Total (Corr.) 0.27483 29 Bảng E3.4: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h NT pH Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-4 9.1 X BĐK2.3-5 9.13667 XX BĐK2.3-6 9.20333 XX 168 NT pH Count Mean Homogeneous Groups BĐK2.3-7 9.32667 BĐK2.3-8 9.14 BRB2.1-4 9.22 XX BRB2.1-5 9.20333 XX BRB2.1-6 9.25667 XX BRB2.1-7 9.36 BRB2.1-8 9.12333 XX XX X XX Bảng E3.5: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của đợ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1.47538 1.73387 3.20925 Df 12 17 Mean Square 0.295077 0.144489 F-Ratio 2.04 P-Value 0.1443 Bảng E3.6: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ mặn đến mật số vi khuẩn Bacillus sau 24 h Nghiem thuc BRB 2.1-0‰ BRB 2.1-5‰ BRB 2.1-20‰ BRB 2.1-40‰ BĐK 2.3-0‰ BĐK 2.3-5‰ BĐK 2.320‰ BĐK 2.340‰ Count 3 3 3 Mean 9.12 9.07 9.15 9.12 9.03 8.96 9.01 Homogeneous Groups X X X X X X X 9.05 X E4: Khảo sát ảnh hưởng chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ theo thời gian Bảng E4.1: Phân tích ANOVA về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 23538.5 4707.7 Within groups 251.948 12 20.9957 Total (Corr.) 23790.4 17 224.22 P-Value 0.0000 Bảng E4.2: Kiểm định LSD về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Vibrio đến tôm thẻ ở thời gian 36 h Vibrio Count BĐB 1.3v Mean 3.33333 Homogeneous Groups X 169 BĐB 1.4v 100.0 BNB 3.1v 3.33333 X BRB 1.1v 6.66667 X CĐB 6v 2.22 X DC X X E5: Khảo sát khả kháng vi khuẩn Vibrio chủng vi khuẩn Bảng E5.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36 h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 17575.1 4393.76 0.0000 Within groups 178.607 10 17.8607 Total (Corr.) 17753.7 14 246.00 Bảng E5.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức tại thời điểm 36h NT Count Mean Homogeneous Groups BĐB1.4v X BRB2.1-BĐK23-BĐB1.4v 64.44 X BĐK23-BĐB1.4v 76.67 X BRB2.1-BĐB1.4v 85.56 DC 97.78 X X E6: Khả át chế Bacillus sp Vibrio Parahaemolyticus ảnh hưởng lên sự phát triển tôm thẻ Bảng E6.1: Phân tích ANOVA về tỉ lệ sớng của tơm thẻ tại thời điểm 35 ngày Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 11817.7 5908.86 Within groups 64.6667 10.7778 Total (Corr.) 11882.4 548.24 Bảng E6.2: Kiểm định LSD về tỉ lệ sống của tôm thẻ tại thời điểm 35 ngày NT Count Mean Homogeneous Groups D2 X 170 D1 55.0 D3 87.8333 X X Bảng E6.3: Phân tích ANOVA về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.00242 1.50121 Within groups 0.00633333 0.00105556 Total (Corr.) 3.00876 1422.20 0.0000 Bảng E6.4: Kiểm định LSD về hệ số chuyển đổi thức ăn FCR sau 35 ngày nuôi NT Count Mean Homogeneous Groups D2 X D3 1.10667 D1 1.31667 X X PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM 171 Kiểm tra các yếu tố môi trường nước 172 Lấy mẫu gan tụy và ruột tôm kiểm tra mật số vi khuẩn Vibrio ban đầu Cố định mẫu tôm dung dịch cờn và Davidson’s 173 Hệ thống thí nghiệm 100 lít 174 175 Hệ thống thí nghiệm 1000 lít 176 THÔNG TIN TỔNG QUÁT Họ tên Nghiên cứu sinh: Lê Thế Xuân Ngày tháng năm sinh: 19/5/1976 Giới tính: Nam Nơi sinh: Thanh Hóa Điện thoại: 0918039764 Đơn vị công tác: Công ty TNHH SX & TM Trúc Anh Địa hiện nay: Công Điền, Vĩnh Trạch, Bạc Liêu Tốt nghiệp Đại học ngành: Nuôi trồng thủy sản Năm:1999 Tại: Đại học Nha Trang Tốt nghiệp Thạc sĩ ngành: Công nghệ sinh học Năm: 2012 Tại: Đại học Bách khoa Hà Nội 177 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301... thông qua vi? ?̣c kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al., 2012) Đề tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp đối kháng với Vibrio parahaemolyticus nuôi tôm công nghiệp? ??... chi Bacillus ao nuôi tôm công nghiệp 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh học ứng dụng nuôi tôm công nghiệp 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus