Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 62620301 LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillius sp ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio Parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP Cần Thơ, 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI Người hướng dẫn chính: PGS.TS Vũ Ngọc Út Người hướng dẫn phụ: TS Phạm Anh Tuấn Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc ngày tháng năm 20 Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm học liệu Trường Đại học Cần Thơ Thư viện quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ Lê Thế Xn, Phạm Anh Tuấn Vũ Ngọc Út 2018 Ảnh hưởng yếu tố môi trường tới phát triển vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus BĐB1.4v Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn, 9:81-86 Lê Thế Xuân, Khuất Hữu Thanh, Phạm Tiến Dũng, Lê Quang Hòa, Phạm Anh Tuấn Vũ Ngọc Út 2018 Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa subtilosin A từ chủng Bacillus subtilis phân lập từ ao ni tơm cơng nghiệp Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn, 20: 89-95 Lê Thế Xuân, Phạm Anh Tuấn Vũ Ngọc Út 2019 Đánh giá hiệu ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus BĐB1.4v gây bệnh tơm Bacillus subtilis Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 1:79-87 Xuan The Le, Dung Tien Pham, Tuan Anh Pham, Tung Thanh Tran, Thanh Huu Khuat, Hoa Quang Le, Ut Ngoc Vu Exploration of genetic diversity of Bacillus spp from industrial shrimp ponds in Vietnam by Multi-Locus Sequence Typing Fisheries and Aquatic Sciences 22(1), 17 doi:10.1186/s41240-0190132-5 Fisheries and Aquatic Sciences 22(1), 17 doi:10.1186/s41240-019-0132-5 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Theo Hiệp hội Chế biến Xuất Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2012, sản lượng tôm nước lợ xuất thiếu hụt nghiêm trọng tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, đặc biệt xuất hội chứng tôm chết sớm (EMS hay Early Mortality Syndrome) hay gọi bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis) (Lightner et al., 2012) Dịch bắt đầu xuất vùng Đồng Sông Cửu Long (ĐBSCL) vào năm 2010, bùng phát diện rộng vào năm 2011, gây thiệt hại tập trung tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre Đến năm 2012, dịch lây lan hầu hết vùng nuôi tôm trọng điểm Việt Nam Tác nhân gây AHPND xác định số chủng Vibrio parahaemolyticus có khả tiết độc tố nhị thể PirA/PirB gây tác động trực tiếp lên hệ thống gan tụy tơm (Tran et al., 2013) Để kiểm sốt dịch bệnh tơm nước lợ nói chung, AHPND nói riêng, số chủng Bacillus sử dụng làm tác nhân đối kháng, ví dụ, chủng B subtilis UTM 126 (Balcázar et al., 2007) Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp đối kháng với Vibrio parahaemolyticus ni tơm cơng nghiệp” thực nhằm tìm kiếm giải pháp hạn chế phát triển vi khuẩn, hạn chế dịch AHPND, đóng góp giải pháp ni tôm công nghiệp hiệu bền vững Mục tiêu đề tài - Phân lập, lựa chọn đánh giá chủng Bacillus sp đối kháng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi - Đánh giá xác định đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn Bacillus sp ao nuôi tôm sú/tôm thẻ thâm canh Nội dung nghiên cứu đề tài - Phân lập chủng V parahaemolyticus từ ao nuôi tôm công nghiệp nghiên cứu gen độc lực chủng Vibrio sp PCR - Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến phát triển chủng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp - Phân lập chủng Bacillus sp từ ao ni tơm cơng nghiệp đánh giá tính đối kháng với vi khuẩn V parahaemolyticus, khả sinh enzyme thủy phân chủng phân lập xác định gen mã hóa bacteriocin chủng có hoạt tính đối kháng cao - Xác định đa dạng di truyền nhóm Bacillus sp ao ni tơm cơng nghiệp - Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến phát triển chủng Bacillus sp có hoạt tính đối kháng cao - Thử nghiệm khả phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ chân trắng (L vannamei) vi khuẩn Bacillus sp qui mơ phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học, thực tiễn đề tài Kết luận án góp phần bổ sung sở khoa học thực tiễn đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn Bacillus sp khả đối kháng Bacillus sp V parahaemolyticus ao ni tơm nước lợ cơng nghiệp; tìm kiếm giải pháp ức chế phát triển V parahaemolyticus gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp nuôi tôm cơng nghiệp Kết luận án góp phần vào giải pháp nuôi tôm công nghiệp bền vững theo hướng phòng chống bệnh Hoại tử gan tụy cấp giải pháp sinh học Tính luận án Luận án phân lập hai chủng B subtilis BRB2.1 B siamensis BĐK2.3 có khả đối kháng mạnh với V parahaemolyticus bao gồm chủng gây AHPND Lần luận án ứng dụng thành công phương pháp MLST để phân loại Bacillus sp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch AHPND Thế giới Việt Nam Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) thường diễn giai đoạn đầu nuôi tôm nước lợ với khả gây thiệt hại lên đến 100% vịng 20-30 ngày sau thả ni Tơm bị bệnh có gan tụy sưng teo, trắng nhạt; vỏ mềm, tăng trưởng chậm, chết tôm chìm xuống đáy ao (Lightner et al., 2012) Dịch AHPND khởi phát Trung Quốc vào năm 2010 lan rộng số quốc gia nuôi tôm Đông Nam Á, có Việt Nam Trong năm 2012, tổng diện tích tơm nước lợ bị ảnh hưởng AHPND lên tới gần 100000 tổng diện tích nuôi 657.523 (Tổng cục Thủy sản, 2012) 1.2 Tác nhân gây AHPND tôm nuôi Tác nhân gây AHPND số chủng V parahaemolyticus có khả sinh độc tố PirA/PirB (Loc Tran et al., 2013; Yang et al., 2014) Các độc tố mã hóa gen pirA/pirB nằm plasmid pVA1 1.3 Chẩn đốn AHPND biện pháp phịng chống Bệnh hoại tử gan tụy cấp tơm ni chẩn đốn thơng qua phân tích mơ học (quan sát mơ gan tụy) phát gen mã hóa độc tố kỹ thuật PCR Khi quan sát ống gan tụy tơm bệnh, thấy mơ gan tụy bị bong tróc thành hạt hình trịn lòng ống, phản ứng viêm, nhiễm trùng thứ cấp (Nunan et al., 2014) Các phương pháp PCR khuếch đại đẳng nhiệt LAMP phát PirA/PirB thường có độ nhạy cao, mà không cần đến bước làm giàu vi khuẩn (Han et al., 2015; Sirikharin et al., 2015) AHPND điều trị kháng sinh (Wang et al., 2018) Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh kéo theo vấn đề: (i) tồn dư kháng sinh sản phẩm, (ii) làm phát sinh chủng kháng kháng sinh (Han et al., 2015) Do đó, chế phẩm probiotic gần sử dụng phổ biến ni tơm nước lợ Hoạt tính kháng khuẩn loại probiotic gắn liền với khả tiết enzyme phân giải, bacteriocins, H2O2, axít hữu mạch ngắn (Loh, 2017; Tinh, 2007) Wang et al (2018) phân lập hai chủng Pseudoalteromonas CDM8 CDA22 có khả phịng chống AHPND Ưu điểm giải pháp probiotic có giá thành thấp, an tồn mơi trường có hiệu bền vững (Kuebutornye et al., 2019) 1.4 Vi khuẩn Bacillus ứng dụng nuôi trồng thủy sản Hiện nay, xu hướng sử dụng Bacillus chế phẩm probiotic cho thủy sản ngày phổ biến Ưu điểm việc sử dụng Bacillus khả tạo chất diệt khuẩn, tạo bào tử giúp chúng sống sót điều kiện môi trường khắc nghiệt, không gây bệnh cho thủy sản, tiết enzyme phân giải giúp cải thiện điều kiện môi trường (Kuebutornye et al., 2019) Một số chủng Bacillus sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn Gram dương Gram âm, nấm Vi khuẩn B subtilis chứng minh tạo loạt bacteriocin Subtilin, Subtilosin A, ericin S ericin A (Teixeira et al., 2013) 1.5 Phân loại Bacillus theo phương pháp phân tử Giải trình tự gen 16S rDNA phương pháp định tên vi khuẩn phổ biển tính đơn giản Tuy nhiên, phương pháp khơng cho phép phân biệt lồi có quan hệ gần gũi với nhau, đặc biệt loài thuộc chi Bacillus trình tự có độ tương đồng cao (Rooney et al., 2009) Để giải vấn đề này, cách tiếp cận phương pháp MLST hay Multilocus Sequence Typing, với nguyên tắc sử dụng trình tự nhiều gen cấu trúc gen liên quan đến đặc tính gây bệnh để phân loại chủng vi khuẩn, cho phép định týp chủng vi khuẩn thuộc loài (Maiden, 2006) Với việc sử dụng bảy gen cấu trúc ilvD, ptA, purH, pycA, glpF, rpoD, tpiA, MLST sử dụng thành công để phân loại chủng thuộc nhóm B cereus, bao gồm B cereus, B thuringiensis, B weihenstephanensis B anthracis (Helgason et al., 2004) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu nghiên cứu Mẫu thu 15 ao ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng Cà Mau khoảng thời gian từ tháng 9/2013 đến tháng 9/2015 Tổng cộng có 27 mẫu nước, 27 mẫu bùn, 27 mẫu ruột tôm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus Vibrio parahaemolyticus Bacillus sp phân lập môi trường thạch dinh dưỡng sau xử lý nhiệt 80oC để loại bỏ tế bào sinh dưỡng Vibrio sp phân lập môi trường TCBS 2.2.2 Phương pháp phát gen độc tố chủng Vibrio sp phân lập được Việc phát gen độc tố toxR, pirA, pirB, tdh, trh V parahaemolyticus thực theo Kim et al (1999), Han et al (2015) Bej et al., 1999 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, pH, độ mặn đến phát triển V parahaemolyticus Sự phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus khoảng nhiệt độ 26-37oC, pH 5,0-8,0, độ mặn 0-40 ‰ khảo sát Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy trải lên đĩa thạch TCBS số khuẩn lạc đếm sau 24 48h 2.2.4 Phương pháp tuyển chọn chủng Bacillus sp 2.2.4.1 Tuyển chọn chủng Bacillus sp có hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus Hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus xác định phương pháp đục lỗ khuếch tán môi trường thạch theo Bauer et al (1959) 2.2.4.2 Tuyển chọn chủng Bacillus sp có hoạt tính protease cao Khả sinh protease chủng Bacillus xác định môi trường thạch SM (Himedia) 2.2.4.3 Tuyển chọn chủng Bacillus sp có hoạt tính amylase cao Khả sinh amylase chủng Bacillus xác định môi trường Starch Agar (Himedia) 2.2.4.4 Tuyển chọn chủng Bacillus sp có hoạt tính cellulase cao Khả sinh cellulase xác định mơi trường thạch TB có bổ sung 0,5% CMC (Carboxy Methyl Cellulose), 3% NaCl 2.2.4.5 Tách chiết tinh DNA hệ gen Bacillus DNA hệ gen (genomic DNA) chủng Bacillus tách chiết sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) 2.2.5 Phương pháp phát tách dịng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 2.2.5.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 Cặp mồi khuếch đại gen spaS sboA thiết kế chương trình Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer30.4.0/) dựa trình tự gen spaS chủng B subtilis ATCC 6633 (mã hiệu GenBank: M83944.1) trình tự gen sboA chủng B subtilis 168 (mã hiệu GenBank: NC_000964.3) 2.2.5.2 PCR khuếch đại gen spaS sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 hai Gen spaS sboA khuếch đại PCR với cặp mồi: (i) Subtilin-F (5’6 nhiễm, 4, 7, 10, 16, 23, 27, 31 ngày sau cảm nhiễm xác định phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường TCBS NA Tỉ lệ sống tôm theo dõi theo thời gian hệ số chuyển đổi thức ăn tính tốn 2.2.13 Phương pháp xử lý liệu Giá trị thể bảng kết giá trị trung bình±độ lệch chuẩn Các giá trị hàng có mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p