QUY TRÌNH sản XUẤT VACCINE bại LIỆT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG =====***===== 1959 BÁO CÁO: MÔN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE CHỦ ĐỀ: QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE BẠI LIỆT GVHD: Th.s Văn Hồng Cầm NHÓM: 10 LỚP: 55SH Nha Trang / / 2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bại liệt virus Polio bệnh nhiễm khuẩn cấp tính nguy hiểm trẻ em Bệnh gây hậu liệt vận động để lại di chứng suốt đời, đặc biệt nghiêm trọng gây liệt hơ hấp đe dọa tới tính mạng Để ngăn chặn bệnh bại liệt, biện pháp dự phòng đặc hiệu sử dụng vaccine bại liệt có loại vaccine phòng bệnh bại liệt vaccine bất hoạt Salk (IPV) vaccine uống giảm độc lực Sabin (OPV) Vaccine Sabin kích thích thể tạo nên miễn dịch chỗ miễn dịch dịch thể Tuy nhiên, dùng vaccine Sabin có nhược điểm chủng Sabin tạo từ chủng hoang dại làm giảm độc lực nên trình phát triển tự nhiên, virus Sabin gây đột biến có xu hướng trở cội nguồn nó, có độc lực đặc biệt typ Vaccine IPV gây miễn dịch dịch thể, ngăn ngừa virus xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương Vaccine virus bại liệt bị bất hoạt nên phối hợp với OPV để phòng bệnh bại liệt Trong q trình toán bệnh bại liệt việc sử dụng vaccine sống giảm độc lực Sabin thích hợp hiệu Đến nay, Việt Nam bệnh bại liệt toán từ năm 2000 song chưa cần thiết cho trẻ sinh uống phòng bệnh bại liệt vaccine OPV Dự kiến Tổ chức Y tế giới đến năm 2005 toán bệnh bại liệt phạm vi toàn cầu, thực tế chưa thể thực Năm 2001, khu vực cơng nhận tốn bại liệt bao gồm: Trung Mỹ, Tây thái bình dương châu Âu, … vùng khác chưa tốn bệnh bại liệt: Tây Á, Đông Nam Á, Trung Đông Nam Phi… Do dịch bại liệt lan tràn sang nước toán bệnh bại liệt Indonexia nước toán bệnh bại liệt năm 2000 virus bại liệt hoang dại từ Trung Phi xâm nhập vào gây ca bại liệt mới, lan thành vụ dịch nhỏ, có tới 300 ca mắc bai liệt virus hoang dại 40 trường hợp có liên quan đến virus vaccine Như để bảo vệ thành toán bệnh bại liệt vơ khó khăn A TỔNG QUAN I Bệnh bại liệt: Nguyên nhân gây bệnh : Bệnh bại liệt (Poliomyelitis) bệnh nhiễm virut cấp tính lây truyền theo đường tiêu hóa virut Polio gây lên, lan truyền thành dịch Bệnh nhận biết qua biểu hội chứng liệt mềm cấp Virut Polio sau vào thể đến hạch bạch huyết, số virut Polio xâm nhập vào hệ thống thần kinh trung ương gây tổn thương tế bào sừng trước tủy sống tế bào thần kinh vận động vỏ não 2 Biểu lâm sàng: - Thể liệt mềm cấp điển hình: Chiếm 1% với triệu chứng sốt, chán ăn, nhức đầu, buồn nôn, đau chi, gáy lưng, vận động dẫn đến liệt không đối xứng Mức độ liệt tối đa liệt tủy sống, liệt hành tủy dẫn đến suy hô hấp tử vong Liệt chi, không hồi phục làm bệnh nhân khó vận động vận động - Thể viêm màng não vô khuẩn: Sốt, nhức đầu, đau cơ, cứng gáy - Thể nhẹ: Sốt, khó ngủ, nhức đầu, buồn nơn, nơn, táo bón, hồi phục vài ngày - Thể ẩn, không rõ triệu chứng thể thường gặp, song thể nhẹ chuyển biến sang nặng Nguồn truyền nhiễm: - Người nguồn chứa nhất, đặc biệt người nhiễm vi rút bại liệt thể ẩn, trẻ em - Nguồn truyền bệnh bệnh nhân thể lâm sàng người lành mang vi rút Họ đào thải nhiều vi rút bại liệt theo phân làm ô nhiễm nguồn nước thực phẩm Vi rút lây truyền sang người chủ yếu qua đường phân – miệng Vi rút bại liệt chủ yếu từ phân ô nhiễm vào nguồn nước, thực phẩm vào người qua đường ruột Cơ thể cảm thụ: - Người có sức thụ bệnh cao với virut bại liệt - Tuổi hay gặp trẻ em 2-8 tuổi, đặc biệt trẻ 2-4 tuổi chiếm tới 60-80% - Trẻ sơ sinh người lớn bị thường khơng điển hình - Bệnh thường tản phát, thành dịch tập thể nhỏ nhà trẻ, trường mẫu giáo, trường phổ thông sở Gặp thành phố nhiều nông thôn hay xảy vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè hàng năm - Sau bị bệnh bại liệt bệnh nhân thường có miễn dịch bền vững, mắc lại Cơ chế bệnh sinh: - Từ xâm nhập vào thể đến vào hệ thần kinh trung ương gây bệnh Triệu chứng lâm sàng điển hình (liệt), virut bại liệt phải hai lần vào máu khu trú số phủ tạng Quá trình diễn biến qua giai đoạn: -  Giai đoạn xâm nhập tăng sinh đường tiêu hoá: Virut vào thể qua hầu, họng 24 đầu đến hạch bạch huyết quanh họng, vào niêm mạc tiểu tràng, mảng Peyer tăng sinh (có thể phân lập virut nhầy họng phân giai đoạn này)  Giai đoạn nội tạng: Từ niêm mạc đường tiêu hoá, virut vào máu (lần 1) sau đến nội tạng (tim, gan, tuỵ, thượng thận, hô hấp ) Tại chúng tiếp tục tăng sinh gây biểu lâm sàng thời kỳ tiền liệt  Giai đoạn xâm nhập tăng sinh thần kinh trung ương: virut từ nội tạng vào máu (lần 2) vào hệ thần kinh trung ương, chủ yếu neuron vận động sừng trước tuỷ sống Đối với thể khơng điển hình (khơng có liệt), virut xâm nhập tới hạch bạch huyết, niêm mạc đường tiêu hoá tới máu mà không vào hệ thần kinh trung ương, sau bị đào thải theo phân ngồi Phân loại bệnh bại liệt: - Bại liệt lịch sử chia thành nhiều loại, tùy thuộc chủ yếu vào phần thể bị ảnh hưởng Phân loại không cứng nhắc, chồng chéo lên xảy số hình thức khác  Bại liệt cột sống: Đây hình thức phổ biến bệnh bại liệt công tế bào thần kinh định (tế bào thần kinh vận động) tủy sống gây tê liệt bắp kiểm soát thở cánh tay chân Đôi tế bào thần kinh bị hư hỏng, trường hợp phục hồi số mức độ chức bắp Nhưng tế bào thần kinh bị phá hủy hoàn toàn, tê liệt đảo ngược, giữ cảm giác  Bệnh bại liệt hành tủy: Virus ảnh hưởng đến tế bào thần kinh vận động não, nơi mà trung tâm dây thần kinh sọ nằm Các dây thần kinh có liên quan đến khả để xem, nghe, ngửi, nếm nuốt Ảnh hưởng đến chuyển động bắp khn mặt gửi tín hiệu đến tim, ruột phổi Hành tủy bệnh bại liệt gây trở ngại với chức đặc biệt có khả ảnh hưởng đến khả để thở, nói nuốt gây tử vong mà không hỗ trợ hô hấp  Bệnh bại liệt bulbospinal : Một kết hợp hai, hành tủy bệnh bại liệt cột sống, hình thức dẫn đến tê liệt chân tay, ảnh hưởng đến thở, nuốt chức tim II Virus Bại Liệt Virut Bại liệt (VRBL) Landsteiner Popper phát năm 1909 sau tiêm dịch tủy sống trẻ bị chết bại liệt não khỉ Hình 1: Virus Polio Phân loại virut: - - Virut Bại liệt có tên virut Polio Là thành viên nhóm virut đường ruột, họ Picornaviridae Virut bại liệt có type kháng nguyên khác không gây miễn dịch chéo  Type I: Điển hình chủng Brunhilde  Type II: Điển hình chủng Lansing  Type III: Điển hình chủng Leon Trong type I nguyên nhân vụ dịch lớn chiếm 80-90% Trong , type II III gặp tùy theo nước vùng địa lí khác Hình thái học vật liệu di truyền: - Virut bại liệt (poliovirus) virut hình cầu 20 mặt, đường kính 30nm, có cấu tạo ARN protein, khơng có màng ngồi Trọng lượng phân tử 6,8 x 10 dalton.Tỷ trọng virut 1,34 g/ cm caseum chloride Bao bọc xung quanh lõi RNA sợi đơn dương vỏ capsid Capsid bao gồm 60 tiểu đơn vị ( Capsome) giống hệt xếp đối xứng, tiểu đơn vị cấu tạo chuỗi polypeptid VP1, VP2, VP3, VP4 Bằng phương pháp hiển vi điện tử siêu cấu trúc người ta biết chi tiết cấu trúc hạt virut hồn chỉnh - Có chủng poliovirus xác định gồm poliovirus tuýp (PV1), tuýp (PV2), tuýp (PV3)— tuýp cần protein capsid khác Cả ba virus độc hại tạo triệu chứng bệnh PV1 dạng phổ biến nhất, có mối quan hệ gần gũi liên quan đến bệnh tê liệt B QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACINE BẠI LIỆT - Sơ đồ tóm tắt quy trình cơng nghệ sản xuất vaccine bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin nghiên cứu ứng dụng quy trình Nhật Bản: Vero đến đời thứ 135 (Ngân hàng tế bào dùng sản xuất - MWCB) Từ lấy để dùng sản xuất Vero 140 + passage dùng sản xuất Ni bình roux Tăng sinh 330C – 33,50C, Gây nhiễm Mẻ gặt đơn Kiểm tra vô trùng Thử nghiệm nhận dạng Mẻ hỗn hợp vaccine Kiểm tra vô trùng Kiểm tra hiệu giá Thử nghiệm nhận dạng Kiểm tra an tồn đặc hiệu Cơ đặc tinh chế vaccine Kiểm tra hiệu giá Kiểm tra độ tinh khiết virus Bất hoạt (Formalin tỷ lệ 1:4000) 37°C/12 ngày Kiểm tra độ bất hoạt Vaccine đơn giá sau bất hoạt Kiểm tra vô trùng Định lượng D- antigen Kiểm tra nhận dạng Sản phẩm vaccine thành phẩm  GIẢI THÍCH QUY TRÌNH SẢN XUẤT: Chủng virut Sabin gồm tuyp Viện bại liệt Nhật Bản cung cấp: - Chủng bại liệt tuyp 1: WHO-IS-90C, chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin ( SO), cấy truyền lần( SO+2) Chủng bại liệt tuyp 2: IIS-90A, Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), cấy chuyền lần (SO+2) Chủng bại liệt tuyp 3:IIS-79A Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), cấy truyền lần (SO) Và lần chọn lọc cách tạo đám hoại tử (SO+3+2 plaque) Chuẩn bị tế bào: - Tế bào thường trực vero: Do Trung tâm Kiểm sốt bệnh tật dự phòng (CDC),Atlanta, Mỹ cung cấp từ đời thức 135 - Tế bào thường trực( vero)  Tế bào gốc nhận từ CDC, đời 135 Từ cấy truyền đến đời 140 ngân hàng tế bào dùng sản xuất (MWCB) Nuôi chai thủy tinh 1,2 lít (250cm2 chai Roux)  Tế bào vero từ nito lỏng lấy ra, nuôi cấy chuyền Dùng trysin-versen tách, dùng mơi trường M199 có 5-10% huyết bào thai bê Một chai thường cấy chuyền thành 4-5 chai Sau 3-4 ngày chọn chai kín lớp gây nhiễm với chủng Sabin tế bào thận khỉ Q trình ni 370C, sử dụng mơi trường nuôi DMEM M199 môi trường gây nhiễm M199 Gây nhiễm virut: - Hỗn dịch: pha môi trường LH3E ( EAGLE glucose cao, M199 glucose cao), theo liều gây nhiễm CCID 50/300 tế bào.Mỗi bình roux có 34 triệu tế bào Thời gian hấp phụ 33 độ C Sau cho thêm đủ 100ml mơi trường trì - Ủ 330C- 33,50C theo dõi hủy hoại tế bào mơi trường thơng thường khoảng  72 Gặt vaccine thô, để riêng rẽ, giữ -20 0C Lọc vô trùng qua hệ thống lọc 3µm/0,45µm/0,22µm Kiểm tra hiệu giá phương pháp vi lượng So Sánh hiệu giá thu từ mơi trường trì khác Lựa chọn loại mơi trường cho hiệu giá cao sử dụng để sản xuất Q trình đặc tinh chế kháng nguyên: - Quá trình cố đặc tinh chế kháng nguyên gồm bước sau: Sinh khối virus Ly tâm 4000 vòng/ phút x 60 phút/ 60c Lọc qua hệ thống màng lọc 3/ 0,45 / 0,22 Sau lọc 5-6h lấy mẫu để kiểm tra hiệu giá Lọc qua hệ thống siêu lọc Vivaflow Kiểm tra hiệu giá virus Cô đặc siêu ly tâm Lọc 0,22 Kiểm tra hiệu giá virus Tinh chế qua cột DEAE Sepharose CL-6B Kiểm tra độ tinh khiết virus Sản phẩm sau tinh chế: kháng nguyên bại liệt tinh a Q trình đặc tinh chế kháng nguyên siêu lọc: - - - - Vacxin thu từ phương pháp sản xuất vacxin bại liệt sống nuôi tĩnh động lấy từ -20oC đông tan lần 3, ly tâm 4000 vòng/phút/1 giờ/6 oC để bỏ cặn tế bào Lấy nước nổi, lọc qua 3μm/0,45μm/0,22μm (lấy mẫu kiểm tra hiệu giá trước siêu lọc) Tiếp tục dùng hệ thống siêu lọc để cô đặc vacxin Hệ thống lọc tiếp tuyến Vivaflow 200cm2 Trung tâm loại dùng cho quy mơ phòng thí nghiệm ( thể tích 100ml đến lít) Kênh tuần hồn “Flip-Flow” mỏng tạo dòng chảy với vận tốc tiếp tuyến lớn mà cần công suất bơm nhỏ không cần giá lọc chịu áp lực mặt suốt, để dàng kiểm sốt thể tích giữ tình trạng màng Một module có diện tích 200cm có 5000ml thành 100ml vòng 6-7 (lấy mẫu kiểm tra hiệu giá) Chất liệu học polyethersulfone, cỡ lọc 100.000 M WCO Độ tương thích hóa học pH 1-14 Thể tích giữ module 1,5ml, thể tích tuần hồn tối thiểu