Luận văn nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TẠ THỊ THẢO TS HÀ TRẦN HƯNG HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Hà Trần Hưng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân tích, cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt người bạn nhóm hoá phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn Học viên Vũ Anh Phương MỤC LỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .10 1.1 Tổng quan về paraquat 10 1.1.1 Công thức paraquat 10 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat 10 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 11 1.1.4 Dược động học paraquat 13 1.1.4.1 Hấp thu 13 1.1.4.2 Phân bố 13 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ 13 1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tương 14 1.2 Các phương pháp xác định paraquat huyết tương .16 1.2.1 Phương pháp quang phổ 16 1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 17 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 18 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 19 1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 26 2.2.1 Chất chuẩn 26 2.2.2 Hoá chất 26 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu .28 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat .28 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 28 2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương .28 2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ huyết tương 28 2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ huyết tương 30 2.3.2.1 Tính chọn lọc .30 2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính .30 2.3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng .30 2.3.2.4 Đánh giá độ (độ thu hồi) độ chụm (độ lặp lại) 30 2.3.2.5 Độ ổn định 30 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .31 2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu .31 2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu cao .33 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất phân tích với detector DAD 33 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột 33 3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động .35 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 37 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 39 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động 39 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 41 3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm .41 3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natriheptanesulfonate 41 3.1.6.2 Ảnh hưởng nồng độ KCl 43 3.1.6.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ PEG .45 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 47 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 47 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 3.1.8 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49 3.1.8.1 Xây dựng đường chuẩn .49 3.1.8.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng .51 3.1.8.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn .53 3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 55 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA 56 3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy .57 3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích 59 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 59 3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc .59 3.3.2 Đánh giá độ phương pháp .60 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi phương pháp 60 3.3.2.2 Đánh giá độ phương pháp phân tích 61 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 62 3.3.3.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị 62 3.3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp) phương pháp phân tích 63 3.3.4 Độ ổn định .66 Độ ổn định thời gian phân tích .66 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 66 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 66 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .68 KẾT LUẬN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH HÌNH Chương Chương DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt % RSD % RSDR ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ GC - MS HP HPLC LC - MS LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RP-HPLC SD SIPP Vũ Anh Phương Tên tiếng anh % Relative standard deviation % Reproducibility standard Tên Tiếng việt % Độ lệch chuẩn tương đối % Độ lệch chuẩn tái lặp deviation Acetonitrile Asymmetry factor Adenosin Triphophate Patient diode-array detector Diquat Ethylparaquat Gas chromatography - Mass tương đối Acetonitril Hệ số đối xứng pic Adenosin Triphophat Bệnh nhân detector mảng diode Diquat Ethylparaquat spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Parts per million Paraquat Relative coefficient Receiver operating characteristics Reverse phase-HPLC Standard deviation Severity Index of Paraquat Sắc ký khí khối phổ Lọc máu hấp phụ Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Phần triệu Paraquat Hệ số tương quan Đường cong ROC Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn Chỉ số độ nặng ngộ độc Trường ĐHKH Tự nhiên Tên viết tắt TCA tR UV-VIS Vũ Anh Phương Tên tiếng anh Poisoning Trichloroacetic acid Retention time Ultraviolet-Visible Tên Tiếng việt Paraquat Acid Tricloacetic Thời gian lưu Tử ngoại khả kiến Trường ĐHKH Tự nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ, hiệu diệt cỏ dại nhanh chóng, ảnh hưởng tới môi trường sử dụng rộng rãi Việt Nam với nhiều tên thương mại khác Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong PQ ước tính khoảng 10 ml dung dịch 20% Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam việc thiếu sách biện pháp quản lý sử dụng hóa chất này nên năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1] Trên giới, nhiều ca tử vong ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27] Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng trở thành vấn nạn vô nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca năm 2013 năm 2014 lên tới 391 ca Tỉ lệ tử vong ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác giả nước ngoài [29][32] Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85% Trong chẩn đoán điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu biện pháp điều trị, đặc biệt lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong ngộ độc cấp PQ cao thiếu biện pháp điều trị hiệu Gần đây, nghiên cứu nhiều tác giả nước số tác giả Việt Nam cho thấy kĩ thuật lọc máu mới, lọc máu hấp phụ cột than hoạt cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết khả quan, cứu sống số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu biện pháp điều trị tăng thải trừ Tuy nhiên, Việt Nam việc xét nghiệm PQ dừng mức độ Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi Trong nhóm BN nghiên cứu, tuổi thấp nhất là 14 tuổi, tuổi cao nhất là 63 tuổi, trung bình: 32,1 ± 15,2 Ngộ độc PQ hay gặp ở độ tuổi lao động 18-50 tuổi (64,5%) Đặc điểm phân bố nhóm tuổi BN nghiên cứu tương tự nghiên cứu trước tác giả Đặng Thị Xuân, Nguyễn Thị Dụ [4] Vũ Mai Liên [2] Trung tâm chống độc Đáng ý 16,1% BN ngộ độc PQ tuổi thiếu niên Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp hình 3.18 Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp Vũ Anh Phương 67 Trường ĐHKH Tự nhiên Trong số bệnh nhân nghiên cứu, nghề làm ruộng chiếm tỉ lệ cao nhất 11 bệnh nhân (35,5%) phù hợp với việc PQ dùng nông nghiệp nên sẵn có nông thôn Học sinh, sinh viên chiếm tỉ lệ cao thứ hai (25,8%) đáng quan tâm Khi xem xét nguyên nhân ngộ độc, hầu hết BN nghiên cứu ngộ độc tự tử (29 bệnh nhân - 93,6%) Chỉ có BN tai nạn (6,4%), BN bất cẩn phun thuốc, BN uống nhầm Trong các sản phẩm thương mại PQ BN gia đình mang đến viện, Gfaxone 20SL hay gặp nhất, có số tên sản phẩm khác: Gramoxone, Fansipan, Tungmaxone, Cỏ cháy Hình 3.19: Kết bệnh nhân ngộ độc Paraquat 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ Thời gian từ lúc BN uống PQ cho đến lấy mẫu xét nghiệm trình bày bảng 3.23 Trung bình thời gian từ lúc uống đến lúc lấy mẫu xét nghiệm là 6,6 ± 4,23 Thời gian ngắn nhất là giờ, nhiều nhất là 23 Thời gian lấy mẫu sau uống chủ yếu (74,2%) Vũ Anh Phương 68 Trường ĐHKH Tự nhiên Bảng 3.23: Thời gian từ lúc uống đến lấy mẫu xét nghiệm Thời gian Số bệnh nhân Tỉ lệ % ≤ 3,2 >2 - 22,6 >4 - 12 38,7 Sau 11 35,5 Nồng độ Paraquat huyết tương vào viện: Áp dụng quy trình phân tích xây dựng được, xác định nồng độ PQ huyết tương Mỗi mẫu phân tích lặp lại lần Kết thu bảng 3.24 Giá trị nồng độ PQ huyết tương trung bình 8,1 µg/ml (thấp nhất: 0,215 µg/ml; cao 88,66 µg/ml) Vũ Anh Phương 69 Trường ĐHKH Tự nhiên Bảng 3.24: Kết định lượng PQ 31 bệnh nhân S T Bệnh nhân Tuổi Giới Thời gian Nữ Na m Na m Kết định lượng PQ (µg/ml) Trướ Vào Sau Trước Sau Sau c viện HP1 HP2 HP2 HP3 HP3 18,68 21,48 38,98 42 Nữ 8,6 63 Nữ 9,77 Dinh Thi P 18 Kieu Anh V 21 Hoang Van G 60 Nguyen T Hong T Vu Thi H Vu Thi H 22 Nữ 3,09 Nguyen Thi T 22 Nữ 19,3 Dam Huy Q 48 Na m 14 5,10 Đặng Thị H 51 Nữ 0,63 Nguyễn Thi H 21 Nữ 17,45 Nguyen Huy H 26 Na m 43,2 Trần Thi T 54 Nữ 88,66 Phạm Văn L 31 0,21 Lã Anh D 31 Na m Na m Lò Thị C 27 Nữ Nguyễn Xuân T 55 Na m 1 1 Vũ Anh Phương 18 23 5,36 0,51 6,34 70 0,2 4,4 2,3 0,0 0,7 0,2 0,7 0,05 0,12 [...]... Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với hai mục tiêu: 1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat 2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội Vũ Anh Phương. .. Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết tương Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu định lượng Paraquat. .. µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tương và huyết thanh Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối với huyết tương, huyết thanh Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1% đối với huyết tương, huyết thanh Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần lượt là 98,9% và 98,7% Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Hệ sử... Phương 25 Trường ĐHKH Tự nhiên CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng và xác định giá trị sử dụng của phương pháp phân tích PQ trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau: - Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương - Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu - Mẫu. .. phút, 2 phút 2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo * Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách... thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng * Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để định lượng PQ trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]… 1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật... định lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học [7][17][26] Arys K và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC Gồm bơm model 126 và Vũ Anh Phương. .. 4,77.10-7 M Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã được ứng dụng để định lượng PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu thực phẩm và các mẫu trong môi trường Vũ Anh Phương 16 Trường ĐHKH Tự nhiên Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại bước sóng 257 nm Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết tương dựa trên... µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắc xoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi ở trên bơm vào máy Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ Vũ Anh Phương 24 Trường ĐHKH Tự nhiên HPLC... ổn định Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và thời gian bảo quản - Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml trong huyết tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng 5 giờ, xác định RSDr Vũ Anh Phương 30 Trường ĐHKH Tự nhiên - Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên,