Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đã PEG hóa

GI O V OT O TRƢ NG YT I HỌ Ƣ H N I LÊ PHƢƠNG LINH NGHIÊN U O H THUỐ TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Ã PEG HÓA LU N V N TH S Ƣ H N I 2015 HỌ GI O V OT O TRƢ NG YT I HỌ Ƣ H N I LÊ PHƢƠNG LINH NGHIÊN U O H THUỐ TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Ã PEG HÓA LU N V N TH HUY N NG NH : S NG NGH V Ƣ Ƣ HỌ PH M O H THUỐ M SỐ : 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS.Phạm Thị Minh Huệ Ths Nguyễn Văn Lâm H N I 2015 L I CẢM ƠN ầu tiên xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể an giám hiệu trƣờng ại học ƣợc Hà Nội môn chế tạo điều kiện cho đƣợc làm luận văn thạc sĩ Với tình cảm chân thành, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tri ân đến PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ ThS Nguyễn Văn Lâm Là ngƣời cô, ngƣời thầy tận tình bảo, định hƣớng giúp đỡ trình thực đề tài, nhờ hoàn thành đƣợc mục tiêu đề tài đề Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Hồ Anh Sơn - Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y tận tình giúp đỡ, bảo tiến hành đề tài đặc biệt đánh giá tác dụng thuốc tế bào động vật thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn chế- ại học ƣợc Hà Nội, Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y, tạo điều kiện giúp đỡ thời gian nghiên cứu thực nghiệm Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ngƣời quan tâm động viên, khích lệ giúp hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên L PHƢƠNG LINH MỤ LỤ ẶT VẤN Ề HƢƠNG 1: T NG QU N 1.1 Tổng quan doxorubicin 1.1.1 ông thức cấu tạo, tính chất lí hóa 1.1.2 ƣợc lý - chế tác dụng định 1.1.3 ƣợc động học 1.1.4 Liều dùng 1.1.5 ác dạng thuốc chứa doxorubicin thị trƣờng 1.2 ại cƣơng liposome 1.2.1 Khái niệm, phân loại 1.2.2 Nhƣợc điểm liposome quy ƣớc 1.2.3 Những biện pháp cải thiện thời gian tuần hoàn liposome 1.3 PEG hóa bề mặt liposome 1.3.1 Khái niệm liposome PEG hóa 1.3.2 ặc tính PEG ảnh hƣởng đặc tính PEG tới liposome 10 1.3.3 Nồng độ phospholipid PEG sử dụng 12 1.3.4 Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa 12 1.4 Những nghiên cứu gần liposome doxorubicin 15 1.5 Sơ lƣợc mô hình đánh giá tác dụng invitro tế bào ung thƣ 18 1.5.1 ác dòng tế bào 18 1.5.2 Phƣơng pháp đánh giá độc tính tế bào 19 1.6 Sơ lƣợc mô hình đánh giá tác dụng khối u động vật thực nghiệm 20 1.6.1 ộng vật thực nghiệm 20 1.6.2 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng 20 HƢƠNG ỐI TƢ NG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN U 22 2.1 ối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu phƣơng tiện nghiên cứu 22 2.1.1 ối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Nguyên vật liệu 22 2.1.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 23 2.1.4 Thuốc đối chiếu 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phƣơng pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 23 2.2.2 Phƣơng pháp đánh giá liposome tạo thành 24 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin 29 2.2.4 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng invitro thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa tế bào ung thƣ 29 2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng invivo thuốc tiêm liposome OX PEG hóa khối u chuột 30 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 2.2.7 iều kiện thí nghiệm 32 HƢƠNG K T QUẢ THÍ NGHIỆM V N LU N 33 3.1 Xâydựng đƣờng chuẩn định lƣợng doxorubicin đo quang 33 3.2 Xây dựng công thức nâng cấp quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa mg/ml 34 3.2.1 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 34 3.2.2 Nâng cấp quy trình bào chế liposome OX quy mô 1000 ml/mẻ để bào chế thuốc tiêm 43 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome OX PEG hóa 48 3.3.1 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng OX toàn phần 48 3.3.2 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng doxorubicin tự 50 3.3.3 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng phospholipid 52 3.3.4 ề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome OX PEG hóa 55 3.4 ánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa tế bào ung thƣ ngƣời invitro khối u động vật thực nghiệm 56 3.4.1 ánh giá tác dụng invitro thuốc tiêm liposome OX PEG hóa dòng tế bào ung thƣ ngƣời 56 3.4.2 ánh giá tác dụng invivo thuốc tiêm liposome OX PEG khối u động vật thực nghiệm 57 HƢƠNG N LU N 63 4.1 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 63 4.2 Nâng cấp quy trình bào chế thuốc tiêm liposome OX PEG hóa quy mô 1000ml /mẻ 67 4.3 ộ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 69 4.4 ánh giá tác dụng invitro thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa dòng tế bào ung thƣ ngƣời 70 4.5 ánh giá tác dụng invivo thuốc tiêm liposome OX PEG khối u động vật thực nghiệm 71 K T LU N V Ề XUẤT 73 ANH MỤ HỮ V KÝ HIỆU VI T TẮT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ Chol Cholesterol CL Conventional liposome – Liposome quy ƣớc TT VN ƣợc điển Việt Nam DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động DOX Doxorubicin DSPC 1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-Phosphatidylcholin DSPE Distearoyl phosphatidyl ethanolamin DSPEPEG 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho Polyethylene glycol EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa 10 EPR Enhanced Permability and Retention effect –Hiệu ứng tăng tính thấm khả lƣu giữ 11 IC50 50% Inhibitory concentrations – Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tƣợng thử 12 IL Immunoliposome - Liposome miễn dịch 13 ITG 14 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethan sulfonic acid 15 HSPC Hydrogenated soy phosphatidylcholine - Phosphatidyl dầu đậu nành hydrogen hóa 16 HPLC High Performance Liquid hromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) 17 KTTP Kích thƣớc tiểu phân 18 LCL Long circulation liposome- Liposome tuần hoàn dài ethanolamin-N-Methoxy Inhibition Tumor Growth - Chỉ số ức chế phát triển khối u 19 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn 20 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp 21 MSPC Monostearoyl Phosphatidyl Choline 22 MPS Mononuclear Pagocytic System (Hệ thực bào đơn nhân) 23 PB KTTP Phân bố kích thƣớc tiểu phân 24 PDI Polydispersity Index – hỉ số đa phân tán 25 PEG Polyethylen glycol 26 PL Phospholipid 27 PVC Polyvinyl clorua 28 RES 29 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành 30 SRB Sulforhodamine B 31 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ 32 TCCS Tiêu chuẩn sở 33 TEM Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền qua 34 TKHH Tinh khiết hóa học 35 TSL Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm nhiệt 36 USP United State Pharmacopoeia (Dƣợc điển Mỹ) Reticuloendothelia System - Hệ lƣới nội mô DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Kết đo mật độ quang mẫu dung dịch DOX bƣớc 33 sóng 233nm 481nm Bảng 3.2 ộ ổn định kích thƣớc liposome sau tuần 34 Bảng 3.3 ộ ổn định công thức có nồng độ DSPE-PEG2000 khác 35 sau 28 ngày Bảng 3.4 Ảnh hƣởng dung lƣợng đệm hệ đệm bên tới đặc 37 tính liposome DOX Bảng 3.5 ộ ổn định mẫu với môi trƣờng đệm HEPES phosphat 39 pH 7,5 Bảng 3.6 ông thức bào chế mẫu theo dõi độ ổn định 41 Bảng 3.7 ộ ổn định liposome pha loãng dung dịch tiêm 43 truyền Bảng 3.8 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 48 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác 49 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ 50 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ 52 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại hệ thống đo quang 52 Bảng 3.13 Kết khảo sát tính xác 54 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ 54 Bảng 3.15 Chất lƣợng thuốc tiêm liposome OX PEG hóa mg/ml 54 Bảng 3.16 Tiêu chuẩn sở đề xuất thuốc tiêm liposome hóa Bảng 3.17 Tác dụng gây độc liposome PEG A549 OX PEG 56 OX dòng tế bào 57 Bảng 3.18 Tác dụng gây độc lipsome HT29 OX PEG dòng tế bào 57 Bảng 3.19 Trọng lƣợng thể nhóm chuột mang tế bào A549(g) Bảng 3.20 Trọng lƣợng thể nhóm chuột mang tế bào HT29 61 (g) 59 28 Jiang Wenlei, Lionberger Robert, Yu Lawrence X (2011), "In vitro and in vivo characterizations of PEGylated liposomal doxorubicin", Bioanalysis, 3(3), pp 333-344 29 Johnsson Markus, Edwards Katarina (2003), "Liposomes, disks, and spherical micelles: aggregate structure in mixtures of gel phase phosphatidylcholines and poly (ethylene glycol)-phospholipids", Biophysical journal, 85(6), pp 3839-3847 30 Johnston M J., Edwards K., Karlsson G., Cullis P R (2008), "Influence of drug-to-lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations", J Liposome Res, 18(2), pp 145-57 31 Kale Mohan, Suruse Pravin, Singh Ramandeep, Malhotra Geena, Raut Preeti (2012), "Effect of size reduction techniques on doxorubicin hydrochloride loaded liposomes", IJBPR, 3, pp 308-316 32 Kawano Kumi, Maitani Yoshie (2010), "Effects of polyethylene glycol spacer length and ligand density on folate receptor targeting of liposomal Doxorubicin in vitro", Journal of drug delivery, 2011, pp 33 Kostarelos Kostas, Miller Andrew D (2005), "What Role Can Chemistry Play in Cationic Liposome‐Based Gene Therapy Research Today?", Advances in genetics, 53, pp 69-118 34 Lasic Danilo D, Woodle Martin C, Papahadjopoulos Demetrios (1992), "On the molecular mechanism of steric stabilization of liposomes in biological fluids", Journal of Liposome Research, 2(3), pp 335-353 35 Lin Jia, Yu Yan, Shigdar Sarah, Fang Ding Zhi, Du Jun Rong, Wei Ming Q, Danks Andrew, Liu Ke, Duan Wei (2012), "Enhanced antitumor efficacy and reduced systemic toxicity of sulfatide-containing nanoliposomal doxorubicin in a xenograft model of colorectal cancer", PloS one, 7(11), pp e49277 36 Nakamura Koji, Yamashita Keiko, Itoh Yuki, Yoshino Keisuke, Nozawa Shigenori, Kasukawa Hiroaki (2012), "Comparative studies of polyethylene glycolmodified liposomes prepared using different PEG-modification methods", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1818(11), pp 2801-2807 37 Nancy L Boman Marcel B Ballu (1995), " Preclinical and Clinical activity of liposomal Doxorubicin", Liposomes in Biomedical Applications, 7(1), pp 210-243 38 Noble (2014), "Ligand-targeted liposome design: challenges and fundamental considerations"", Trends in Biotechnology, 32(1), pp 32-45 39 Ray Abhijit (2012), "Liposome in Drug delivery system", Asian Journal of Research and Pharmaceutical Science, 2(2), pp 40 Samad Abdus, Sultana Y, Aqil M (2007), "Liposomal drug delivery systems: an update review", Current drug delivery, 4(4), pp 297-305 41 Sawant R R Torchilin V P (2010), ""Liposomes as „smart‟pharmaceutical nanocarriers"", Soft Matter, 6(17),, pp 4026-4044 42 Sawant Rupa R, Torchilin Vladimir P (2012), "Challenges in development of targeted liposomal therapeutics", The AAPS journal, 14(2), pp 303-315 43 Sawant Rupa R, Torchilin Vladimir P (2010), "Liposomes as ‗smart‘pharmaceutical nanocarriers", Soft Matter, 6(17), pp 4026-4044 44 Scholtz J.C., Campus North-West University Potchefstroom (2010), Preparation, Stability and in Vitro Evaluation of Liposomes Containing Amodiaquine, North-West University, Potchefstroom Campus, pp 45 Schroeder Avi, Kost Joseph, Barenholz Yechezkel (2009), "Ultrasound, liposomes, and drug delivery: principles for using ultrasound to control the release of drugs from liposomes", Chemistry and physics of lipids, 162(1), pp 1-16 46 Senior Judith, Delgado Cristina, Fisher Derek, Tilcock Colin, Gregoriadis Gregory (1991), "Influence of surface hydrophilicity of liposomes on their interaction with plasma protein and clearance from the circulation: studies with poly (ethylene glycol)-coated vesicles", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1062(1), pp 77-82 47 Seynhaeve Ann LB, Dicheva Bilyana M, Hoving Saske, Koning Gerben A, ten Hagen Timo LM (2013), "Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by< i> in vitro/< i> in vivo live cell imaging", Journal of Controlled Release, 172(1), pp 330-340 48 Seynhaeve Ann LB, Hoving Saske, Schipper Debby, Vermeulen Cindy E, aan de Wiel-Ambagtsheer Gisela, van Tiel Sandra T, Eggermont Alexander MM, ten Hagen Timo LM (2007), "Tumor necrosis factor α mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response", Cancer research, 67(19), pp 9455-9462 49 Skehan Philip, Storeng Ritsa, Scudiero Dominic, Monks Anne, McMahon James, Vistica David, Warren Jonathan T, Bokesch Heidi, Kenney Susan, Boyd Michael R (1990), "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening", Journal of the National Cancer Institute, 82(13), pp 1107-1112 50 Soundararajan Anuradha, Bao Ande, Phillips William T, Perez Ricardo, Goins Beth A (2009), "[186 Re] Liposomal doxorubicin (Doxil): in vitro stability, pharmacokinetics, imaging and biodistribution in a head and neck squamous cell carcinoma xenograft model", Nuclear medicine and biology, 36(5), pp 515-524 51 Stewart John Charles Marshall (1980), "Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate", Analytical biochemistry, 104(1), pp 10-14 52 Strober Warren (2001), "Trypan blue exclusion test of cell viability", Current protocols in immunology/edited by John E Coligan [et al.], (Appendix 3), pp Appendix 3B 53 Sweetman (2009), "Martindale: the complete drug reference ", pp 712-714 54 Téletchéa Stéphane, Stresing Verena, Hervouet Soizic, Heymann Marie‐Françoise, ertho Gildas, harrier éline, aud'huin Marc, ndo Kosei, Heymann Dominique (2014), "Novel RANK antagonists for the treatment of bone‐resorptive disease: theoretical predictions and experimental validation", Journal of Bone and Mineral Research, 29(6), pp 1466-1477 55 Torchilin Vladimir (2011), "Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect", Advanced drug delivery reviews, 63(3), pp 131-135 56 Torchilin Vladimir P (2005), "Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers", Nature reviews Drug discovery, 4(2), pp 145-160 57 USP34-NF30, pp 58 Uster Paul S, Allen Theresa M, Daniel Barbra E, Mendez Cecilia J, Newman Mary S, Zhu George Z (1996), "Insertion of poly (ethylene glycol) derivatized phospholipid into pre-formed liposomes results in prolonged in vivo circulation time", FEBS letters, 386(2), pp 243-246 59 Yamaguchi Tsuyoshi (2009), "―Effects of frequency and power of ultrasound on the size reduction of liposome", Chemistry and Physics of Lipids pp 58-62 60 Yang Yanfang, Yang Yang, Xie Xiangyang, Cai Xingshi, Zhang Hui, Gong Wei, Wang Zhiyuan, Mei Xingguo (2014), "PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide–doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy", Biomaterials, 35(14), pp 4368-4381 61 Ye Wei-liang, Du Jiang-bo, Na Ren, Song Yan-feng, Mei Qi-bing, Zhao Ming- gao, Zhou Si-yuan (2014), "Cellular Uptake and Antitumor Activity of DOX-hydPEG-FA Nanoparticles", PloS one, 9(5), pp e97358 62 Zucker Daniel, Marcus David, Barenholz Yechezkel, Goldblum Amiram (2009), "Liposome drugs' loading efficiency: a working model based on loading conditions and drug's physicochemical properties", Journal of Controlled Release, 139(1), pp 73-80 Phụ lục thị phân bố kích thƣớc liposome sau 10 chu kì nén áp suất 5000psi Phụ lục thị phân bố kích thƣớc liposome sau 10 chu kì nén áp suất 10.000 psi Phụ lục Sắc ký đồ mẫu trắng định lƣợng doxorubicin Phụ lục Sắc ký đồ doxorubicin 40 µg/ml Phụ lục Sắc ký đồ định lƣợng doxorubicin toàn phần liposome DOX PEG Phụ lục Sắc ký đồ định lƣợng doxorubicin 40 µg/ml thêm chuẩn Phụ lục Sắc ký đồ doxorubicin µg/ml Phụ lục Sắc ký đồ định lƣợng doxorubicin tự liposome doxorubicin PEG Phụ lục Sắc ký đồ định lƣợng doxorubicin µg/ml thêm chuẩn Phụ lục 10 Kết kháo sát độ tuyến tính thẩm định định lƣợng OX toàn phần STT Nồng độ dung dịch doxorubicin (µg/ml) iện tích pic (mAU.s) 20 777,18 30 1165,55 40 1576,59 50 1942,49 60 2290,55 Phụ lục 11 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký thẩm định phƣơng pháp định lƣợng DOX tự STT Thời gian lƣu iện tích pic Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết (phút) (mAU.s) xứng (AF) 5,128 483,16 0,67 3640 5,131 455,48 0,7 3650 5,112 434,48 0,69 3391 5,123 485,12 0,67 3640 5,134 487,06 0,67 3531 5,074 484,08 0,67 3233 5,11 483,61 0,68 3515 ̅ RSD (%) 0,47 0,88 Phụ lục 12 Kết khảo sát độ tuyến tính thẩm định DOX tự STT Nồng độ dung dịch doxorubicin (µg/ml) iện tích pic (mAU.s) 0,1 37,47 0,4 109,58 483,81 729,66 938,67 Phụ lục 13 Kết khảo sát độ xác thẩm định dox tự iện tích pic (mAU.s) STT 52,29 50,19 50,61 52,38 51,63 51,75 ̅ RSD (%) 51,48 1,73 Phụ lục 14 Nồng độ phospholipid độ hấp thụ quang STT Nồng độ phospholipid (µmol/ml) ộ hấp thụ trung bình 0,006 0,062 0,013 0,142 0,025 0,256 0,038 0,405 0,051 0,525 0,063 0,651 Phụ lục 15 Phổ hấp thụ phospholipid mẫu trắng, mẫu thử mẫu chuẩn Phụ lục 16: ộ ổn định công thức M1 sau tháng -29,4±3,34 Hàm lƣợng OX toàn phần (mg/ml) 2,04±0,08 Hiệu suất liposome hóa (%) > 95,00 158,9±8,41 0,021±0,033 -26,6±4,12 2,02±0,109 > 95,00 160,1±4,59 0,045±0,027 -27,7±1,6 2,06±0,052 > 95,00 161,2±1,43 0,032±0,015 -25,2±3,77 1,97±0,073 > 95,00 163,2±5,42 0,050±0,038 -24,5±4,35 1,93±0,063 93,79±3,48 165,3±6,01 0,056±0,04 -25,9±5,12 1,89±0,124 94,12± 2,77 170,4±10,0 0,098±0,031 172,0±7,57 0,118±0,026 -23,1±1,26 1,94±0,065 92,08±3,85 -24,5±5,45 1,88±0,043 90,30±1,26 Thời gian KTTP (d.nm) PDI Mới bào chế Sau tuần Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng 159,7±9,95 0,030±0,012 Zeta (mV) Phụ lục 17: ộ ổn định công thức M2 sau tháng Thời gian 158,5±11,09 0,046±0,014 -24,5±1,85 Hàm lƣợng toàn phần (mg/ml) 2,02±0,067 Hiệu suất liposome hóa (%) > 95 155,4±7,56 0,058±0,021 -26,1±3,02 2,04±0,053 > 95 160,1±6,12 0,040±0,018 -23,4±5,63 1,99±0,09 > 95 162,4±7,95 0,060±0,026 -24,5±2,19 2,06±0,126 93,37± 1,31 0,062± -27,3±6,47 0,033 175,8±13,74 0,074±0,042 -21,2±4,09 1,93±0,085 92,01±2,01 2,01±0,116 88,81± 4,32 187,3±10,33 0,134±0,016 -20,6±3,17 1,91±0,035 82,58±1,78 190,7±17,02 0,201±0,025 -19,8±4,52 1,91±0,172 75,98±2,43 KTTP (d.nm) Mới bào chế Sau tuần Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng PDI Zeta (mV) 165,8±5,55 Phụ lục 18: ộ ổn định công thức M3 sau tháng Thời gian KTTP (d.nm) PDI Zeta (mV) Mới bào 157,6±5,42 0,037±0,024 -31,8±1,23 chế Sau 160,6±10,48 0,040±0,035 -27,5±3,67 tuần Sau 161,2±13,57 0,045±0,031 -26,1±4,91 tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Sau tháng Hàm lƣợng Hiệu suất OX toàn liposome phần (mg/ml) hóa (%) 2,04±0,041 > 95 2,04±0,062 > 95 2,01±0,038 > 95 165,3±8,41 0,098±0,025 -29,3±5,65 2,02±0,059 92,40±1,47 171,3±9,79 0,091±0,019 -26,7±4,02 1,96±0,103 90,61±3,84 180,4±17,16 0,133±0,038 -20,1±6,01 1,89±0,097 81,27±4,09 190,4±17,43 0,180±0,045 -19,3±5,43 1,83±0,116 74,77±6,59 Sau 212,5±23,58 0,251±0,049 -15,4±4,19 tháng 1,76±0,134 65,33±5,72 Phụ lục 19: Sự biến đổi cấu trúc nồng độ SPE-PEG2000 10 mol% Phụ lục 20:Kích thƣớc khối u A549 nhóm chuột (mm3) Ngày Ngày 668,53± 372,43 1117,6± 682,88 1643,40± 867,78 2088,73± 1012,08 Dung dịch 619,88± 621,11 doxorubicin (2) Lipodox (3) 406,43±192,03 970,06± 875,57 1339,8± 1029,52 1821,92±1342,42 Chứng (1) Liposome (4) 503± 336,16 Ngày 611,26± 392,21 882,15± 477,48 517,65±254,23 Ảnh hƣởng yếu tố tới kích thƣớc khối u P time < 0,05 P nhóm > 0,05 P nhóm* time > 0,05 Ngày 11 1437,25± 855,05 1196,86± 524,69 1478,40±570,25 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính: nhóm kt = 652 + 132,3 time kt = 582 + 110,2 time kt = 320 + 93,5 time kt = 384 + 98,2 time Phụ lục 21: Kích thƣớc khối u HT 29 nhóm chuột( mm3 ) Chứng (1) Ngày Ngày Ngày Ngày 530±338,64 2116,84±800,95 3039,73±798,78 5625,64±1653 1802,91±974,7 2440,2±1272,3 4461,27±2365,29 1126,58±1075,7 2086,7±2438,32 2924,47±2367,09 873,6±731,69 1661,7±1357,7 2805,7±2041,41 Dung dịch 566,4±398,29 Doxorubicin(2) Lipodox (3) 538,28±380 Liposome (4) 462,8±382,73 Ảnh hƣởng yếu tố tới kích thƣớc khối u P time < 0,05 P nhóm < 0,05 ( p 1-2 >0,05; p1-3 [...]... để chứng minh đƣợc hiệu quả của hệ mang thuốc liposome, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa Mục tiêu của đề tài: 1 ào chế đƣợc thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2mg/ml ở quy mô 1000 ml/mẻ và xây dựng TCCS cho chế phẩm 2 ánh giá tác dụng invitro và invivo của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên tế bào ung thƣ ngƣời và khối u động vật thực... khác 2.1.4 Thuốc đối chiếu - Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin Ebewe lọ 25ml, 2mg/ml (Ebewe pharma) Số lô: 20141108 Hạn dùng: 11/2017 - Thuốc tiêm liposome: Lipo ox lọ 10ml, 2mg/ml ( TTY Bio pharm, ài Loan) Số lô: 20130709 Hạn dùng: 9/2016 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa Dựa theo kết quả của các nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đã đạt đƣợc,... trên 90% Tiến hành 15 nghiên cứu độ ổn định tại 25° trong 4 tuần Khoảng 20% DSPE -PEG5 000 ở liposome bào chế theo phƣơng pháp gắn PEG trong quá trình bào chế liposome bị thủy phân sau 2 tuần, trong khi không có sự suy giảm nồng độ PEG sau 4 tuần ở liposome bào chế theo phƣơng pháp gắn PEG sau khi bào chế liposome Nghiên cứu đánh giá dƣợc động học PLD cho thấy t1/2 của 2 mẫu bào chế không khác biệt có... chuỗi PEG gây ra [33, 38] 1.3.4 Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa Liposome có thể đƣợc bào chế theo nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp tráng phim, pha loãng alcol, đông khô, phƣơng pháp bốc hơi pha đảo, PEG có thể 12 đƣợc gắn đồng thời trong quá trình bào chế liposome hoặc gắn sau khi tạo ra liposome hoàn chỉnh [36] Hình 1.3: Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa [33] A Gắn PEG trong quá trình bào chế. .. PEG trong quá trình bào chế liposome B Gắn PEG sau quá trình bào chế liposome thông qua micell C Gắn PEG sau quá trình bào chế liposome nhờ liên kết đồng hóa trị  Gắn PEG trong quá trình bào chế liposome (Pre-modification) Phƣơng pháp gắn PEG trong quá trình tạo liposome là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trên thế giới để tạo liposome PEG hóa Tá dƣợc phospholipid gắn PEG s đƣợc hòa tan trong dung... cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu so sánh liposome doxorubicin PEG hóa (PLD- PEGylated liposome doxorubicin) bào chế bằng 2 phƣơng pháp: Gắn PEG trong và sau quá trình bào chế liposome [36] Tỷ lệ HSPC: Chol: DSPE -PEG5 000 (54:46:0,5-2 mol%) Giảm KTTP bằng phƣơng pháp nén đẩy qua màng polycarbonate 200 nm và 100 nm OX nạp vào liposome nhờ chênh lệch nồng độ amoni Hiệu suất liposome hóa cả 2 phƣơng... tiên trong nghiên cứu về liposome ứng dụng làm hệ mang thuốc Một số nghiên cứu đã đƣa ra đƣợc công thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Liposome đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC :cholesterol (10:2 w/w), sau đó sử dụng siêu âm để làm giảm kích thƣớc, sử dụng phƣơng pháp lọc tiếp tuyến để tiến hành đổi đệm, tạo ra các liposome. .. sàng Trong đó dẫn chất PEG đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi nhất [26], [22] 1.3 PEG hóa bề mặt liposome 1.3.1 Khái niệm liposome PEG hóa Liposome PEG hóa còn đƣợc gọi là liposome ngụy trang (―stealth‖ liposome) ể tồn tại lâu trong hệ thống tuần hoàn bề mặt vỏ các liposome đƣợc đƣa thêm nhóm thân nƣớc có kích thƣớc lớn, tƣơng hợp sinh học là PEG nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome thoát khỏi... TƢ NG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN U 2.1 ối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu 2.1.1 ối tƣợng nghiên cứu - Liposome doxorubicin PEG hóa 2.1.2 Nguyên vật liệu Bảng 2.1 Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu Tiêu chuẩn USP STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc 1 Doxorubicin hydroclorid Ấn ộ 2 Cholesterol Sigma Aldrich Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã Lipoid hydrogen hóa (HSP ) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamin-NLipoid... dƣ trong chế phẩm thuốc tiêm [6] Các nghiên cứu về liposome doxorubicin hiện nay chủ yếu tập trung vào bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của liposome DOX quy ƣớc gồm hai thành phần là phospholipid và cholesterol Chƣa có nghiên cứu nào sử dụng tá dƣợc phospholipid PEG để tăng thời gian tuần hoàn liposome 1.5 Sơ lƣợc mô hình đánh giá tác dụng invitro trên tế bào ung thƣ 1.5.1 ác dòng tế bào Khả năng ... pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa Dựa theo kết nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đạt đƣợc, kết hợp với nghiên cứu giới [50], liposome doxorubicin. .. thuật bào chế liposome PEG hóa [33] A Gắn PEG trình bào chế liposome B Gắn PEG sau trình bào chế liposome thông qua micell C Gắn PEG sau trình bào chế liposome nhờ liên kết đồng hóa trị  Gắn PEG. .. đƣợc hiệu hệ mang thuốc liposome, tiến hành đề tài Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa Mục tiêu đề tài: chế đƣợc thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2mg/ml quy mô