Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đã PEG hóa

Phương pháp đánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên tế bào ung thư.. Với mong muốn tạo ra các liposome OX có khả năng tuần hoàn kéo dài từ các nguyên

GI O V O T O Y T

TRƯ NG I HỌ Ư H N I

LÊ PHƯƠNG LINH

NGHIÊN U O H THUỐ TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Ã PEG HÓA

LU N V N TH S Ư HỌ

H N I 2015

GI O V O T O Y T

TRƯ NG I HỌ Ư H N I

LÊ PHƯƠNG LINH

NGHIÊN U O H THUỐ TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Ã PEG HÓA

LU N V N TH S Ư HỌ

HUY N NG NH : NG NGH Ư PH M

V O H THUỐ

M SỐ : 60720402

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS.Phạm Thị Minh Huệ

Ths Nguyễn Văn Lâm

H N I 2015

L I CẢM ƠN

ầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể an giám hiệu trường ại học ược

Hà Nội và bộ môn ào chế đã tạo điều kiện cho tôi được làm luận văn thạc sĩ Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến

PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ ThS Nguyễn Văn Lâm

Là người cô, người thầy đã tận tình chỉ bảo, định hướng và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài,nhờ đó tôi có thể hoàn thành được các mục tiêu của đề tài đề ra

Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Hồ Anh Sơn - Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện

Quân y đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi khi tiến hành đề tài đặc biệt là khi đánh giá tác dụng của thuốc trên tế bào và động vật thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn ào chế- ại học ược Hà Nội, Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y,

đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm động viên, khích lệ giúp tôi hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Học viên

L PHƯƠNG LINH

MỤ LỤ

ẶT VẤN Ề 1

HƯƠNG 1: T NG QU N 2

1.1 Tổng quan về doxorubicin 2

1.1.1 ông thức cấu tạo, tính chất lí hóa 2

1.1.2 ược lý - cơ chế tác dụng và chỉ định 2

1.1.3 ược động học 3

1.1.4 Liều dùng 3

1.1.5 ác dạng thuốc chứa doxorubicin trên thị trường 4

1.2 ại cương về liposome 4

1.2.1 Khái niệm, phân loại 4

1.2.2 Nhược điểm của liposome quy ước 6

1.2.3 Những biện pháp cải thiện thời gian tuần hoàn của liposome 7

1.3 PEG hóa bề mặt liposome 8

1.3.1 Khái niệm liposome PEG hóa 8

1.3.2 ặc tính PEG và ảnh hưởng đặc tính PEG tới liposome 10

1.3.3 Nồng độ phospholipid PEG sử dụng 12

1.3.4 Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa 12

1.4 Những nghiên cứu gần đây về liposome doxorubicin 15

1.5 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng invitro trên tế bào ung thư 18

1.5.1 ác dòng tế bào 18

1.5.2 Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào 19

1.6 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm 20

1.6.1 ộng vật thực nghiệm 20

1.6.2 Phương pháp đánh giá tác dụng 20

HƯƠNG 2 ỐI TƯ NG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN U 22

2.1 ối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 22

2.1.1 ối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Nguyên vật liệu 22

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 23

2.1.4 Thuốc đối chiếu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 23

2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo thành 24

2.2.3 Phương pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin 29

2.2.4 Phương pháp đánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên tế bào ung thư 29

2.2.5 Phương pháp đánh giá tác dụng invivo của thuốc tiêm liposome OX PEG hóa trên khối u chuột 30

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 32

2.2.7 iều kiện thí nghiệm 32

HƯƠNG 3 K T QUẢ THÍ NGHIỆM V N LU N 33

3.1 Xâydựng đường chuẩn định lượng doxorubicin bằng đo quang 33

3.2 Xây dựng công thức và nâng cấp quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml 34

3.2.1 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 34

3.2.2 Nâng cấp quy trình bào chế liposome OX quy mô 1000 ml/mẻ để bào chế thuốc tiêm 43

3.3 Xây dựng tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome OX PEG hóa 48

3.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng OX toàn phần 48

3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin tự do 50

3.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng phospholipid 52

3.3.4 ề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome OX PEG hóa 55

3.4 ánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên tế bào ung thư người invitro và khối u động vật thực nghiệm 56

3.4.1 ánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome OX PEG hóa trên dòng tế bào ung thư người 56

3.4.2. ánh giá tác dụng invivo của thuốc tiêm liposome OX PEG trên khối u động vật thực nghiệm 57

HƯƠNG 4 N LU N 63

4.1 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 63

4.2 Nâng cấp quy trình bào chế thuốc tiêm liposome OX PEG hóa ở quy mô 1000ml /mẻ 67

4.3 ộ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 69 4.4. ánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên

dòng tế bào ung thư người 70 4.5. ánh giá tác dụng invivo của thuốc tiêm liposome OX PEG trên khối u động

vật thực nghiệm 71

K T LU N V Ề XUẤT 73

ANH MỤ HỮ V KÝ HIỆU VI T TẮT

TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ

1 Chol Cholesterol

2 CL Conventional liposome – Liposome quy ước

3 VN ược điển Việt Nam

4 DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động

9 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

10 EPR Enhanced Permability and Retention effect –Hiệu ứng tăng tính

thấm và khả năng lưu giữ

11 IC 50 50% Inhibitory concentrations – Nồng độ thuốc ức chế 50% đối

tượng thử

12 IL Immunoliposome - Liposome miễn dịch

13 ITG Inhibition Tumor Growth - Chỉ số ức chế sự phát triển khối u

14 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethan sulfonic acid

15 HSPC Hydrogenated soy phosphatidylcholine - Phosphatidyl dầu đậu

19 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

20 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

21 MSPC Monostearoyl Phosphatidyl Choline

22 MPS Mononuclear Pagocytic System (Hệ thực bào đơn nhân)

23 PB

KTTP Phân bố kích thước tiểu phân

24 PDI Polydispersity Index – hỉ số đa phân tán

25 PEG Polyethylen glycol

26 PL Phospholipid

27 PVC Polyvinyl clorua

28 RES Reticuloendothelia System - Hệ lưới nội mô

29 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành

30 SRB Sulforhodamine B

31 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ

32 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

33 TEM Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền qua

34 TKHH Tinh khiết hóa học

35 TSL Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm nhiệt

36 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch DOX ở bước

sóng 233nm và 481nm

33

Bảng 3.2 ộ ổn định về kích thước của liposome sau 8 tuần 34

Bảng 3.3 ộ ổn định công thức có nồng độ DSPE-PEG2000 khác nhau

Bảng 3.6 ông thức bào chế mẫu theo dõi độ ổn định 41

Bảng 3.7 ộ ổn định của liposome khi pha loãng trong dung dịch tiêm

Bảng 3.15 Chất lượng thuốc tiêm liposome OX PEG hóa 2 mg/ml 54

Bảng 3.16 Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của thuốc tiêm liposome OX PEG

Bảng 3.18 Tác dụng gây độc của lipsome OX PEG trên dòng tế bào

HT29

57

Bảng 3.19 Trọng lƣợng cơ thể của các nhóm chuột mang tế bào A549(g) 59

Bảng 3.20 Trọng lƣợng cơ thể của các nhóm chuột mang tế bào HT29

(g)

61

DANH MỤ HÌNH VẼ, Ồ THỊ

Hình 1.3 Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa 13

Hình 3 1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ DOX ở

bước sóng khác nhau

33

Hình 3.2 Hình ảnh TEM của các mẫu liposome doxorubicin bào chế

theo các công thức 1, 2, 3 sau 1 ngày bào chế

36

Hình 3.3 ồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại đệm tới hiệu

suất liposome hóa

Hình 3.7 Sự thay đổi KTTP và P I của liposome sau khi nén ép

dưới áp suất và chu kì khác nhau

44

Hình 3.8 So sánh hai phương pháp đùn tay và nén áp suất cao qua

10 chu kì

45

Hình 3.9 Ảnh chụp TEM liposome đồng nhất hóa áp suất cao 45

Hình 3.10 Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome OX PEG hóa quy mô

Hình 3.13 ồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ phospholipid

và độ hấp thụ

53

Hình 3.14 Diễn biến kích thước khối u mang tế bào A549 58

Hình 3.15 Khả năng ức chế sự phát triển khối u mang tế bào A549 58

Hình 3.16 Tỷ lệ sống/ chết giữa các nhóm chuột mang tế bào 549 60

Hình 3.17 Diễn biến kích thước khối u đại tràng mang tế bào HT 29 61

Hình 3.18 Khả năng ức chế sự phát triển khối u đại tràng mang tế bào

HT 29

62

Hình 3.19 Tỷ lệ sống/ chết của các nhóm chuột mang tế bào HT29 63

ra một lớp áo bảo vệ cho liposome để thoát khỏi quá trình opsonin hóa, sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan ác liposome PEG hướng đích theo

cơ chế thụ động, do thời gian lưu trong tuần hoàn dài nên tăng tập trung ở mô đích tăng nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (Enhanced Permability and Retention effect- EPR effect) Chuỗi PEG trên bề mặt liposome cũng giúp tránh được hiện tượng kết tụ các liposome nên cải thiện được độ ổn định công thức [7] [10] [19]

Ở Việt Nam, kỹ thuật bào chế liposome bước đầu đã thu được một số kết quả khả quan [2],[3], tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở quy mô nhỏ (vài chục ml) và chưa

đánh giá được tác dụng của chế phẩm liposome PEG hóa trên invitro và invivo Với

mong muốn tạo ra các liposome OX có khả năng tuần hoàn kéo dài từ các nguyên liệu lipid tổng hợp, đánh giá được tác dụng để chứng minh được hiệu quả của hệ

mang thuốc liposome, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm

liposome doxorubicin PEG hóa”

Mục tiêu của đề tài:

1 ào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2mg/ml ở quy mô

1000 ml/mẻ và xây dựng TCCS cho chế phẩm

2 ánh giá tác dụng invitro và invivo của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG

hóa trên tế bào ung thư người và khối u động vật thực nghiệm

HƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về doxorubicin

1.1.1 Công thức cấu tạo t nh chất hóa

- Công thức phân tử:C27H29NO11.HCl

- Khối lượng phân tử : 579,99

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-trideoxy-

trideoxy-α-L-lyxo-methoxy-5,12-naphthacenedion [53]

hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1 Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Dung dịch

5mg/ml có pH từ 4-5,5 Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [53]

Doxorubicin (DOX) là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Tuy nhiên, ở

nồng độ điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng

và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ DOX khỏi ánh sáng [54]

1.1.2 Dược ý - cơ chế tác dụng và chỉ định

ơ chế tác dụng của OX chưa được rõ ràng nhưng nhiều nhà khoa học đã đồng

ý với giả thiết rằng: OX xen vào giữa cấu trúc chuỗi xoắn kép N tại vị trí giữa cặp base Guanin- ytosin tạo ra phức hợp bền vững gây ức chế N phụ thuộc vào enzym ARN-polymerase, làm rối loạn chức năng cũng như quá trình tổng hợp N khiến tế bào ung thư không nhân lên được OX gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân tuy nhiên cũng tác dụng tới các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào [1], [54]

ược chỉ định chủ yếu trong các trường hợp: ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng, ung thư tinh hoàn, u lympho dạng Hodgkin và không Hodgkin, sarcoma xương và mô mềm, OX có thể dùng đơn độc

hoặc phối hợp với các thuốc khác như vincristin, methotrexat, cyclophosphamid [1], [9], [54]

ược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự

do Liposome DOX PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và

ít phân bố tới các mô lành hơn ác liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [12] [14] [54]

1.1.4 Liều dùng

Dạng thuốc tiêm dung dịch: Pha loãng với dung dịch glucose 5% hoặc dung dịch

nước muối sinh lý 0,9% rồi truyền nhanh tĩnh mạch trong 3 phút hoặc lâu hơn Nếu chỉ điều trị bằng doxorubicin thì liều sử dụng là 60-75 mg/m2 da tương đương 1,2 – 2,4 mg/kg thể trọng, 3 tuần/lần Hoặc truyền 1 lần/ngày liều 20 mg/m2, truyền trong 3 ngày cách nhau 3 tuần Nếu sử dụng cùng với thuốc chống ung thư khác thì giảm liều xuống từ 30 - 60 mg/m2, truyền 1 lần trong 3 tuần Tổng liều không quá 450-550 mg/

m2 da [1]

Dạng liposome PEG hóa: Pha loãng bằng dung dịch glucose 5% để truyền tĩnh

mạch Với liều dưới 90 mg pha trong 250 ml dung dịch glucose 5%, liều trên 90 mg pha loãng với 500 ml dung dịch glucose 5% [54]

Truyền tĩnh mạch liều 20 mg/m2 trong 30 phút, 2-3 tuần truyền 1 lần Với điều trị ung thư vú và ung thư buống trứng, liều điều trị là 50 mg/m2, truyền trong 1h, 1 lần trong 4 tuần [54]

Dạng liposome không PEG hóa: được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều

tương tự như dạng doxorubicin tự do Pha loãng chế phẩm bằng dung dịch NaCl 0,9%

hoặc dung dịch glucose 5% tới nồng độ 0,4-1,2 mg/ml, truyền tĩnh mạch trong 1 h cách nhau 3 tuần [54]

Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bàng quang trong điều trị ung thư ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin 1 mg/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc 1 tháng

1.1.5 Các dạng thuốc chứa doxorubicin trên thị trường

Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim Thuốc tiêm liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet

ột đông khô pha tiêm 10mg, 20mg, 50mg, 150mg: Adriblastina, Doxorubicina

1.2 ại cương về liposome

1.2.1 Khái niệm phân oại

Liposome thuộc hệ điều trị cao hơn của dạng thuốc kiểm soát giải phóng - hệ mang thuốc hướng đích (targeted drug delivery system) có cấu trúc hình cầu đơn hay

đa lớp kép cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [4], [40], [39], [5] ,[11]

Hình 1.1: Cấu trúc liposome[9]

Phân oại [59] :Theo sự phát triển của liposome chia thành:

Liposome quy ước: là loại liposome có cấu tạo chỉ gồm có vỏ lipid và nhân

nước Lớp vỏ liposome quy ước được tạo thành từ các phospholipid khác nhau, cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có bất kỳ sự thay đổi nào trên bề mặt liposome

Liposome hiện đại: Nhằm khắc phục nhược điểm của liposome quy ước là tồn

tại ngắn trong tuẩn hoàn, khả năng hướng đích kém và nguy cơ giải phóng dược chất

vào các tế bào bình thường; các nhà khoa học đã nghiên cứu thay đổi cấu trúc của liposme để đảm bảo có thể sử dụng liposome như là một hệ mang thuốc hiệu quả Một liposome mang thuốc hiệu quả phải đạt được các yêu cầu sau [56]:

 Hiệu suất mang thuốc phải ổn định

 Tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn

 ó khả năng thoát khỏi lòng mạch máu tại vị trí bị bệnh để đi vào mô bệnh

 Kiểm soát được khả năng giải phóng thuốc vào trong tế bào [33]

ó thể phân loại liposome hiện đại theo mục đích chế tạo gồm các loại:

iposome mi n dịch Immunoliposome ): Bề mặt liposome được gắn lên các

phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các nhóm nhận đích - target ligand) ác chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các kháng thể IgG nên liposome này được gọi là liposome miễn dịch Hiện nay đã phát triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể nên các liposome đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn tuy nhiên vẫn được xếp vào loại liposome miễn dịch như: liposome hướng receptor folate, liposome hướng receptor tranferin [41]…

Liposome tuần hoàn dài (Long-circualating liposome): Liposome loại này được

tạo ra bằng cách phủ lên bề mặt liposome cổ điển một lớp polyme trơ, tương hợp sinh học nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome tránh khỏi sự nhận diện của quá trình opsonin hóa và do đó làm giảm khả năng thải trừ liposome khỏi hệ tuần hoàn PEG là polyme hay được sử dụng để tạo ra liposome tuần hoàn dài trong máu [55]

iposome mi n dịch tuần hoàn dài (Long-circualatingImmunoliposome): ây là

loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tuần hoàn dài và liposome mi n dịch

nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome ặc điểm cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [41]

Liposome cảm ứng (sensitive liposome): Là các liposome trong thành phần cấu

tạo vỏ của có chứa một tỉ lệ nhất định các chất cảm ứng, có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polyme có khả năng bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu

trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường, nhiệt độ (tác nhân ngoại) [45],[43]

1.2.2 Nhược điểm của iposome quy ước

Liposome quy ước có nhược điểm đó là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi hệ thống đại thực bào đơn nhân (MPS- Mononuclear Pagocytic System) trong máu và hệ thống lưới nội mô ( RES- Reticuloendothelial system) ở gan và lá lách Sau khi vào hệ thống tuần hoàn, liposome tương tác với các thành phần protein huyết tương dẫn đến sự mất

ổn định lớp màng kép làm giải phóng dược chất bên trong liposome vào máu gây độc cho các tế bào lành Các protein được hấp thụ lên bề mặt liposome làm tăng tính thấm của màng, ảnh hưởng tới sự đến sự lưu giữ dược chất bên trong liposome, hoặc tạo điều kiện để MPS nhận biết và thực bào ác protein này được gọi là opsonin và quá trình chúng hấp phụ lên bề mặt liposome gọi là quá trình opsonin hóa [27] Việc chỉ

sử dụng các phospholipid bão hòa và cholesterol trong xây dựng công thức liposome

quy ước không thể vượt qua liên kết liposome với các thành phần huyết tương, giảm hấp thu do sự tóm bắt của hệ thống đại thực bào đơn nhân [26], [42]

Ngoài ra khả năng hướng đích của liposome quy ước cũng kém vẫn có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường do cơ chế hướng đích của loại liposome này là cơ chế thụ động, chủ yếu phụ thuộc vào kích thước liposome và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các mô ung thư, chưa kiểm soát được khả năng giải phóng dược chất [42], [44] Sự tích lũy thụ động của liposome tại khối u là quá trình diễn ra tương đối chậm, trong khi các liposome quy ước nhanh chóng bị thải trừ khỏi

hệ tuần hoàn, do đó việc tăng thời gian tuần hoàn là yêu cầu cần thiết để phát triển hệ mang thuốc dạng liposome

1.2.3 Những biện pháp cải thiện thời gian tuần hoàn của liposome

Lựa chọn các thành phần lipid là rất quan trọng để khai thác lợi ích của hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (EPR- Enhanced Permability and Retention effect), cũng như duy trì sự ổn định của các liposome trong lưu thông [26] Lựa chọn đúng lipid có thể làm giảm sự liên kết của protein huyết thanh, ổn định dạng bào chế

để giảm tỷ lệ thuốc bị rò rỉ Sự hiện diện của cholesterol trong liposome là cần thiết giúp duy trì sự ổn định màng kép và thời gian lưu thông dài trong cơ thể Liposome gồm lipid với nhiệt độ chuyển pha cao s ổn định hơn, với khả năng nạp thuốc tốt và thấy rõ sự tăng thời gian lưu hành thuốc ác liposome tạo ra từ các phospholipid bão hòa như SP có ái lực thấp với các opsonin, ổn định trong máu hơn và thời gian tuần hoàn kéo dài hơn so với các phospholipid tự nhiên [26], [23]

Kích thước tiểu phân ảnh hưởng tới thời gian tuần hoàn, hiệu quả đưa thuốc tới đich cũng như độ ổn định công thức Liposome có thành phần cấu tạo tương tự nhau thì kích thước càng lớn sự hấp thu bởi RES càng nhanh [8], [48] Rupa R Sawant1 và các cộng sự đã tiến hành bào chế liposome với các tá dược DSPC :Chol (3:2 tỷ lệ mol) đẩy qua màng lọc 400nm bị thanh thải nhanh gấp 7,5 lần so với liposome đẩy qua màng 200 nm [26] Seynhaeve Ann đã nghiên cứu hiệu quả điều trị khối u rắn nhận thấy liposome có KTTP <100nm có khả năng tập trung vào khối u rắn gấp 5-6 lần so với liposome kích thước 400nm ộ ổn định của liposome cũng giảm theo sự tăng kích thước; KTTP liposome tối ưu trong khoảng 80-250nm [48]

Nhiều biện pháp đã được áp dụng để cải thiện thời gian lưu thông trong tuần hoàn của liposome, giảm tương tác với protein huyết tương và tránh sự tóm bắt của MPS theo nguyên tắc bao phủ bề mặt liposome bằng các phân tử polyme trơ tạo rào cản không gian Phương thức tiếp cận đầu tiên là bào chế liposome mô phỏng màng hồng cầu, bề mặt liposome được gắn thêm gangliosid và dẫn xuất của acid sialic, như monosialogangliosid (GM1) ác biện pháp tiếp theo là tạo ra ―mask‖, ngụy trang liposome bằng cách biến đổi bề mặt liposome sử dụng polyme ưa nước với cấu trúc mạch chính linh động cao ví dụ như các PEG Từ đó tạo ra các liposome có thể lưu thông ổn định hơn trong tuần hoàn, duy trì một nồng độ thuốc cao hơn trong máu với thời gian dài và tích lũy thuốc tốt hơn trong các tổ chức khối u thông qua hiệu ứng EPR [26]

Bổ sung ganglioside GM1 hoặc phosphatidylinositol dẫn đến thời gian tuần hoàn dài hơn Tuy nhiên lại gặp phải khó khăn trong việc thương mại hóa, do đó người ta đi tìm kiếm nguyên liệu thay thế rẻ hơn, an toàn và được chấp nhận trên lâm sàng Trong

đó dẫn chất PEG được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi nhất [26], [22]

1.3 PEG hóa bề mặt liposome

1.3.1 Khái niệm liposome PEG hóa

Liposome PEG hóa còn được gọi là liposome ngụy trang (―stealth‖ liposome)

ể tồn tại lâu trong hệ thống tuần hoàn bề mặt vỏ các liposome được đưa thêm nhóm thân nước có kích thước lớn, tương hợp sinh học là PEG nhằm tạo ra một lớp áo bảo

vệ cho liposome thoát khỏi sự nhận diện của quá trình opsonin hóa, sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan ác liposome PEG hóa hướng đích theo

cơ chế thụ động, do thời gian lưu hành trong tuần hoàn tăng nên thời gian tập trung ở

mô đích tăng nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ [41], [48], [56]

Hiện nay các nhà khoa học tiến hành cải thiện khả năng đưa thuốc tới đích của liposome PEG hóa bằng cách gắn các phối tử hướng đích (ligand) vào đuôi của PEG hoặc gắn lên vỏ liposome ác ligand có thể là kháng thể đơn dòng, vitamin, hoặc các kháng nguyên cụ thể ác liposome này hướng đích theo cơ chế chủ động

Cơ chế tác dụng của PEG

PEG làm tăng thời gian tuần hoàn liposome do tạo ra sự ổn định về không gian PEG hoặc GM1 gắn trên bề mặt liposome tạo ra một lực đẩy không gian làm hạn chế

sự tương tác của các thành phần máu với bề mặt liposome và làm giảm sự liên kết của protein huyết tương do đó giảm tương tác của liposome với opsonin và RES, hạn chế

sự tóm bắt của MPS, hạn chế quá trình opsonin hóa Ngoài ra khi gắn PEG, làm cho

bề mặt liposome trở nên thân nước, làm giảm lực hút thân dầu giữa bề mặt lipid của liposome với protein, hạn chế sự hấp phụ protein lên bề mặt liposome [26], [34], [8] Gắn PEG vào liposome làm giảm mạnh sự tóm bắt của hệ đại thực bào và kéo dài lưu thông máu; do đó cải thiện phân bố trong các mô tưới máu, tạo điều kiện đạt được nồng độ thuốc cao tại khối u, cải thiện hoạt tính chống ung thư huỗi PEG trên

bề mặt liposome còn giúp tránh được hiện tượng kết tụ các liposome nên cải thiện được độ ổn định Sự có mặt của PEG trên bề mặt liposome cung cấp một lực đẩy mạnh giữa các bilayer có thể vượt qua lực hấp dẫnVan der Waals, do đó tránh kết tập tiểu phân [34]

Lợi ch của liposome Doxorubicin PEG hóa

Hiện nay trên thị trường tồn tại nhiều loại chế phẩm liposome OX nhưng nổi bật hơn cả là 2 chế phẩm Myocet và oxil Myocet là liposome quy ước với thành phần là SPC: cholesterol (55:45 tỷ lệ mol) thuốc được nạp vào trong nhờ chênh lệch

pH sử dụng hệ đệm citrat, KTTP 190nm [15] ược động học của Myocet khác nhau đáng kể so với doxorubicin thông thường Thể tích phân bố thấp hơn 25 lần, và diện tích dưới đường cong (AUC) lớn hơn 20 lần so với DOX dạng tự do Tuy nhiên thời gian bán thải t1/2 của Myocet ngắn hơn so với DOX tự do (16h so với 48h) [14] Thử nghiệm lâm sàng pha III của Myocet cho thấy tác dụng chống ung thư tương tự như DOX tự do nhưng độc tính giảm đi đáng kể đặc biệt là độc tính trên tim [14]

Doxil là chế phẩm liposome DOX PEG hóa tuần hoàn dài với thành phần HSPC: Chol: DSPE-PEG2000 ( 56:39:5 tỷ lệ mol ) ược chất được nạp vào trong liposome nhờ chênh lệch nồng độ amoni, KTTP 80-90nm [12] Với liều 50mg/m2 da, thể tích phân bố Doxil thấp hơn 60 lần và U cao hơn 300 lần, tốc độ thanh thải giảm 250 lần (0,1L/h và 45L/h) so với DOX tự do [10], thời gian bán thải t1/2 55h dài hơn nhiều

so với Myocet Thời gian lưu thông trong máu của liposome tăng lên theo sự giảm

kích thước tiểu phân, tính linh động của lớp màng kép và sự có mặt của PEG che phủ

bề mặt liposome [12] oxil được F phê duyệt vào năm 1995 do có hiệu quả điều trị vượt trội trên bệnh nhân ung thư Kaposi's sarcoma, u buồng trứng tái phát, hiệu quả điều trị tương đương trên bệnh nhân u di căn vú, u đa tủy so với DOX tự do ặc biệt

là cải thiện độ an toàn đáng kể, nhất là trên tim trong tất cả các trường hợp so với DOX tự do [10]

Lipo-dox® (TTY BIOPHARM, ài Loan) là một chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa khác trên thị trường với thành phần DSPC: cholesterol: DSPE-PEG2000 ( 56:39:5 tỷ lệ mol) Liposome sử dụng tá dược phospholipid như SP có

độ ổn định cao hơn so với PL chứa chuỗi acyl béo không bão hòa như SP hoặc acyl béo với chuỗi carbon ngắn hơn như HSP Trong một nghiên cứu lâm sàng pha I, Lipo-dox đạt thời gian bán thải t1/2 lên tới 65h Tuy nhiên tác dụng không mong muốn như viêm miệng giảm bạch cầu trung tính, độc tính trường diễn trên da và cơ mạnh hơn so với Doxil [10]

Nhược điểm của iposome doxorubicin PEG hóa:

- Liposome OX PEG hóa làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu đồng thời cũng làm tăng cả thời gian tiếp cận với các mô lành trong cơ thể, do vậy có khả năng gây ra một số tác dụng không mong muốn khác

- Do sử dụng dẫn chất polyme nên khả năng phân hủy sinh học của liposome PEG thấp hơn so với liposome quy ước, thời gian lưu thông dài trong tuần hoàn khiến liposome lắng đọng tại các mô, cơ quan tổ chức gây ra tác dụng phụ khi sử dụng kéo dài Hội chứng tay- chân ( hand–foot syndrome [HFS]) là tác dụng phụ phổ biến của Doxil do sự phân bố của liposome trên da mà không thấy xuất hiện ở các chế phẩm liposome quy ước như Myocet [28] Tác dụng phụ như viêm miệng hay viêm niêm mạc thường gắn liền với oxil hơn OX tự do hay Myocet [15] ộc tính trường diễn

là điểm đáng quan tâm khi sử dụng liposome doxorubicin PEG hóa

1.3.2 Đặc t nh PEG và ảnh hưởng đặc t nh PEG tới liposome

PEG là một polyether diol mạch thẳng có trọng lượng phân tử từ 500-3000 Da với nhiều đặc tính cho phép nó được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm:

Tính tương hợp sinh học cao, độc tính thấp, khả năng sinh miễn dịch và kháng nguyên rất thấp, tăng khả năng hấp thu thuốc.Tan tốt trong nước và nhiều dung môi hữu cơ

 ược sử dụng trong các dẫn xuất protein và peptid chữa bệnh do tăng ổn định của thuốc, tăng khả năng hòa tan, làm giảm độc tính, tăng thời gian bán hủy , giảm thanh thải, giảm miễn dịch

 ó khả năng gắn hoặc hấp phụ dễ dàng lên hệ mang thuốc ó sẵn trên thị trường, giá thành rẻ so với nhiều polyme khác, nhiều chủng loại với khối lượng phân

tử và cấu trúc khác nhau[26]

Khả năng kéo dài thời gian lưu hành liposome trong máu phụ thuộc vào chiều dài chuỗi PEG và trọng lượng phân tử PEG ác PEG chuỗi dài cải thiện thời gian lưu thông trong máu tốt hơn so với PEG chuỗi ngắn [17] Trọng lượng phân tử PEG có ảnh hưởng đến độ linh động của chuỗi PEG Khối lượng phân tử PEG tăng s làm tăng độ linh động trên bề mặt liposome PEG có độ linh động càng cao thì khả năng

ức chế, ngăn cản hiện tượng opsonin hóa và sự phát hiện của các protein và kháng thể càng cao, thời gian liposome trong tuần hoàn càng kéo dài

Khả năng tạo lớp vỏ ưa nước của PEG để tránh kết tập tiểu phân và giảm tương tác giữa liposome và protein trong dịch sinh học chịu ảnh hưởng đáng kể bởi tính linh động trong cấu trúc PEG Torchilin và cộng sự (1994) đã chỉ ra một polyme có cấu trúc cứng nhắc như dextran, khi gắn trên bề mặt liposome không gây ra sự suy giảm trong tương tác liposome-protein như PEG o cấu trúc linh động của PEG khiến cho lớp polyme trở nên khó thấm tạo thành lớp áo bao bọc bảo vệ toàn diện liposome Trong khi phân tử dextran có cấu trúc cứng nhắc, sự quay tự do của các đơn vị polyme xung quanh các liên kết của chúng bị hạn chế không thể tạo ra sự bảo vệ toàn diện cho phân tử liposome [17], [26]

Hình dáng chuỗi PEG trên bề mặt liposome quyết định đến độ ổn định và thời gian bán thải của liposome Cấu trúc dạng nấm được quan sát thấy ở mật độ PEG thấp trên bề mặt liposome trong khi mật độ PEG cao lại cho cấu trúc dạng bàn chải Tương tác giữa các liposome PEG hóa và liposome với thành phần của máu là khác nhau ở hai dạng cấu trúc này, ảnh hưởng đến thời gian lưu hành của liposome trong tuần

hoàn Khối lượng phân tử và mật độ PEG trên bề mặt liposome quyết định hình dạng chuỗi PEG [38]

1.3.3 Nồng độ phospholipid PEG sử dụng

Tỉ lệ thành phần phospholipid PEG ảnh hưởng đến cấu trúc liposome Tăng nồng độ PEG tăng chuyển dạng cấu trúc từ liposome-> micell đĩa-> micell cầu ảnh hưởng tới chất lượng liposome tạo ra [29] Markus Johnsson và các cộng sự (2003) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phospholipid PEG tới cấu trúc liposome Sử dụng tá dược DPPE-PEG2000 ở nồng độ 4,5 mol%; 9,5 mol%; 19,5 mol%; 30,2 mol%

và 68 mol% so với tổng mol lipid bào chế liposome PEG Xác định hình thái liposome tạo thành bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động ( LS) và cryo-TEM

Ở nồng độ PEG-lipid thấp 4,5% mol cấu trúc liposome chiếm đa số nhưng phát sinh liposome hình đa giác, micell đĩa chiếm tỷ lệ nhỏ không đáng kể Khi nồng độ DPPE-PEG2000 tăng tỷ lệ micell đĩa tăng Ở nồng độ 9,5 mol% tỷ lệ micell đĩa chiếm gần 50% Ở nồng độ 19,5 mol% cấu trúc micell đĩa chiếm chủ yếu Tiếp tục tăng nồng

độ DPPE-PEG2000 cấu trúc liposome biến mất hoàn toàn, các micell đĩa kích thước giảm dần và tiến lại gần nhau hình thành nên các micelle cầu Kết quả thu được cho thấy sự hình thành micell trong tất cả các mẫu bào chế Từ các hình ảnh chụp TEM thấy được sự chuyển dạng từ liposome sang micell cầu thông qua sự hình thành các micell dạng đĩa [29]

Nồng độ phospholipid PEG tối ưu nằm trong khoảng 5- 9 mol% so với tổng mol lipid tạo liposome Ở nồng độ đó chuỗi polyme ở dạng cấu trúc hình nấm liên kết yếu với nhau tạo nên sự che phủ toàn bộ bề mặt liposome ngăn cản hiện tượng opsonin hóa ưới khoảng nồng độ này, độ che phủ bề mặt liposome của PEG là chưa hoàn toàn, điều này cho phép opsonin tiếp cận với bề mặt tiểu phân và quá trình thực bào xảy ra Ở nồng độ trên 9 mol% với mật độ cao PEG che phủ trên bề mặt khiến chuỗi polyme có hình dáng giống bàn chải, điều này làm mất ổn định màng lipid kép do lực đẩy ngang của chuỗi PEG gây ra [33, 38]

1.3.4 Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa

Liposome có thể được bào chế theo nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp tráng phim, pha loãng alcol, đông khô, phương pháp bốc hơi pha đảo, PEG có thể

được gắn đồng thời trong quá trình bào chế liposome hoặc gắn sau khi tạo ra liposome hoàn chỉnh [36]

Hình 1.3: Kỹ thuật bào chế liposome PEG hóa [33]

A Gắn PEG trong quá trình bào chế liposome

B Gắn PEG sau quá trình bào chế liposome thông qua micell

C Gắn PEG sau quá trình bào chế liposome nhờ liên kết đồng hóa trị

 Gắn PEG trong quá trình bào chế liposome (Pre-modification)

Phương pháp gắn PEG trong quá trình tạo liposome là phương pháp được sử dụng phổ biến trên thế giới để tạo liposome PEG hóa Tá dược phospholipid gắn PEG

s được hòa tan trong dung môi hữu cơ cùng với các nguyên liệu tạo liposome trước khi hydrat hóa tạo màng film [34],[36] Phương pháp này tiến hành tương đối dễ

dàng, tuy nhiên nhược điểm là PEG s phân bố ở cả hai phía của lớp màng kép (hình

- Khi nồng độ PEG lớn, hỗn dịch có độ nhớt cao, rất khó đảm bảo các liposome qua được các màng lọc với kích thước lỗ lọc giảm dần trong quá trình giảm kích thước tiểu phân ây là một khó khăn lớn trong bào chế ở quy mô công nghiệp

- Do tá dược phospholipid gắn PEG phân bố ở cả 2 bên màng liposome nên thành phần lipid của dẫn suất PEG-lipid ở phía trong màng dễ bị thủy phân ở môi trường đệm pH thấp trong liposome (khi cần tạo chênh lệch pH để đưa dược chất vào liposome) ồng thời PEG s chiếm không gian khoang nước liposome của dược chất, làm giảm lượng dược chất được nạp vào liposome [36]

- Kích thước liposome càng nhỏ, ảnh hưởng của PEG ở khoang nước đến độ ổn định của liposome càng lớn, đặc biệt đối với liposome đa lớp thì thể tích mang dược chất giảm xuống rất nhiều [32]

 Gắn PEG sau quá trình bào chế liposome (Post- modification)

ó hai kỹ thuật chính:

 Kỹ thuật post-insertion ( hình 1.3B): dựa trên sự di chuyển của phân tử

PEG-lipid từ pha PEG-lipid này sang pha PEG-lipid khác trong môi trường nước Ở nồng độ trên nồng

độ tới hạn tạo micell, các tá dược phospholipid gắn PEG s hình thành nên các micell Khi ủ hỗn hợp micell PEG và liposome ở điều kiện nhiệt độ thích hợp dẫn suất PEG-lipid chuyển từ các micel sang liposome, kết quả thu được liposome PEG hóa [26]

Ưu điểm :

- PEG chỉ gắn ở mặt ngoài của liposome, không làm giảm không gian bên trong khoang nước của dược chất, hạn chế sự thủy phân của thành phần lipid

- Sự chuyển pha lipid từ micell sang liposome diễn ra ở ngay nhiệt độ thường

200 C, thời gian chuyển pha ngắn (5-10 phút)

Nhược điểm:

- Khả năng chèn PEG – lipid vào bề mặt liposome phụ thuộc vào chiều dài chuỗi PEG, chuỗi càng dài càng khó gắn

- Phải loại micell tự do sau bào chế bằng sắc ký lọc gel

 Kỹ thuật post-coupling (hình 1.3C): nguyên tắc của phương pháp là dựa vào

phản ứng hóa học để tạo liên kết đồng hóa trị giữa PEG đã hoạt hóa với nhóm phản ứng trên bề mặt liposome Phương pháp này có nhược điểm là dung môi và điều kiện

phản ứng dễ phá vỡ cấu trúc liposome, khó khăn trong việc tách các chất phản ứng và sản phẩm phụ, do đó ít được sử dụng hơn [58], [46]

1.4 Những nghiên cứu gần đây về liposome doxorubicin

Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều

sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học

Yanfang Yang và các cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu bào chế liposome PEG nhạy cảm nhiệt gắn phối tử hướng đích N R và peptid thâm nhập tế bào (CPPs-Cell penetrating peptid) trong điều trị ung thư di căn Gắn DOX với PPs thông qua liên kết liên hợp N-Succinimidyl 3-maleimidopropionat (SMP) Liposome được bào chế theo phương pháp tráng phim angham Giảm KTTP bằng phương pháp siêu âm tạo liposome SUVs Nạp DOX vào liposome nhờ chênh lệch gradient pH Kết quả tạo

ra liposome với kích thước 90nm, hiệu suất nạp thuốc trên 95%, giải phóng chậm ở

370 và giải phóng tối ưu ở 420C ánh giá tác dụng invivo trên khối u HT1080 chuột

nude trong vòng 22 ngày, tác dụng ức chế khối u mạnh nhất được quan sát thấy ở ngày cuối của nghiên cứu ở nhóm CPP-DOX/NGR-TSL liposome (15mg/kg): 83,41± 4,7% ác thay đổi trọng lượng cơ thể trong thời gian điều trị cũng được theo dõi để đánh giá tác dụng phụ của các công thức khác nhau Với mức liều 10mg/kg, DOX tự

do thể hiện tác dụng ức chế khối u hiệu quả nhưng 25% số chuột giảm cân và gần 100% chuột chết sau 14 ngày Nhóm PP-DOX chỉ có 12% số chuột giảm cân, không

có chuột chết cho thấy hình thức liên hợp CPP-DOX là an toàn hơn so với sử dụng dạng DOX tự do Không có sự thay đổi trọng lượng của nhóm chuột được điều trị ở các công thức liposome cho thấy ưu điểm của dạng bào chế liposome so với dung dịch truyền thống Khi tăng liều sử dụng 15mg/kg tất cả các nhóm trọng lượng chuột đều giảm trừ CPP-DOX/NGR-TSL [60]

Koji Nakamura và các cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu so sánh liposome doxorubicin PEG hóa (PLD- PEGylated liposome doxorubicin) bào chế bằng 2 phương pháp: Gắn PEG trong và sau quá trình bào chế liposome [36] Tỷ lệ HSPC: Chol: DSPE-PEG5000 (54:46:0,5-2 mol%) Giảm KTTP bằng phương pháp nén đẩy qua màng polycarbonate 200 nm và 100 nm OX nạp vào liposome nhờ chênh lệch nồng độ amoni Hiệu suất liposome hóa cả 2 phương pháp đều trên 90% Tiến hành

nghiên cứu độ ổn định tại 25° trong 4 tuần Khoảng 20% DSPE-PEG5000 ở liposome bào chế theo phương pháp gắn PEG trong quá trình bào chế liposome bị thủy phân sau

2 tuần, trong khi không có sự suy giảm nồng độ PEG sau 4 tuần ở liposome bào chế theo phương pháp gắn PEG sau khi bào chế liposome Nghiên cứu đánh giá dược động học PLD cho thấy t1/2 của 2 mẫu bào chế không khác biệt có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên AUC của PL bào chế theo phương pháp gắn PEG sau cao hơn so với gắn PEG trong bào chế liposome ( 766,3±17,9 và 683,4±18,7mg.h/l) đồng thời Vd lại nhỏ hơn (31,3±1,1 và 38,3±1,6ml/kg) cho thấy tác dụng điều trị của PL bào chế theo phương pháp post-modification cao hơn, khả năng gây tác dụng phụ không mong muốn thấp hơn so với PL bào chế theo phương pháp pre-modification [36]

Sugata Barui và cộng sự (2014) tiến hành bào chế liposome PEG hóa gắn phối tử hướng đích RG K-Lipopeptide chứa đồng thời cả hai dược chất là OX và curcumin (cur) Hòa tan OP : cholesterol: RGDK lipopeptide gắn PEG: DSPE-(PEG)27-NH2(1:0,818:0,05:0,01 tỷ lệ mol) trong hỗn hợp cloroform : methanol ( 3:1 v/v) Hòa tan curcumin trong hỗn hợp cloroform : methanol ( 1:1 v/v) ay hơi dung môi bằng thiết

bị cất quay chân không trong 8h Hydrat hóa liposome curcumin bằng nước cất 2 lần, liposome hỗn hợp 2 dược chất bằng đệm citrat pH 4,0 Giảm KTTP bằng phương pháp đóng băng- tan chảy 5 lần ở -780C, loại curcumin chưa nạp vào liposome bằng phương pháp ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 45 phút Nạp DOX nhờ chênh lệch

pH, hiệu suất liposome hóa ~ 100% , KTTP 190-230nm ánh giá tác dụng invivo

trên khối u B16F10 tác dụng ức chế khối u trên 4 lô chuột chứng, lipo DOX , lipo cur

và Lipo OX+cur, sau 24 ngày kích thước khối u của lô chuột chứng trên 4000mm3

, lớn hơn hẳn so với lô chuột sử dụng lipo OX và lipo cur trên 1000mm3, trong khi đó

lô chuột sử dụng lipo OX+ cur kích thước khối u chưa tới 500mm3 Ở lô chứng sau

25 ngày chuột chết, ở lô lipo OX là 50 ngày và thời gian sống ở chuột sử dụng lipo OX+cur lên tới 80 ngày ánh giá phân bố sinh học, các công thức liposome đều có nồng độ OX trong các mô khối u tìm thấy cao hơn đáng kể so với trong các mô cơ thể khác như phổi, gan, thận, lá lách và tim Tuy nhiên nồng độ OX tích lũy trong tổ chức u của lipo OX+ cur là 60µg/ml cao hơn so với Lipo DOX( 45µg/ml), trong khi tại thận nồng độ DOX của lipo DOX+ cur <5µg/ml thấp hơn so với lipo DOX

(10µg/ml) iều này chứng minh tác dụng hiệp đồng của 2 thuốc trong việc tăng hiệu quả điều trị, giảm độc tính [13]

Từ một số nghiên cứu nói trên ta có thể nhận thấy rằng xu hướng hiện nay trên thế giới là tập trung phát triển các dạng liposome nhạy cảm, hướng đích hoặc kết hợp các dược chất có tác dụng hiệp đồng trong cùng 1 công thức liposome… nhằm tăng tính hướng đích chủ động, tăng tác dụng điều trị, giảm tác dụng phụ

Tại Việt Nam, trường ại học ược Hà Nội là đơn vị tiên phong đầu tiên trong nghiên cứu về liposome ứng dụng làm hệ mang thuốc Một số nghiên cứu đã đưa ra được công thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC :cholesterol (10:2 w/w), sau đó sử dụng siêu âm để làm giảm kích thước, sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến để tiến hành đổi đệm, tạo ra các liposome có sự chênh lệch pH hai bên màng Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ thủy tinh có chứa bột đông khô của doxorubicin và ủ ở 50o trong 15 phút Kết quả tạo ra liposome doxorubicin có kích thước dưới 200 nm, hiệu suất liposome trên 80% ánh giá tác dụng chống ung thư trên khối u cơ và khối u dưới da chuột cho thấy sản phẩm của nghiên cứu cho tác dụng tốt hơn so với dạng thuốc tiêm dung dịch doxorubicin nhưng còn hơi kém so với Lipodox [2] ,[3], [5]

Nguyễn Thu Trang (2014) đã nghiên cứu và xây dựng được quy trình bào chế liposome DOX 2 mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol với thành phần gồm HSPC: Chol (10:3, w/w) Quá trình bào chế trải qua các bước: hòa tan HSP , hol trong ethanol và đệm citrat trong nước, tiêm nhanh pha ethanol vào dung dịch đệm kết hợp khuấy trộn bằng máy đồng nhất hóa, cô đặc mẫu bằng hệ thống lọc tiếp tuyến

tự động, đổi đệm bên ngoài liposome bằng HEPES pH 7,4 và gắn dược chất Liposome thu được có KTTP < 200nm, P I ~ 0,2 và hiệu suất liposome hóa đạt 90% Nghiên cứu cho thấy bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol đã khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp hydrat hóa film như thời gian bào chế dài, phải sử dụng phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân, tuy nhiên còn tồn tại những hạn chế nhất định như tỉ lệ pha loãng ethanol quá lớn nên phải trải qua giai

đoạn cô đặc để giảm thể tích đồng thời chưa kiểm soát được lượng ethanol tồn dư trong chế phẩm thuốc tiêm [6]

Các nghiên cứu về liposome doxorubicin hiện nay chủ yếu tập trung vào bào chế

và đánh giá tác dụng sinh học của liposome DOX quy ước gồm hai thành phần là phospholipid và cholesterol Chưa có nghiên cứu nào sử dụng tá dược phospholipid

PEG để tăng thời gian tuần hoàn liposome

1.5 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng invitro trên tế bào ung thư

từ máu và tủy xương; ung thư mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ và ung thư hắc tố (melanoma) do rối loạn của tế bào sắc tố

Ung thư biểu mô( carcinoma):

- Ung thư phổi: Lewis lung carcinoma, Colo-699-N, H460, A549 [24], [37], [18, 61],[53]

- Ung thư buồng trứng: Ovacar-3, OV-1063 [16], [31], [37]

- Ung thư vú: BT-474, SC-115, HER-2, MCF-7, [38] [60], [61],[ 16]

- Ung thư đại tràng: -26, HCT-116, HT-1080 [18], [ 36],[38] [61]

- Ung thư vòm họng có vảy nhỏ: KLN-205, SAS [18], [37]

- Ung thư tế bào gan: HEP G2, W256, QGY [17], [37]

- Ung thư tuyến tụy: Panc-1, MIA, Paca-2, DSL6A [40], [18]

- Ung thư tuyến tiền liệt: PC-3, PU145 [18] [ 37] [38]

Ung thư mô liên kết (sarcoma): Kaposi‘s sarcoma, TG180 sarcoma [37, 61], [12]

Ung thư huyết học (hematological malignancy): P388 leukemia, L1210, J-6456

lymphoma, KBcell [37] [55]

 Ung thư hắc tố (melanoma): B16BL6, BLM [47], B16F10 [12] [37]

1.5.2 Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào

ể đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, cần tiến hành đánh giá độc tính trên tế bào ác tế bào được nuôi cấy trong môi trường, nhiệt độ, thời

gian thích hợp Sau đó đánh giá độc tính của thuốc bằng các phương pháp khác nhau

ó rất nhiều phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào khác nhau, một số

phương pháp thường dùng:

- Thứ nghiệm SRB (sulforhodamine B) : Phép thử tiến hành xác định tổng hàm

lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD-Optical ensity) đo được khi protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine (SR ) SR là một thuốc nhuộm màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic tích điện âm, hai nhóm này s liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Giá trị O máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị O càng lớn [49]

- Phương ph p nghiên cứu sàng lọc MTT: Thử nghiệm MTT

[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] được thực hiện dựa trên hoạt động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống có khả năng chuyển hóa chất MTT màu vàng thành một sản phẩm có màu tím không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch chuyên dụng Khi tế bào chết thì ty thể không còn khả năng chuyển hóa MTT thành chất màu Sản phẩm tạo ra từ phản ứng MTT có màu đặc trưng và có thể định lượng được bằng cách đo mật độ quang với bước sóng hấp thụ đặc trưng Mật độ quang đo được từ thử nghiệm MTT tỷ lệ thuận với số lượng các tế bào sống có mặt trong các giếng nuôi [20]

- Phương ph p ếm tế ào với xanh Trypan: Phương pháp này sử dụng xanh

trypan nhuộm màu tế bào để xác định trực tiếp số lượng tế bào sống hay chết trong buồng đếm Xanh trypan là loại thuốc nhuộm chỉ có thể đi qua màng tế bào chết Do

đó khi trộn dịch tế bào với thuốc nhuộm các tế bào chết s phồng to lên và có màu xanh đen [52]

1.6 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm

1.6.1 ộng vật thực nghiệm

ộng vật thí nghiệm dùng để đánh giá tác dụng rất đa dạng, chủ yếu tiến hành trên các chủng chuột như: L /c, C57BL/6, C3H/HeJ, Swiss, SCID nude, NMRI, SLC Wistar/ST [13, 17], [23], [61] Chuột có thể bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lượng tế bào miễn dịch lympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [25]

Tất cả các động vật thực nghiệm đều phải tuân thủ các yêu cầu của ạo luật quốc gia về đạo đức trong việc sử dụng động vật thí nghiệm như: C57BL/6 (Trung quốc, The National Act on the Use of Experimental Animals)[24] NMRI (Hoa Kỳ, The National Institutes of Health Animal Care and Use guidelines) [16], nude BALB/c ( Hoa Kỳ, The Animal Care and Use Committee of Fourth Military Medical University) [61] …

1.6.2 Phương pháp đánh giá tác dụng

ộng vật thực nghiệm là chuột nhắt thường chọn những con từ 6 – 8 tuần tuổi, nặng từ 18 – 22g [24],[13], [16], [53], [41] ác tế bào sau khi nuôi cấy s được đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm Vị trí cấy tế bào rất khác nhau tùy vào loại tế bào ung thư: hông bên phải và hông bên trái, lưng, màng bụng, phổi, gan bàn chân, dưới da vùng cổ, dưới da đùi, thùy trái gan ác khối u rắn (solid tumor) có thể được cấy truyền theo đường dưới da hoặc tiêm vào bắp, cơ của động vật ác khối u báng (ascites tumors) có thể được tiêm vào ổ bụng Số lượng tế bào mang cấy khoảng

105 – 107/chuột

Sau đó chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công thức khác nhau Liều doxorubicin tiêm vào chuột rất khác nhau tùy vào từng thí nghiệm: 1,5 mg/kg [16]; 2,5 mg/kg [16], 5 mg/kg [61], 10 mg/kg [37] [60], 15 mg/kg [60] Thường tiêm nhắc lại sau 1 tuần Thời điểm bắt đầu tiến hành rất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm Có thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn Thường để các tế bào phát triển từ 1 – 2 tuần, cũng có khi tới 4 tuần hoặc đến khi thể tích u đạt đến một mức nào đó (khoảng

100 – 400 mm3)

ác chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị của liposome DOX gồm: thể tích khối u, trọng lượng cơ thể giữa các nhóm chuột, tỷ lệ sống/ chết, thời gian sống sót trung bình, khả năng tập trung thuốc tại khối u, nồng độ thuốc tại các cơ quan thường, các thông số dược động học của thuốc…Mô hình thống kê thường sử dụng trong đánh giá các chỉ tiêu thí nghiệm như: mô hình mỗi nhóm một trung bình thuật toán one way-ANOVA, kiểm định Student‘s t-test, two way onferroni‘s test, paired t-test dựa vào chỉ số p<0,05 khẳng định các nhóm có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê [13, 60] [24], [47], [55]

HƯƠNG 2 ỐI TƯ NG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN U 2.1 ối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 ối tượng nghiên cứu

- Liposome doxorubicin PEG hóa

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu

chuẩn

3 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã

7 HEPES (N-2-hydroxy ethyl piperazin –

N – 2 – ethan sulfonic acid) Mỹ USP

9 Triton X100 (Octylphenolpoly –

(ethylen glycolether) Amresco Ohio-Mỹ TKHH

19 MTT [3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2 –

yl) – 2,5 – diphenyltetrazolium bromid] Sigma Aldrich USP

- òng tế bào ung thư phổi ( 549) và ung thư đại tràng (HT29) (công

ty American Type Culture Collection (ATCC), Hoa Kỳ)

- Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c ( ông ty harles-River, Hoa Kỳ)

Môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường Eagle's Minimum Essential Medium, môi trường Roswell Park Memorial Institute( RMPI) (công ty T , Hoa Kỳ), được bổ sung 10% FBS (fetal bovine serum- Huyết thanh bò) và 1% kháng sinh penicillin và

streptomycin

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu

Máy cất quay Rotavapor R-210 (Buchi- ức) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1200 infinity (Agilent) Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ), màng polycarbonate kích thước lỗ lọc 400-200-100-50nm Màng lọc cellulose acetate 0,45- 0,2µm Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex - c5 (Avestin – Canada) Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ 50kD, diện tích lọc 20cm2(Mỹ) Túi thẩm tích Spectrumlab/Por 4, MW O: 12 -14 kD (Spectrum Labs- Mỹ) Bể điều nhiệt (Buchi- ức) Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh) Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich- ức)

Tủ an toàn sinh học cấp 3 (Biobase class 3) Máy quang phổ UV-VIS 1800(Hitachi-Nhật Bản) và các dụng cụ thông thường khác

U-2.1.4 Thuốc đối chiếu

- Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin Ebewe lọ 25ml, 2mg/ml (Ebewe pharma)

Số lô: 20141108 Hạn dùng: 11/2017

- Thuốc tiêm liposome: Lipo ox lọ 10ml, 2mg/ml ( TTY Bio pharm, ài Loan)

Số lô: 20130709 Hạn dùng: 9/2016

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

Dựa theo kết quả của các nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đã đạt được, kết hợp với các nghiên cứu trên thế giới [50], liposome doxorubicin PEG hóa được bào chế theo phương pháp tráng film angham trải qua 2 giai đoạn sau:

ào chế liposome chưa mang dược chất:

Tạo lớp film lipid: ân các thành phần HSPC: Chol: DSPE-PEG2000 theo công thức, hòa tan hoàn toàn trong cloroform Bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50o trong điều kiện chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút, thời gian cất quay 12 giờ

Hydrat hóa: sử dụng đệm amoni sulfat pH 5,5 đã lọc qua màng lọc 0,2 μm Tăng

tốc độ quay lên 80 vòng/phút và tăng nhiệt độ lên 55-600C Sau 90 phút hydrat hóa thu được hỗn dịch liposome

Giảm kích thước liposome: sử dụng 2 kỹ thuật: đùn qua màng hoặc đồng nhất

hóa áp suất cao

Sử dụng thiết bị đùn tay mini extruder: hỗn dịch tạo thành lần lượt qua các màng polycarbonat có kích thước giảm dần từ 400nm - 50nm; nén tuần hoàn 10 chu kỳ/màng, nhiệt độ khi nén duy trì 550C- 600 C

Sử dụng thiết bị nén áp suất cao khí nén nitrogen Nén lặp lại nhiều chu kỳ ở điều kiện nhiệt độ vào áp suất thích hợp đến khi đạt KTTP và P I mong muốn Sau cùng lọc hỗn dịch qua màng 0,2 µm

ào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin:

Đổi môi trường ngoài liposome: Sử dụng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động để đổi

môi trường bên ngoài liposome bằng các hệ đệm thích hợp

Đưa dược chất vào liposome:

- ân chính xác lượng doxorubicin hydroclorid cho vào hỗn dịch liposome để đạt hàm lượng 2 mg/ml, sử dụng thiết bị khuấy từ để hòa tan và khuếch tán OX vào trong liposome Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ 55 - 60o để quá trình khuếch tán diễn ra hoàn toàn Lọc chế phẩm qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm

- Liposome được đóng trong lọ thủy tinh 10 ml, đóng nút cao su và siết nắp nhôm, bảo quản tránh ánh sáng ở 2 – 8oC

2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo thành

2.2.2.1 Hình thức

Hỗn dịch hơi đục mờ màu đỏ-da cam, để thời gian dài có thể bị lắng cặn nhưng phải dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ

2.2.2.2 Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái iposome

Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua TEM với kỹ thuật nhuộm soi âm bản và cắt lớp siêu mỏng xác định hình thái và cấu trúc của liposome

2.2.2.3 Phương pháp đánh giá k ch thước và phân bố k ch thước của iposome

Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch đẳng trương Na l 0,9% (đã lọc qua màng 0,2 μm) rồi đo phân bố kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động ( LS) trên thiết bị Zetasizer ZS90 ánh giá đặc tính phân bố kích thước tiểu phân qua chỉ số đa phân tán P I, KTTP, đồ thị phân bố kích thước tiểu phân

2.2.2.4 Phương pháp xác định thế Zeta

Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch nước cất 2 lần lọc qua màng lọc 0,2 μm, bơm từ từ vào cuvet sao cho không xuất hiện bọt khí ho cuvet vào buồng đo của thiết bị Zetasizer ZS90 và tiến hành đo

2.2.2.5 Phương pháp định ượng

a Định lượng Doxorubicin bằng phương ph p o quang [4]; [5]

Chuẩn bị dãy chuẩn: ân chính xác 100mg doxorubicin.H l, hòa tan hoàn toàn

trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 thu được dung dịch gốc (1000 µg/ml)

Từ dung dịch gốc đem pha loãng bằng đệm phosphat pH 4,0 để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 1 đến 20 µg/ml ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 tới 12 µg/ml được đo quang ở bước sóng 233 nm ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 6 đến

20 µg/ml được đo quang ở bước sóng 481 nm ả hai trường hợp đều sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 4,0 Từ kết quả thu được, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính, v đồ thị biểu hiện mối quan hệ tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dãy chuẩn

Dược chất toàn phần:

Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml liposome, thêm 1 ml dd Triton X100 10% (tt/tt)

vào bình định mức 10 ml, bổ sung đệm phosphat pH 4,0 vừa đủ Lắc kỹ, để yên 5 phút ể lạnh ở nhiệt độ khoảng 5oC trong 2 giờ em ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút, ở 4-6o để loại bỏ phần lipid Phần dịch trong được pha loãng tiếp bằng dung dịch đệm phosphat pH 4,0 với tỉ lệ pha loãng phù hợp để đạt nồng độ khoảng 10

µg/ml o quang ở bước sóng 481 nm Tính toán nồng độ dược chất toàn phần dựa vào phương trình đường chuẩn tại bước sóng 481nm

Dược chất tự do:

Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml chế phẩm cho vào túi thẩm tích, kẹp kín túi,

nhúng túi thẩm tích sao cho phần chứa thuốc ngập sâu trong chai thủy tinh chứa 100ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 ể yên 24h ở nhiệt độ từ 5-100C Sau 24h dừng thẩm tích lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích đem đo quang tại bước sóng 233 nm Tính toán nồng độ dược chất tự do dựa vào phương trình đường chuẩn tại bước sóng 233nm

Hiệu suất liposome hóa:

Tính hiệu suất liposome hóa theo công thức:

H = TP.V0 – N.VN

TP.V0 100 (%) H: Hiệu suất liposome hóa

CN, CTP: Hàm lượng DOX tự do và OX toàn phần (mg/ml)

VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml)

b Định lượng DOX ằng phương ph p HP C

Dược chất toàn phần: Dựa theo tham khảo USP37-NF30 [57], định lượng

doxorubicin bằng phương pháp HPL (điều chỉnh điều kiện sắc ký cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm) Hệ sắc ký gồm:

Đi u kiện s c ký: Cột phenomenex 18 (250x 4,6mm, 5µm) Detector: UV –

VIS, 254 nm Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút Thể tích tiêm: 20 µl

Pha ộng: Hòa tan 1g natri lauryl sulfat vào 1000 ml hỗn hợp gồm nước -

acetonitril – methanol - acid phosphoric theo tỷ lệ (400:450:150:2), điều chỉnh đến pH 3,6 ±0,1 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 N

Dung dịch phân giải: Hòa tan 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn trong 5 ml

nước, thêm 5 ml acid phosphoric, để yên 30 phút iều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 2M đến pH 2,6 ± 0,1 Thêm 15 ml acetonitril và 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm

Dung dịch chuẩn: ân chính xác 10 mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa

tan trong pha động để đạt nồng độ 40 µg/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm Tiêm lần lượt dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký

Yêu cầu của hệ s c ký: Số đĩa lý thuyết không được nhỏ hơn 2000, hệ số bất đối

xứng của pic chính không được quá 1,5; hệ số phân giải của 2 pic doxorubicin và doxorubicinon không được nhỏ hơn 5,5 (thời gian lưu tương đối pic doxorubicinon là 0,4 và của doxorubicin là 1,0 ộ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic doxorubicin hydroclorid với 6 lần tiêm không được lớn hơn 2%

Dung dịch thử: Lấy 1 ml chế phẩm tương ứng 2 mg doxorubicin Thêm 1ml

dung dịch Triton X100 10% Lắc kỹ rồi pha loãng với pha động để đạt hàm lượng khoảng 40 µg/ml ể yên 2h Ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút Lấy phần dịch trong Chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử, dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và thử để tính ra hàm lượng OX toàn phần

Dược chất tự do – Hiệu suất liposome hóa:

Đi u kiện s c ký và pha ộng: tương tự phần định lượng doxorubicin

hydroclorid nhưng thể tích tiêm mẫu là 100 µl

Dung dịch thử: Xử lý như mẫu thử ở mục 2.2.2.5a Sau 24 h dừng thẩm tích

Lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích lọc qua màng lọc 0,45 µm ịch lọc được sử dụng

để chạy sắc ký

Dung dịch chuẩn: ân chính xác 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa

tan trong pha động để có nồng độ khoảng 2 µg/ml

Tính kết quả dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic, thể tích dung dịch thử, hàm lượng các chất chuẩn, độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra hàm lượng doxorubicin hydroclorid tự do đã thẩm tích vào môi trường đệm phosphat pH 4 Hàm lượng doxorubicin liposome hóa tính theo công thức:

c Định lượng lipid - tỷ lệ dược chất/lipid bằng phương ph p o quang

Phospholipid là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp màng liposome, tỉ lệ dược chất/lipid có ảnh hưởng trực tiếp tới độ ổn định và khả năng giải phóng dược

chất của dạng bào chế liposome nói chung [62], [30] hính vì vậy, định lượng lipid là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng của liposome doxorubicin

Tham khảo các nghiên cứu của Stewart và cộng sự [51] định lượng phospholipid bằng phương pháp đo quang, kết hợp điều chỉnh các điều kiện thí nghiệm cho phù hợp

đã xây dựng được phương pháp định lượng phospholipid như sau:

Nguyên t c: phospholipid có khả năng tạo phức màu với sắt amoni thiocyanat,

dựa vào phương pháp đo quang để xác định nồng độ phospholipid

Thuốc thử ferrocyanat: Hoà tan 27,03g sắt(III)clorid hexahydrat và 30,4g

amonithiocyanat trong nước cất thành 1lit dung dịch

Mẫu chuẩn: ân chính xác khoảng 10mg HSPC đối chiếu (MW=783,774) và

2mg doxorubicin.HCl cho vào bình định mức 100ml, thêm 70ml chloroform, lắc siêu

âm 5 phút Thêm tiếp cloroform tới vạch thu được dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid khoảng 0,1 mg/ml (tương ứng 0,13 µmol/ml) Lần lượt hút 4,0; 6,0; 8,0

và 10,0 ml dung dịch chuẩn vào bình định mức 20 ml Thêm vừa đủ bằng cloroform tới vạch, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid lần lượt là 0,026; 0,039; 0,052; 0,065 µmol/ml

Chuẩn bị 4 ống ly tâm 50ml; lần lượt cho vào mỗi ống 10ml dung dịch dãy chuẩn và 10ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform Lọc qua màng lọc 0,45µm bỏ 5ml dịch lọc đầu

Mẫu tr ng: ân chính xác khoảng 2mg doxorubicin.H l cho vào bình định mức

100ml, thêm 70ml chloroform, lắc siêu âm trong 5 phút Thêm tiếp chloroform tới vạch thu được dung dịch mẫu trắng Hút 10ml mẫu trắng và 10ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat vào ống ly tâm 50ml, xử lý tương tự mẫu chuẩn

Mẫu thử: Hút chính xác 1,0ml chế phẩm (nồng độ phospholipid toàn phần

khoảng 13,36 µmol/ml) vào cốc có mỏ 100ml Thêm 0,5ml ethanol và 1ml cloroform lắc nhẹ nhàng tạo dung dịch đồng nhất Bốc hơi ở nhiệt độ phòng thu được cắn, sấy cắn ở 60° trong 2h Hoà tan cắn trong 100ml chloroform đạt nồng độ khoảng 0,13 µmol/ml Hút chính xác 6,0ml dung dịch này vào bình định mức 20 ml Thêm vừa đủ