ộng vật thực nghiệm là chuột nhắt thƣờng chọn những con từ 6 – 8 tuần tuổi, nặng từ 18 – 22g [24],[13], [16], [53], [41]. ác tế bào sau khi nuôi cấy s đƣợc đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm. Vị trí cấy tế bào rất khác nhau tùy vào loại tế bào ung thƣ: hông bên phải và hông bên trái, lƣng, màng bụng, phổi, gan bàn chân, dƣới da vùng cổ, dƣới da đùi, thùy trái gan. ác khối u rắn (solid tumor) có thể đƣợc cấy truyền theo đƣờng dƣới da hoặc tiêm vào bắp, cơ của động vật. ác khối u báng (ascites tumors) có thể đƣợc tiêm vào ổ bụng. Số lƣợng tế bào mang cấy khoảng 105 – 107/chuột.
Sau đó chuột đƣợc chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công thức khác nhau. Liều doxorubicin tiêm vào chuột rất khác nhau tùy vào từng thí nghiệm: 1,5 mg/kg [16]; 2,5 mg/kg [16], 5 mg/kg [61], 10 mg/kg [37] [60], 15 mg/kg [60]. Thƣờng tiêm nhắc lại sau 1 tuần. Thời điểm bắt đầu tiến hành rất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm. Có thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn. Thƣờng để các tế bào phát triển từ 1 – 2 tuần, cũng có khi tới 4 tuần hoặc đến khi thể tích u đạt đến một mức nào đó (khoảng 100 – 400 mm3).
21
ác chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị của liposome DOX gồm: thể tích khối u, trọng lƣợng cơ thể giữa các nhóm chuột, tỷ lệ sống/ chết, thời gian sống sót trung bình, khả năng tập trung thuốc tại khối u, nồng độ thuốc tại các cơ quan thƣờng, các thông số dƣợc động học của thuốc…Mô hình thống kê thƣờng sử dụng trong đánh giá các chỉ tiêu thí nghiệm nhƣ: mô hình mỗi nhóm một trung bình thuật toán one way- ANOVA, kiểm định Student‘s t-test, two way onferroni‘s test, paired t-test dựa vào chỉ số p<0,05 khẳng định các nhóm có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê [13, 60] [24], [47], [55].
22
HƢƠNG 2. ỐI TƢ NG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN U 2.1. ối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu 2.1.1. ối tƣợng nghiên cứu
-Liposome doxorubicin PEG hóa.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu.
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu
chuẩn
1 Doxorubicin hydroclorid Ấn ộ USP
2 Cholesterol Sigma Aldrich USP
3 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã
hydrogen hóa (HSP ) Lipoid NSX
4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamin-N-
[amino(polyethylen glycol)-2000]
Lipoid NSX
5 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH
6 Acid citric Trung Quốc TKHH
7 HEPES (N-2-hydroxy ethyl piperazin –
N – 2 – ethan sulfonic acid) Mỹ USP
8 Acid phosphoric Merk - ức TKHH
9 Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether) Amresco Ohio-Mỹ TKHH
10 Sucrose Fisher – Anh BP
11 Natri hydroxid Trung Quốc TKHH
12 Natri clorid Trung Quốc TKHH
13 Methanol Merk – ức USP
14 Acetonitril Merk – ức USP
15 Natri laurylsufat Trung Quốc BP
16 Sắt (III) clorid hexahydrat Trung Quốc TKHH
17 Amoni thiocyanat Trung Quốc TKHH
18 Chloroform Trung Quốc TKHH
19 MTT [3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2 –
23
- òng tế bào ung thƣ phổi ( 549) và ung thƣ đại tràng (HT29) (công ty American Type Culture Collection (ATCC), Hoa Kỳ).
-Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c ( ông ty harles-River, Hoa Kỳ).
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào: Môi trƣờng Eagle's Minimum Essential Medium, môi trƣờng Roswell Park Memorial Institute( RMPI) (công ty T , Hoa Kỳ), đƣợc bổ sung 10% FBS (fetal bovine serum- Huyết thanh bò) và 1% kháng sinh penicillin và streptomycin.
2.1.3. Phƣơng tiện nghiên cứu
Máy cất quay Rotavapor R-210 (Buchi- ức). Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1200 infinity (Agilent). Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ), màng polycarbonate kích thƣớc lỗ lọc 400-200-100-50nm. Màng lọc cellulose acetate 0,45- 0,2µm. Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex - c5 (Avestin – Canada). Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ 50kD, diện tích lọc 20cm2(Mỹ). Túi thẩm tích Spectrumlab/Por 4, MW O: 12 -14 kD (Spectrum Labs- Mỹ). Bể điều nhiệt (Buchi- ức). Thiết bị phân tích kích thƣớc tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh). Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich- ức). Tủ an toàn sinh học cấp 3 (Biobase class 3). Máy quang phổ UV-VIS U- 1800(Hitachi-Nhật Bản) và các dụng cụ thông thƣờng khác.
2.1.4. Thuốc đối chiếu
-Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin Ebewe lọ 25ml, 2mg/ml (Ebewe pharma). Số lô: 20141108. Hạn dùng: 11/2017.
-Thuốc tiêm liposome: Lipo ox lọ 10ml, 2mg/ml ( TTY Bio pharm, ài Loan). Số lô: 20130709. Hạn dùng: 9/2016.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa
Dựa theo kết quả của các nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đã đạt đƣợc, kết hợp với các nghiên cứu trên thế giới [50], liposome doxorubicin PEG hóa đƣợc bào chế theo phƣơng pháp tráng film angham trải qua 2 giai đoạn sau:
24
ào chế liposome chƣa mang dƣợc chất:
Tạo lớp film lipid: ân các thành phần HSPC: Chol: DSPE-PEG2000 theo công thức, hòa tan hoàn toàn trong cloroform. Bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50o trong điều kiện chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút, thời gian cất quay 12 giờ.
Hydrat hóa: sử dụng đệm amoni sulfat pH 5,5 đã lọc qua màng lọc 0,2 μm. Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút và tăng nhiệt độ lên 55-600C. Sau 90 phút hydrat hóa thu đƣợc hỗn dịch liposome.
Giảm kích thước liposome: sử dụng 2 kỹ thuật: đùn qua màng hoặc đồng nhất hóa áp suất cao.
Sử dụng thiết bị đùn tay mini extruder: hỗn dịch tạo thành lần lƣợt qua các màng polycarbonat có kích thƣớc giảm dần từ 400nm - 50nm; nén tuần hoàn 10 chu kỳ/màng, nhiệt độ khi nén duy trì 550C- 600 C.
Sử dụng thiết bị nén áp suất cao khí nén nitrogen. Nén lặp lại nhiều chu kỳ ở điều kiện nhiệt độ vào áp suất thích hợp đến khi đạt KTTP và P I mong muốn. Sau cùng lọc hỗn dịch qua màng 0,2 µm.
ào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin:
Đổi môi trường ngoài liposome: Sử dụng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động để đổi môi trƣờng bên ngoài liposome bằng các hệ đệm thích hợp.
Đưa dược chất vào liposome:
- ân chính xác lƣợng doxorubicin hydroclorid cho vào hỗn dịch liposome để đạt hàm lƣợng 2 mg/ml, sử dụng thiết bị khuấy từ để hòa tan và khuếch tán OX vào trong liposome. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ 55 - 60o để quá trình khuếch tán diễn ra hoàn toàn. Lọc chế phẩm qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm.
- Liposome đƣợc đóng trong lọ thủy tinh 10 ml, đóng nút cao su và siết nắp nhôm, bảo quản tránh ánh sáng ở 2 – 8oC.
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá liposome tạo thành
2.2.2.1. Hình thức
Hỗn dịch hơi đục mờ màu đỏ-da cam, để thời gian dài có thể bị lắng cặn nhƣng phải dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ.
25
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái iposome
Sử dụng phƣơng pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua TEM với kỹ thuật nhuộm soi âm bản và cắt lớp siêu mỏng xác định hình thái và cấu trúc của liposome.
2.2.2.3. Phương pháp đánh giá k ch thước và phân bố k ch thước của iposome
Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch đẳng trƣơng Na l 0,9% (đã lọc qua màng 0,2 μm) rồi đo phân bố kích thƣớc tiểu phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động ( LS) trên thiết bị Zetasizer ZS90. ánh giá đặc tính phân bố kích thƣớc tiểu phân qua chỉ số đa phân tán P I, KTTP, đồ thị phân bố kích thƣớc tiểu phân.
2.2.2.4. Phương pháp xác định thế Zeta
Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch nƣớc cất 2 lần lọc qua màng lọc 0,2 μm, bơm từ từ vào cuvet sao cho không xuất hiện bọt khí. ho cuvet vào buồng đo của thiết bị Zetasizer ZS90 và tiến hành đo.
2.2.2.5. Phương pháp định ượng
a Định lượng Doxorubicin bằng phương ph p o quang [4]; [5]
Chuẩn bị dãy chuẩn: ân chính xác 100mg doxorubicin.H l, hòa tan hoàn toàn trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 thu đƣợc dung dịch gốc (1000 µg/ml). Từ dung dịch gốc đem pha loãng bằng đệm phosphat pH 4,0 để thu đƣợc các dung dịch chuẩn có nồng độ 1 đến 20 µg/ml. ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 tới 12 µg/ml đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 233 nm. ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 6 đến 20 µg/ml đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 481 nm. ả hai trƣờng hợp đều sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 4,0. Từ kết quả thu đƣợc, xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính, v đồ thị biểu hiện mối quan hệ tƣơng quan giữa mật độ quang và nồng độ dãy chuẩn.
Dược chất toàn phần:
Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml liposome, thêm 1 ml dd Triton X100 10% (tt/tt) vào bình định mức 10 ml, bổ sung đệm phosphat pH 4,0 vừa đủ. Lắc kỹ, để yên 5 phút. ể lạnh ở nhiệt độ khoảng 5oC trong 2 giờ. em ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút, ở 4-6o để loại bỏ phần lipid. Phần dịch trong đƣợc pha loãng tiếp bằng dung dịch đệm phosphat pH 4,0 với tỉ lệ pha loãng phù hợp để đạt nồng độ khoảng 10
26
µg/ml. o quang ở bƣớc sóng 481 nm. Tính toán nồng độ dƣợc chất toàn phần dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn tại bƣớc sóng 481nm.
Dược chất tự do:
Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml chế phẩm cho vào túi thẩm tích, kẹp kín túi, nhúng túi thẩm tích sao cho phần chứa thuốc ngập sâu trong chai thủy tinh chứa 100ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0. ể yên 24h ở nhiệt độ từ 5-100C. Sau 24h dừng thẩm tích lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích đem đo quang tại bƣớc sóng 233 nm. Tính toán nồng độ dƣợc chất tự do dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn tại bƣớc sóng 233nm.
Hiệu suất liposome hóa:
Tính hiệu suất liposome hóa theo công thức: H = TP.V0 – N.VN
TP.V0
.100 (%)
H: Hiệu suất liposome hóa.
CN, CTP: Hàm lƣợng DOX tự do và OX toàn phần (mg/ml). VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml).
b. Định lượng DOX ằng phương ph p HP C
Dược chất toàn phần: Dựa theo tham khảo USP37-NF30 [57], định lƣợng doxorubicin bằng phƣơng pháp HPL (điều chỉnh điều kiện sắc ký cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm). Hệ sắc ký gồm:
Đi u kiện s c ký: Cột phenomenex 18 (250x 4,6mm, 5µm). Detector: UV – VIS, 254 nm. Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút. Thể tích tiêm: 20 µl.
Pha ộng: Hòa tan 1g natri lauryl sulfat vào 1000 ml hỗn hợp gồm nƣớc - acetonitril – methanol - acid phosphoric theo tỷ lệ (400:450:150:2), điều chỉnh đến pH 3,6 ±0,1 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 N.
Dung dịch phân giải: Hòa tan 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn trong 5 ml nƣớc, thêm 5 ml acid phosphoric, để yên 30 phút. iều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 2M đến pH 2,6 ± 0,1. Thêm 15 ml acetonitril và 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm.
27
Dung dịch chuẩn: ân chính xác 10 mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa tan trong pha động để đạt nồng độ 40 µg/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm. Tiêm lần lƣợt dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
Yêu cầu của hệ s c ký: Số đĩa lý thuyết không đƣợc nhỏ hơn 2000, hệ số bất đối xứng của pic chính không đƣợc quá 1,5; hệ số phân giải của 2 pic doxorubicin và doxorubicinon không đƣợc nhỏ hơn 5,5 (thời gian lƣu tƣơng đối pic doxorubicinon là 0,4 và của doxorubicin là 1,0. ộ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic doxorubicin hydroclorid với 6 lần tiêm không đƣợc lớn hơn 2%.
Dung dịch thử: Lấy 1 ml chế phẩm tƣơng ứng 2 mg doxorubicin. Thêm 1ml dung dịch Triton X100 10%. Lắc kỹ rồi pha loãng với pha động để đạt hàm lƣợng khoảng 40 µg/ml. ể yên 2h. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy phần dịch trong. Chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử, dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và thử để tính ra hàm lƣợng OX toàn phần.
Dược chất tự do – Hiệu suất liposome hóa:
Đi u kiện s c ký và pha ộng: tƣơng tự phần định lƣợng doxorubicin hydroclorid nhƣng thể tích tiêm mẫu là 100 µl.
Dung dịch thử: Xử lý nhƣ mẫu thử ở mục 2.2.2.5a. Sau 24 h dừng thẩm tích. Lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích lọc qua màng lọc 0,45 µm. ịch lọc đƣợc sử dụng để chạy sắc ký.
Dung dịch chuẩn: ân chính xác 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa tan trong pha động để có nồng độ khoảng 2 µg/ml.
Tính kết quả dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic, thể tích dung dịch thử, hàm lƣợng các chất chuẩn, độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra hàm lƣợng doxorubicin hydroclorid tự do đã thẩm tích vào môi trƣờng đệm phosphat pH 4. Hàm lƣợng doxorubicin liposome hóa tính theo công thức:
c. Định lượng lipid - tỷ lệ dược chất/lipid bằng phương ph p o quang
Phospholipid là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp màng liposome, tỉ lệ dƣợc chất/lipid có ảnh hƣởng trực tiếp tới độ ổn định và khả năng giải phóng dƣợc
28
chất của dạng bào chế liposome nói chung [62], [30]. hính vì vậy, định lƣợng lipid là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lƣợng của liposome doxorubicin.
Tham khảo các nghiên cứu của Stewart và cộng sự [51] định lƣợng phospholipid bằng phƣơng pháp đo quang, kết hợp điều chỉnh các điều kiện thí nghiệm cho phù hợp đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng phospholipid nhƣ sau:
Nguyên t c: phospholipid có khả năng tạo phức màu với sắt amoni thiocyanat, dựa vào phƣơng pháp đo quang để xác định nồng độ phospholipid.
Thuốc thử ferrocyanat: Hoà tan 27,03g sắt(III)clorid hexahydrat và 30,4g amonithiocyanat trong nƣớc cất thành 1lit dung dịch.
Mẫu chuẩn: ân chính xác khoảng 10mg HSPC đối chiếu (MW=783,774) và 2mg doxorubicin.HCl cho vào bình định mức 100ml, thêm 70ml chloroform, lắc siêu âm 5 phút. Thêm tiếp cloroform tới vạch thu đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid khoảng 0,1 mg/ml (tƣơng ứng 0,13 µmol/ml). Lần lƣợt hút 4,0; 6,0; 8,0 và 10,0 ml dung dịch chuẩn vào bình định mức 20 ml. Thêm vừa đủ bằng cloroform tới vạch, lắc đều, thu đƣợc các dung dịch chuẩn có nồng độ phospholipid lần lƣợt là 0,026; 0,039; 0,052; 0,065 µmol/ml.
Chuẩn bị 4 ống ly tâm 50ml; lần lƣợt cho vào mỗi ống 10ml dung dịch dãy chuẩn và 10ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat. Lắc xoáy mỗi ống trong 20 giây. Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, gạn lấy pha cloroform. Lọc qua màng lọc 0,45µm bỏ 5ml dịch lọc đầu.
Mẫu tr ng: ân chính xác khoảng 2mg doxorubicin.H l cho vào bình định mức 100ml, thêm 70ml chloroform, lắc siêu âm trong 5 phút. Thêm tiếp chloroform tới vạch thu đƣợc dung dịch mẫu trắng. Hút 10ml mẫu trắng và 10ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat vào ống ly tâm 50ml, xử lý tƣơng tự mẫu chuẩn.
Mẫu thử: Hút chính xác 1,0ml chế phẩm (nồng độ phospholipid toàn phần khoảng 13,36 µmol/ml) vào cốc có mỏ 100ml. Thêm 0,5ml ethanol và 1ml cloroform lắc nhẹ nhàng tạo dung dịch đồng nhất. Bốc hơi ở nhiệt độ phòng thu đƣợc cắn, sấy cắn ở 60° trong 2h. Hoà tan cắn trong 100ml chloroform đạt nồng độ khoảng 0,13 µmol/ml. Hút chính xác 6,0ml dung dịch này vào bình định mức 20 ml. Thêm vừa đủ
29
cloroform tới vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch thử có nồng độ phospholipid khoảng 0,04 µmol/ml. Lấy chính xác 10,0 ml dung dịch này cho vào ống ly tâm, thêm 10ml dung dịch thuốc thử ferrocyanat, xử lý tƣơng tự mẫu chuẩn. Tiến hành lặp lại 3 lần
ùng mẫu trắng để đƣa độ hấp thụ của máy về 0. o độ hấp thụ của dãy chuẩn, mẫu thử trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến tại bƣớc sóng 475 nm. Lập đƣờng hồi quy tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ dãy chuẩn. Tính toán nồng độ phospholipid toàn phần (µmol/ml) trong dung dịch thử dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn.
Tỉ lệ mol dược chất/phospholipid :đƣợc tính dựa vào kết quả định lƣợng phospholipid và định lƣợng doxorubicin toàn phần theo công thức:
X=
Trong đó HL: Hàm lƣợng phần trăm doxorubicin toàn phần so với nhãn. x: Nồng độ phospholipid (µg/ml) ngoại suy từ phƣơng trình tuyến tính y=ax+b
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin
Với thuốc tiêm liposome doxorubicin, ngoài các chỉ tiêu giống nhƣ của liposome doxorubicin, đánh giá thêm các chỉ tiêu sau:
pH: Theo VN IV
Độ vô khuẩn: Theo VN IV
Nội ộc tố vi khuẩn: Theo VN IV
2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên tế bào ung thƣ.