1.5.1. ác dòng tế bào
Khả năng điều trị khối u phụ thuộc vào mức nhạy cảm của tế bào ung thƣ với dƣợc chất và khả năng tập trung thuốc tại mô ung thƣ của hệ mang thuốc. hính vì lý do đó nên các nghiên cứu trên thế giới hiện nay đều đánh giá trên nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau thì mới có thể đƣa ra đƣợc kết luận về tác dụng điều trị của dạng thuốc mới có tốt hay không. ác tế bào thử đƣợc chia thành 4 nhóm chính: Ung thƣ biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ nhƣ ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá); bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy), xuất phát từ máu và tủy xƣơng; ung thƣ mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thƣ xuất phát từ mô liên kết, xƣơng hay cơ và ung thƣ hắc tố (melanoma) do rối loạn của tế bào sắc tố.
Ung thƣ biểu mô( carcinoma):
- Ung thƣ phổi: Lewis lung carcinoma, Colo-699-N, H460, A549 [24], [37], [18, 61],[53]
- Ung thƣ buồng trứng: Ovacar-3, OV-1063 [16], [31], [37].
- Ung thƣ vú: BT-474, SC-115, HER-2, MCF-7, [38] [60], [61],[ 16]. - Ung thƣ đại tràng: -26, HCT-116, HT-1080 [18], [ 36],[38] [61]. - Ung thƣ vòm họng có vảy nhỏ: KLN-205, SAS [18], [37]
- Ung thƣ tế bào gan: HEP G2, W256, QGY [17], [37] . - Ung thƣ tuyến tụy: Panc-1, MIA, Paca-2, DSL6A [40], [18]. - Ung thƣ tuyến tiền liệt: PC-3, PU145 [18] [ 37] [38].
Ung thƣ mô liên kết (sarcoma): Kaposi‘s sarcoma, TG180 sarcoma [37, 61], [12]
19
Ung thƣ huyết học (hematological malignancy): P388 leukemia, L1210, J-6456 lymphoma, KBcell [37] [55].
Ung thƣ hắc tố (melanoma): B16BL6, BLM [47], B16F10 [12] [37].
1.5.2. Phƣơng pháp đánh giá độc tính trên tế bào
ể đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ, cần tiến hành đánh giá độc tính trên tế bào. ác tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng, nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau đó đánh giá độc tính của thuốc bằng các phƣơng pháp khác nhau. ó rất nhiều phƣơng pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào khác nhau, một số phƣơng pháp thƣờng dùng:
-Thứ nghiệm SRB (sulforhodamine B) : Phép thử tiến hành xác định tổng hàm lƣợng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD-Optical ensity) đo đƣợc khi protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine (SR ). SR là một thuốc nhuộm màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic tích điện âm, hai nhóm này s liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dƣơng của protein. Giá trị O máy đo đƣợc tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị O càng lớn [49].
-Phương ph p nghiên cứu sàng lọc MTT: Thử nghiệm MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] đƣợc thực hiện dựa trên hoạt động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống có khả năng chuyển hóa chất MTT màu vàng thành một sản phẩm có màu tím không tan trong nƣớc nhƣng tan trong dung dịch chuyên dụng. Khi tế bào chết thì ty thể không còn khả năng chuyển hóa MTT thành chất màu. Sản phẩm tạo ra từ phản ứng MTT có màu đặc trƣng và có thể định lƣợng đƣợc bằng cách đo mật độ quang với bƣớc sóng hấp thụ đặc trƣng. Mật độ quang đo đƣợc từ thử nghiệm MTT tỷ lệ thuận với số lƣợng các tế bào sống có mặt trong các giếng nuôi [20].
-Phương ph p ếm tế ào với xanh Trypan: Phƣơng pháp này sử dụng xanh trypan nhuộm màu tế bào để xác định trực tiếp số lƣợng tế bào sống hay chết trong buồng đếm. Xanh trypan là loại thuốc nhuộm chỉ có thể đi qua màng tế bào chết. Do đó khi trộn dịch tế bào với thuốc nhuộm các tế bào chết s phồng to lên và có màu xanh đen [52].
20
1.6. Sơ lƣợc mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm 1.6.1. ộng vật thực nghiệm 1.6.1. ộng vật thực nghiệm
ộng vật thí nghiệm dùng để đánh giá tác dụng rất đa dạng, chủ yếu tiến hành trên các chủng chuột nhƣ: L /c, C57BL/6, C3H/HeJ, Swiss, SCID nude, NMRI, SLC Wistar/ST [13, 17], [23], [61] . Chuột có thể bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lƣợng tế bào miễn dịch lympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [25].
Tất cả các động vật thực nghiệm đều phải tuân thủ các yêu cầu của ạo luật quốc gia về đạo đức trong việc sử dụng động vật thí nghiệm nhƣ: C57BL/6 (Trung quốc, The National Act on the Use of Experimental Animals)[24]. NMRI (Hoa Kỳ, The National Institutes of Health Animal Care and Use guidelines) [16], nude BALB/c ( Hoa Kỳ, The Animal Care and Use Committee of Fourth Military Medical University) [61] …
1.6.2. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng
ộng vật thực nghiệm là chuột nhắt thƣờng chọn những con từ 6 – 8 tuần tuổi, nặng từ 18 – 22g [24],[13], [16], [53], [41]. ác tế bào sau khi nuôi cấy s đƣợc đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm. Vị trí cấy tế bào rất khác nhau tùy vào loại tế bào ung thƣ: hông bên phải và hông bên trái, lƣng, màng bụng, phổi, gan bàn chân, dƣới da vùng cổ, dƣới da đùi, thùy trái gan. ác khối u rắn (solid tumor) có thể đƣợc cấy truyền theo đƣờng dƣới da hoặc tiêm vào bắp, cơ của động vật. ác khối u báng (ascites tumors) có thể đƣợc tiêm vào ổ bụng. Số lƣợng tế bào mang cấy khoảng 105 – 107/chuột.
Sau đó chuột đƣợc chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công thức khác nhau. Liều doxorubicin tiêm vào chuột rất khác nhau tùy vào từng thí nghiệm: 1,5 mg/kg [16]; 2,5 mg/kg [16], 5 mg/kg [61], 10 mg/kg [37] [60], 15 mg/kg [60]. Thƣờng tiêm nhắc lại sau 1 tuần. Thời điểm bắt đầu tiến hành rất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm. Có thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn. Thƣờng để các tế bào phát triển từ 1 – 2 tuần, cũng có khi tới 4 tuần hoặc đến khi thể tích u đạt đến một mức nào đó (khoảng 100 – 400 mm3).
21
ác chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị của liposome DOX gồm: thể tích khối u, trọng lƣợng cơ thể giữa các nhóm chuột, tỷ lệ sống/ chết, thời gian sống sót trung bình, khả năng tập trung thuốc tại khối u, nồng độ thuốc tại các cơ quan thƣờng, các thông số dƣợc động học của thuốc…Mô hình thống kê thƣờng sử dụng trong đánh giá các chỉ tiêu thí nghiệm nhƣ: mô hình mỗi nhóm một trung bình thuật toán one way- ANOVA, kiểm định Student‘s t-test, two way onferroni‘s test, paired t-test dựa vào chỉ số p<0,05 khẳng định các nhóm có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê [13, 60] [24], [47], [55].
22
HƢƠNG 2. ỐI TƢ NG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN U 2.1. ối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu 2.1.1. ối tƣợng nghiên cứu
-Liposome doxorubicin PEG hóa.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu.
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu
chuẩn
1 Doxorubicin hydroclorid Ấn ộ USP
2 Cholesterol Sigma Aldrich USP
3 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã
hydrogen hóa (HSP ) Lipoid NSX
4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamin-N-
[amino(polyethylen glycol)-2000]
Lipoid NSX
5 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH
6 Acid citric Trung Quốc TKHH
7 HEPES (N-2-hydroxy ethyl piperazin –
N – 2 – ethan sulfonic acid) Mỹ USP
8 Acid phosphoric Merk - ức TKHH
9 Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether) Amresco Ohio-Mỹ TKHH
10 Sucrose Fisher – Anh BP
11 Natri hydroxid Trung Quốc TKHH
12 Natri clorid Trung Quốc TKHH
13 Methanol Merk – ức USP
14 Acetonitril Merk – ức USP
15 Natri laurylsufat Trung Quốc BP
16 Sắt (III) clorid hexahydrat Trung Quốc TKHH
17 Amoni thiocyanat Trung Quốc TKHH
18 Chloroform Trung Quốc TKHH
19 MTT [3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2 –
23
- òng tế bào ung thƣ phổi ( 549) và ung thƣ đại tràng (HT29) (công ty American Type Culture Collection (ATCC), Hoa Kỳ).
-Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c ( ông ty harles-River, Hoa Kỳ).
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào: Môi trƣờng Eagle's Minimum Essential Medium, môi trƣờng Roswell Park Memorial Institute( RMPI) (công ty T , Hoa Kỳ), đƣợc bổ sung 10% FBS (fetal bovine serum- Huyết thanh bò) và 1% kháng sinh penicillin và streptomycin.
2.1.3. Phƣơng tiện nghiên cứu
Máy cất quay Rotavapor R-210 (Buchi- ức). Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1200 infinity (Agilent). Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ), màng polycarbonate kích thƣớc lỗ lọc 400-200-100-50nm. Màng lọc cellulose acetate 0,45- 0,2µm. Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex - c5 (Avestin – Canada). Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ 50kD, diện tích lọc 20cm2(Mỹ). Túi thẩm tích Spectrumlab/Por 4, MW O: 12 -14 kD (Spectrum Labs- Mỹ). Bể điều nhiệt (Buchi- ức). Thiết bị phân tích kích thƣớc tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh). Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich- ức). Tủ an toàn sinh học cấp 3 (Biobase class 3). Máy quang phổ UV-VIS U- 1800(Hitachi-Nhật Bản) và các dụng cụ thông thƣờng khác.
2.1.4. Thuốc đối chiếu
-Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin Ebewe lọ 25ml, 2mg/ml (Ebewe pharma). Số lô: 20141108. Hạn dùng: 11/2017.
-Thuốc tiêm liposome: Lipo ox lọ 10ml, 2mg/ml ( TTY Bio pharm, ài Loan). Số lô: 20130709. Hạn dùng: 9/2016.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa
Dựa theo kết quả của các nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin đã đạt đƣợc, kết hợp với các nghiên cứu trên thế giới [50], liposome doxorubicin PEG hóa đƣợc bào chế theo phƣơng pháp tráng film angham trải qua 2 giai đoạn sau:
24
ào chế liposome chƣa mang dƣợc chất:
Tạo lớp film lipid: ân các thành phần HSPC: Chol: DSPE-PEG2000 theo công thức, hòa tan hoàn toàn trong cloroform. Bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50o trong điều kiện chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút, thời gian cất quay 12 giờ.
Hydrat hóa: sử dụng đệm amoni sulfat pH 5,5 đã lọc qua màng lọc 0,2 μm. Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút và tăng nhiệt độ lên 55-600C. Sau 90 phút hydrat hóa thu đƣợc hỗn dịch liposome.
Giảm kích thước liposome: sử dụng 2 kỹ thuật: đùn qua màng hoặc đồng nhất hóa áp suất cao.
Sử dụng thiết bị đùn tay mini extruder: hỗn dịch tạo thành lần lƣợt qua các màng polycarbonat có kích thƣớc giảm dần từ 400nm - 50nm; nén tuần hoàn 10 chu kỳ/màng, nhiệt độ khi nén duy trì 550C- 600 C.
Sử dụng thiết bị nén áp suất cao khí nén nitrogen. Nén lặp lại nhiều chu kỳ ở điều kiện nhiệt độ vào áp suất thích hợp đến khi đạt KTTP và P I mong muốn. Sau cùng lọc hỗn dịch qua màng 0,2 µm.
ào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin:
Đổi môi trường ngoài liposome: Sử dụng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động để đổi môi trƣờng bên ngoài liposome bằng các hệ đệm thích hợp.
Đưa dược chất vào liposome:
- ân chính xác lƣợng doxorubicin hydroclorid cho vào hỗn dịch liposome để đạt hàm lƣợng 2 mg/ml, sử dụng thiết bị khuấy từ để hòa tan và khuếch tán OX vào trong liposome. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ 55 - 60o để quá trình khuếch tán diễn ra hoàn toàn. Lọc chế phẩm qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm.
- Liposome đƣợc đóng trong lọ thủy tinh 10 ml, đóng nút cao su và siết nắp nhôm, bảo quản tránh ánh sáng ở 2 – 8oC.
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá liposome tạo thành
2.2.2.1. Hình thức
Hỗn dịch hơi đục mờ màu đỏ-da cam, để thời gian dài có thể bị lắng cặn nhƣng phải dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ.
25
2.2.2.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái iposome
Sử dụng phƣơng pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua TEM với kỹ thuật nhuộm soi âm bản và cắt lớp siêu mỏng xác định hình thái và cấu trúc của liposome.
2.2.2.3. Phương pháp đánh giá k ch thước và phân bố k ch thước của iposome
Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch đẳng trƣơng Na l 0,9% (đã lọc qua màng 0,2 μm) rồi đo phân bố kích thƣớc tiểu phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động ( LS) trên thiết bị Zetasizer ZS90. ánh giá đặc tính phân bố kích thƣớc tiểu phân qua chỉ số đa phân tán P I, KTTP, đồ thị phân bố kích thƣớc tiểu phân.
2.2.2.4. Phương pháp xác định thế Zeta
Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch nƣớc cất 2 lần lọc qua màng lọc 0,2 μm, bơm từ từ vào cuvet sao cho không xuất hiện bọt khí. ho cuvet vào buồng đo của thiết bị Zetasizer ZS90 và tiến hành đo.
2.2.2.5. Phương pháp định ượng
a Định lượng Doxorubicin bằng phương ph p o quang [4]; [5]
Chuẩn bị dãy chuẩn: ân chính xác 100mg doxorubicin.H l, hòa tan hoàn toàn trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 thu đƣợc dung dịch gốc (1000 µg/ml). Từ dung dịch gốc đem pha loãng bằng đệm phosphat pH 4,0 để thu đƣợc các dung dịch chuẩn có nồng độ 1 đến 20 µg/ml. ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 tới 12 µg/ml đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 233 nm. ác dung dịch chuẩn có nồng độ từ 6 đến 20 µg/ml đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 481 nm. ả hai trƣờng hợp đều sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 4,0. Từ kết quả thu đƣợc, xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính, v đồ thị biểu hiện mối quan hệ tƣơng quan giữa mật độ quang và nồng độ dãy chuẩn.
Dược chất toàn phần:
Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml liposome, thêm 1 ml dd Triton X100 10% (tt/tt) vào bình định mức 10 ml, bổ sung đệm phosphat pH 4,0 vừa đủ. Lắc kỹ, để yên 5 phút. ể lạnh ở nhiệt độ khoảng 5oC trong 2 giờ. em ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút, ở 4-6o để loại bỏ phần lipid. Phần dịch trong đƣợc pha loãng tiếp bằng dung dịch đệm phosphat pH 4,0 với tỉ lệ pha loãng phù hợp để đạt nồng độ khoảng 10
26
µg/ml. o quang ở bƣớc sóng 481 nm. Tính toán nồng độ dƣợc chất toàn phần dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn tại bƣớc sóng 481nm.
Dược chất tự do:
Mẫu thử: Lấy chính xác 1,0 ml chế phẩm cho vào túi thẩm tích, kẹp kín túi, nhúng túi thẩm tích sao cho phần chứa thuốc ngập sâu trong chai thủy tinh chứa 100ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0. ể yên 24h ở nhiệt độ từ 5-100C. Sau 24h dừng thẩm tích lấy dung dịch ngoài túi thẩm tích đem đo quang tại bƣớc sóng 233 nm. Tính toán nồng độ dƣợc chất tự do dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn tại bƣớc sóng 233nm.
Hiệu suất liposome hóa:
Tính hiệu suất liposome hóa theo công thức: H = TP.V0 – N.VN
TP.V0
.100 (%)
H: Hiệu suất liposome hóa.
CN, CTP: Hàm lƣợng DOX tự do và OX toàn phần (mg/ml). VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml).
b. Định lượng DOX ằng phương ph p HP C
Dược chất toàn phần: Dựa theo tham khảo USP37-NF30 [57], định lƣợng doxorubicin bằng phƣơng pháp HPL (điều chỉnh điều kiện sắc ký cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm). Hệ sắc ký gồm:
Đi u kiện s c ký: Cột phenomenex 18 (250x 4,6mm, 5µm). Detector: UV – VIS, 254 nm. Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút. Thể tích tiêm: 20 µl.
Pha ộng: Hòa tan 1g natri lauryl sulfat vào 1000 ml hỗn hợp gồm nƣớc - acetonitril – methanol - acid phosphoric theo tỷ lệ (400:450:150:2), điều chỉnh đến pH 3,6 ±0,1 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 N.
Dung dịch phân giải: Hòa tan 10mg doxorubicin hydroclorid chuẩn trong 5 ml nƣớc, thêm 5 ml acid phosphoric, để yên 30 phút. iều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 2M đến pH 2,6 ± 0,1. Thêm 15 ml acetonitril và 10 ml methanol, lắc kỹ, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm.
27
Dung dịch chuẩn: ân chính xác 10 mg doxorubicin hydroclorid chuẩn và hòa tan trong pha động để đạt nồng độ 40 µg/ml, lọc qua màng lọc milipore 0,45µm. Tiêm lần lƣợt dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
Yêu cầu của hệ s c ký: Số đĩa lý thuyết không đƣợc nhỏ hơn 2000, hệ số bất đối xứng của pic chính không đƣợc quá 1,5; hệ số phân giải của 2 pic doxorubicin và doxorubicinon không đƣợc nhỏ hơn 5,5 (thời gian lƣu tƣơng đối pic doxorubicinon là 0,4 và của doxorubicin là 1,0. ộ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic doxorubicin hydroclorid với 6 lần tiêm không đƣợc lớn hơn 2%.
Dung dịch thử: Lấy 1 ml chế phẩm tƣơng ứng 2 mg doxorubicin. Thêm 1ml dung dịch Triton X100 10%. Lắc kỹ rồi pha loãng với pha động để đạt hàm lƣợng