động vật thực nghiệm.
3.4.2.1. Tác dụng invivo của thuốc tiêm iposome DOX PEG trên chuột nude
mang tế bào A549
K ch thước khối u và khả năng ức chế khối u
Khối u đƣợc đánh giá theo dõi sự phát triển tại vị trí tiêm (đùi phải), đo kích thƣớc khối u bằng thƣớc chính xác NSK. Ghi nhận sự thay đổi kích thƣớc khối u ở các nhóm điều trị. Quá trình đo u dừng lại khi có chuột chết tại nhóm bất kỳ. Kết quả đƣợc trình bày ở phụ lục 20 và hình3.14.
58
Hình 3.14. Diễn biến kích thƣớc khối u mang tế bào A549 (n=5)
Nhận xét: Kích thƣớc khối u của các nhóm chuột trong những ngày đầu không có sự khác biệt. Tới ngày 11, thể tích trung bình khối u của nhóm Lipodox và liposome có giá trị tƣơng đƣơng, nhỏ hơn so với nhóm sử dụng dung dịch DOX tự do và xấp xỉ 2/3 thể tích khối u ở nhóm chứng. ánh giá tốc độ tăng trƣởng khối u cho thấy: nhóm chứng có tốc độ tăng kích thƣớc lớn nhất tiếp đó là nhóm sử dụng dung dịch DOX tự do, 2 nhóm sử dụng Lipodox và liposome nghiên cứu có tốc độ tăng trƣởng thấp hơn hẳn. iều này cho thấy tiềm năng của dạng bào chế liposome khi sử dụng trong thời gian dài trong việc kìm hãm sự phát triển khối u. ánh giá khả năng ức chế sự phát triển khối u của các dạng bào chế sử dụng trên các nhóm chuột sau đợt điều trị. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15: Khả năng ức chế sự phát triển khối u mang tế bào A549 (n=5)
0 500 1000 1500 2000 2500
Ngày 0 Ngày 4 Ngày 7 Ngày 11
K ích t hƣớc khố i u ( m m 3) Thời gian Dung dịch doxorubicin Chứng Lipodox LiposomeNC 14,84 35,99 31,51 0 5 10 15 20 25 30 35 40 ITG (% ) Dung dịch doxorubicin Lipodox Liposome NC
59
Nhận xét: Khả năng ức chế khối u của liposome và Lipodox là tƣơng đƣơng và mạnh gấp 2,5 lần so với dạng DOX tự do. Tuy nhiên do cỡ mẫu nhỏ nên sự khác biệt chƣa thật sự rõ rệt.
Trọng ượng cơ thể
Theo dõi trọng lƣợng cơ thể của 4 nhóm chuột từ lúc bắt đầu tiêm thuốc tới khi có chuột chết ở nhóm bất kỳ thì dừng lại. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.19.
Bảng 3.19. Trọng lƣợng cơ thể của các nhóm chuột mang tế bào A549 (g)
Ngày 0 Ngày 4 Ngày 7 Ngày 11
Chứng (1) 20,82± 5,38 18,84± 6,23 19,42± 5,53 18,68± 5,51 Dung dịch doxorubicin (2) 23,63±3,58 25,68± 3,71 23,25± 4,38 24,325± 5,09 Lipodox (3) 24,06± 5,81 24,58± 5,35 24,4± 5,33 23,2± 4,46 Liposome NC (4) 19,52± 4,12 22± 4,58 20,54± 4,66 20,94± 4,86 PANOVA (n=5) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Nhận xét: Trên các nhóm chuột, hầu nhƣ không có sự thay đổi thể trọng sau khi đƣợc điều trị. Trọng lƣợng cơ thể giữa nhóm liposome, Lipodox và DOX tự do so với nhóm chứng trƣớc và sau khi điều trị không khác nhau có ý nghĩa thống kê. Không có sự khác biệt giữa các nhóm tại cùng thời điểm đo. iều này cho thấy với liều 5mg/kg thể trọng chuột ở các dạng bào chế có độ an toàn cao, ít ảnh hƣởng tới các cơ quan lành, ít độc tính.
Tỷ lệ sống sót và thời gian sống trung bình
Tỷ lệ sống sót của các nhóm điều trị đƣợc thể hiện ở hình 3.16.
60
Nhận xét: Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (sau khi chuột nhóm chứng chết 100%), nhóm liposome nghiên cứu còn lại số chuột lớn nhất 60%, nhóm Lipodox và DOX tự do có số chuột còn sống đều là 40%. Chứng tỏ liposome nghiên cứu có độc tính thấp hơn, an toàn hơn so với dạng chế phẩm Lipodox trên thị trƣờng và dạng thuốc tiêm dung dịch truyền thống.
3.4.2.2. Đánh giá tác dụng invivo của thuốc tiêm iposome DOX PEG trên chuột Nude mang tế bào HT29
Theo dõi hiệu quả điều trị và độ an toàn của thuốc tiêm liposome OX PEG nghiên cứu trên chuột nude cấy tế bào ung thƣ HT29, so sánh với nhóm chứng và nhóm điều trị bằng dung dịch DOX tự do, chế phẩm Lipodox đối chiếu trên các tiêu chí: sự thay đổi kích thƣớc khối u, trọng lƣợng cơ thể, tỷ lệ sống sót và thời gian sống trung bình.
K ch thước khối u và khả năng ức chế khối u
Kết quả đƣợc trình bày phụ lục 21 và hình 3 17.
Hình 3.17. Diễn biến kích thƣớc khối u đại tràng mang tế bào HT 29 (n=5)
Nhận xét: Kích thƣớc khối u của các nhóm chuột trong những ngày đầu không có sự khác biệt. Tới ngày thứ 9, thể tích trung bình khối u của nhóm Lipodox và liposome nghiên cứu có giá trị tƣơng đƣơng và chỉ bằng 1/2 thể tích khối u ở nhóm chứng. Hiệu quả điều trị giữa nhóm sử dụng dạng bào chế liposome khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p<0,05). ánh giá tốc độ tăng trƣởng khối u cho
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Ngày 0 Ngày 2 Ngày 6 Ngày 9
Kích th ước khố i u ( mm 3) Thời gian Chứng Dung dịch doxorubicin Lipodox Liposome NC
61
thấy: 2 nhóm sử dụng Lipodox và liposome nghiên cứu có tốc độ tăng trƣởng thấp hơn hẳn so với nhóm chứng và OX tự do.Thể hiện ƣu điểm vƣợt trội của dạng bào chế liposome khi sử dụng trong thời gian dài trong việc kìm hãm sự phát triển khối u
ánh giá khả năng ức chế khối u của các nhóm sau đợt điều trị. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình3.18.
Hình 3.18 Khả năng ức chế sự phát triển khối u đại tràng mang tế bào HT 29 (n=5)
Nhận xét: Khả năng ức chế sự phát triển khối u HT29 của liposome nghiên cứu rất mạnh (p<0,05), tƣơng đƣơng với chế phẩm đối chiếu Lipodox lên tới 50%, gấp 2,5 lần so với dạng DOX tự do. Thuốc tiêm dung dịch DOX tỏ ra có tác dụng yếu, khác biệt so với nhóm chứng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Nhƣ vậy trên mô hình invivo này, dạng bào chế liposome thể hiện ƣu điểm vƣợt trội hơn hẳn so với dạng tự do trên tác dụng ức chế sự phát triển khôí u đại tràng.
Trọng ượng cơ thể
Bảng 3.20. Trọng lƣợng cơ thể của các nhóm chuột mang tế bào HT29 (g)
Ngày 0 Ngày 2 Ngày 6 Ngày 9
Chứng (1) 17,55±3,41 17,71±3,41 19,39±1,342 19,75± 1,41 Dung dịch doxorubicin(2) 24,04±2,34 24,5±2,31 25,18± 2,39 25,96± 2,75 Lipodox (3) 23,92± 3,07 23,92± 3,05 23,92±3,03 23,92±3,16 Liposome NC (4) 23,46± 1,28 23,78±1,22 25,18±1,45 25,42±0,94 PANOVA (n=5) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 20,85 52,72 49,69 0 10 20 30 40 50 60 ITG(%)
62
Nhận xét: Trọng lƣợng cơ thể giữa nhóm liposome, Lipodox và DOX tự do so với nhóm chứng trƣớc và sau khi điều trị không khác nhau có ý nghĩa thống kê. Không có sự khác biệt giữa các nhóm tại cùng thời điểm đo. iều này cho thấy với liều 5mg/kg thể trọng chuột ở các dạng bào chế có độ an toàn cao, ít ảnh hƣởng lên các cơ quan lành.
Tỷ lệ sống/ chết và thời gian sống trung bình
Tỷ lệ sống sót của các nhóm điều trị đƣợc thể hiện ở hình 3.19.
Hình 3.19. Tỷ lệ sống/ chết của các nhóm chuột mang tế bào HT29
Nhận xét: Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (sau khi chuột nhóm chứng chết 100%), nhóm liposome nghiên cứu và Lipodox còn lại số chuột đều là 60%, nhóm DOX tự do có số chuột còn sống chỉ là 20%. Chứng tỏ liposome nghiên cứu có độc tính thấp hơn, an toàn hơn so với dạng thuốc tiêm dung dịch truyền thống; khả năng cải thiện tỷ lệ sống chết, độ an toàn dều tƣơng đƣơng với chế phẩm liposome đối chiếu trên thị trƣờng.
Kết luận: Với liều điều trị 5mg/kg thể trọng, đánh giá invivo trên khối u chuột nude mice BALB/c, liposome DOX PEG nghiên cứu có tác dụng điều trị, khả năng kìm hãm sự tăng trƣởng khối u trên cả 2 dòng tế bào ung thƣ 549 và HT29 trong đó đáp ứng điều trị đƣợc thể hiện rõ rệt qua dòng HT29 với chỉ số ITG lên tới 50%, kích thƣớc khối u sau điều trị chỉ bằng ½ so với nhóm chứng và DOX tự do. Ƣu điểm nổi bật của sản phẩm nghiên cứu là độc tính thấp, độ an toàn cao, có khả năng cải thiện tỷ lệ sống/ chết tƣơng đƣơng với chế phẩm đối chiếu Lipodox trên thị trƣờng, ƣu việt hơn hẳn dạng dung dịch DOX tự do.
63
HƢƠNG 4. N LU N
4.1. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin PEG hóa
4.1.1. Sử dụng tá dược phospholipid DSPE-PEG2000
Việc sử dụng dẫn chất polyme nhƣ PEG để tăng thời gian tuần hoàn, giảm tốc độ thanh thải và cải thiện độ ổn định của liposome là một điểm mới của đề tài so với các nghiên cứu trƣớc đây. Vì vậy chúng tôi tập trung lựa chọn nồng độ tá dƣợc phospholipid DSPE-PEG2000 tối ƣu nhất, tiến hành khảo sát 3 nồng độ 1 mol%, 5 mol%, 10 mol%. Kết quả cho thấy hiệu suất liposome hóa và độ ổn định khác nhau với từng công thức.
Ở nồng độ DSPE-PEG2000 thấp 1mol%, lƣợng PEG sử dụng quá ít không đủ che phủ tất cả liposome. iều này đƣợc quan sát rõ trên hình ảnh chụp TEM, kích thƣớc các tiểu phân liposome không đều, một số liposome không đƣợc PEG hóa. ác liposome quy ƣớc này dễ bị sa lắng, kết tụ trong quá trình bảo quản, thời gian lƣu thông trong tuần hoàn ngắn, không đảm bảo đƣợc mục tiêu kéo dài thời gian tuần hoàn của liposome.
Ở nồng độ DSPE-PEG2000 cao10 mol% cho hiệu suất liposome hóa thấp nhất và độ ổn định kém nhất sau 28 ngày. Hiệu suất liposome hóa thấp có thể do nồng độ PEG cao khiến hỗn dịch quá nhớt, gây khó khăn cho quá trình gắn dƣợc chất. Hoặc do PEG phân bố cả 2 bên màng liposome nên khi nồng độ PEG cao, khả năng chiếm thể tích khoang nƣớc bên trong liposome lớn làm giảm khả năng mang dƣợc chất của liposome. ộ ổn định kém có thể do xảy ra chuyển dạng từ cấu trúc liposome sang cấu trúc micell đĩa hoặc cấu trúc đa giác đã quan sát đƣợc trên hình ảnh khi chụp TEM. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu tham khảo trƣớc[29]. Mật độ DSPE-
PEG2000 cao nên hình dạng của PEG trên bề mặt của liposome thay đổi từ cấu trúc
dạng nấm (mushroom) sang cấu trúc dạng bàn chải (brush) hình thành lực đẩy ngang giữa các chuỗi PEG do vậy gây mất ổn định lớp màng kép lipid. Ở cấu trúc dạng nấm, liposome bền hơn do PEG làm tăng lực đẩy và giảm lực hút Van der waals giữa các tiểu phân [22].
Mẫu có nồng độ DSPE-PEG2000 5 mol% có độ ổn định tốt nhất sau 1 tháng đồng thời quan sát hình ảnh chụp TEM cho thấy kích thƣớc tiểu phân khá đồng đều, hình
64
dạng cầu đều, PEG bao phủ đều khắp các tiểu phân liposome. Do vậy lựa chọn nồng độ DSPE-PEG2000 là 5 mol% để bào chế liposome là thích hợp nhất.
4.1.2. Ảnh hưởng của hệ đệm tới đặc t nh iposome DOX PEG hóa
4.1.2.1. Ảnh hưởng dung lượng ệm của hệ ệm ên trong liposome
Dung dịch amonisulfat đóng vai trò nhƣ một hệ đệm đa chức năng vừa tạo động lực nạp thuốc vào trong liposome thông qua chênh lệch nồng độ amoni vừa cải thiện độ ổn định công thức bào chế qua cơ chế tạo phức bền vững giữa doxorubicin với anion muối đệm hạn chế sự rò rỉ dƣợc chất. Khi tăng dung lƣợng đệm, khả năng lƣu giữ doxorubicin ổn định bên trong liposome tăng khiến độ ổn định đƣợc cải thiện.
Theo cơ chế nạp thuốc thông qua chênh lệch amoni, 1 phân tử NH3 đi ra tạo động lực cho 1 phân tử DOX trung hòa đi vào tạo muối với ion SO42-, muối này tồn tại ở dạng kết tụ giống dạng gel. Khi nồng độ amoni quá thấp s không đủ để tạo hết dạng muối kết tụ ổn định bên trong liposome nên OX tự do vẫn có khả năng chuyển dạng không ion hóa đi ra ngoài màng liposome gây rò rỉ dƣợc chất khiến hiệu suất lipsosome hóa giảm dần theo thời gian. ồng thời NH3 ra môi trƣờng bên ngoài lại kết hợp với H+ khiến pH môi trƣờng ngoài liposome luôn trung tính dao động trong khoảng 7,2 -7,4, khi nồng độ NH3 thấp không trung hòa đủ lƣợng ion H+ khiến pH môi trƣờng bên ngoài giảm dần thúc đẩy quá trình thủy phân lipid khiến liposome khó bền vững. Theo các tài liệu nghiên cứu tỉ lệ thuốc/lipid ổn định khi nồng độ amoni sulfat bên trong / nồng độ amoni sulfat bên ngoài > 1000, do đó tăng nồng độ môi trƣờng đêm bên trong liposome góp phần cải thiện độ ổn định [10]. Sử dụng dung dịch đệm amonisulfat nồng độ 250mM làm môi trƣờng bên trong liposome thay thế cho dung dịch amonisulfat 125mM áp dụng trong các nghiên cứu trƣớc đây [2], [3].
4.1.2.2. Ảnh hưởng của pH và loại ệm môi trường ên ngoài liposome
pH đóng vai trò quan trọng tới hiệu suất nạp thuốc của liposome. Với cả hai loại đệm phosphat và HEPES thì pH càng tăng hiệu suất liposome hóa càng cao và đạt hiệu suất liposome hóa cao nhất tại pH 7,5. Do bản chất lớp vỏ ngoài của liposome là lipid kép có cấu trúc giống màng sinh học tự nhiên của cơ thể, doxorubicin có bản chất base yếu (với ba nhóm trong cấu trúc có pKa > 8, trong đó có nhóm amin đặc trƣng có pKa là 8,15), [21]. Do vậy, khi ở pH càng cao thì OX ở dạng base không
65
ion hóa càng nhiều, s dễ dàng đi qua đƣợc lớp vỏ của liposome, vào trong liposome pH thấp (khoảng 5,5) nên phần lớn dƣợc chất tồn tại ở dạng ion hóa khó khếch tán ngƣợc trở lại môi trƣờng phân tán. Lựa chọn pH 7,5 cho môi trƣờng phân tán liposome.
ác loại đệm khác nhau cho hiệu suất liposome hóa khác nhau. Tại pH 6,5 và 7,5 hiệu suất liposome hóa của HEPES cao hơn phosphat có thể do pH càng tăng tỉ lệ PO43- càng nhiều nên kết hợp với DOXNH3+ tạo phức hợp khó phân ly nên làm giảm khả năng thấm qua đƣợc lớp vỏ lipid.
4.1.2.3. T dược ẳng trương
Sự có mặt tá dƣợc đẳng trƣơng nhƣ glucose, natri clorid, sucrose khiến hiệu suất và tốc độ liposome hóa OX tăng lên nhiều (> 95%) sau 1 ngày bào chế mẫu.
Khi không sử dụng tá dƣợc đẳng trƣơng bên trong liposome là amonisulfat 250 mM có áp suất thẩm thấu cao 0,55 osm trong khi môi trƣờng bên ngoài liposome có áp suất thẩm thấu khá thấp 0,052 – 0,075 osm (khi chỉ có đệm phosphat hoặc HEPES). p suất bên trong liposome lớn hơn bên ngoài nên s tạo ra lực cản hạn chế sự di chuyển DOX tự do từ môi trƣờng bên ngoài vào trong liposome, sự chênh lệch áp suất thẩm thấu quá lớn cũng khiến màng liposome dễ bị giãn ra. Kết quả là có thể làm tăng khả năng rò rỉ dƣợc chất giảm hiệu suất liposome hóa, hệ liposome cũng kém ổn định.
Tá dƣợc đẳng trƣơng giúp ổn định cấu trúc liposome. ộ ổn định của chế phẩm cao hơn so với khi không có mặt chất đẳng trƣơng, do áp suất thẩm thấu ở môi trƣờng bên trong và bên ngoài cân bằng nhau nên lớp vỏ liposome s bền vững hơn. Ngoài ra sự có mặt chất đẳng trƣơng ion hóa nhƣ natri clorid cũng ảnh hƣởng tới thế zeta liposome theo hƣớng tích cực, chất đẳng trƣơng không ion hóa nhƣ glucose hay sucrose xảy ra sự tƣơng tác giữa các nhóm OH của phân tử đƣờng với bề mặt liposome thông qua liên kết hydro tạo lớp áo ngoài che phủ bảo vệ liposome tránh khỏi tác động của môi trƣờng bên ngoài trong quá trình bảo quản. Ngoài ra sử dụng glucose hay sucrose làm tăng độ nhớt môi trƣờng ngoài khiến các liposome di chuyển chậm hơn, giảm lực tƣơng tác giữa các tiểu phân tránh đƣợc hiện tƣợng kết tụ của các liposome, do vậy hỗn dịch liposome s ổn định hơn.
66