Nâng cấp quy trình bào chế thuốc tiêm liposome OX PEG hóa ở quy mô

1000ml /mẻ

Nghiên cứu đƣợc thực hiện là sự nối tiếp các kết quả đạt đƣợc về bào chế liposome OX trƣớc đó với mong muốn nâng cấp quy mô bào chế, tiêu chuẩn hóa sản phẩm để sớm đƣa vào sản xuất ở quy mô lớn. So sánh 2 quy trình bào chế thuốc tiêm liposome DOX PEG về nâng cấp trang thiết bị cũng nhƣ các thông số cần kiểm soát trong quá trình bào chế đƣợc tóm tắt trong bảng sau:

Quy trình bào chế

Quy mô 50ml/mẻ Quy mô 1000ml/mẻ

Thiết bị Thông số cần kiểm soát Thiết bị Thông số cần kiểm soát ƣớc 1: Tráng film tạo màng mỏng lipid - Hệ thống cất quay. -Bể điều nhiệt. - ơm hút chân không. -Sử dụng bình cầu dung tích 1L -Nhiệt độ 500 C. - p suất giảm trong bình cầu (400- 600mmHg) -Thời gian tráng film ( 8-10h) - Sử dụng bình cầu dung tích 2L - Tăng chênh lệch áp suất trong bình cầu, đảm bảo bay hơi hoàn toàn chloroform (760mmHg) - Tăng thời gian tráng film (qua đêm 12-14h). ƣớc 2: Hydrat hóa bằng dung dịch đệm amonisulfat pH 5,5 - Hệ thống cất quay. -Bể điều nhiệt. -Nhiệt độ hydrat (55-60 0C) -Thời gian hydrat hóa 90 phút Không thay đổi so với quy mô 50ml/mẻ

Tăng thời gian hydrat hóa 120- 150 phút. ƣớc 3: Giảm KTTP - Thiết bị đùn tay mini extruder - Hệ thống màng lọc polycarbon kích thƣớc 400-50nm - Nhiệt độ đùn (55-60C). -Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao sử dụng khí nén nitrogen - p suất và chu kỳ nén.

- p suất hơi của khí nitrogen trong bình. - ộ tinh khiết của khí đẩy nitrogen ƣớc 4: ổi môi trƣờng bên ngoài liposome Hệ thống lọc tiếp tuyến tự đông - pH ( 7,2-7,4) - Dung dịch đêm HEPES: 8- 10 lần dung dịch liposome. Tăng số cột lọc từ 1 lên 3- 5 cột bằng cách mắc nối tiếp Lƣợng liposome thu hồi sau khi đổi đệm. o tăng số lƣợng cột lọc, tăng tốc độ đổi đệm nhƣng tăng lƣợng liposome

67

bị thất thoát do lƣu giữ trong cột.

ƣớc 5: ƣa dƣợc chất vào liposome Máy khuấy từ Bể điều nhiệt -Nhiệt độ ủ 60 0C. Thời gian ủ: 15-20 phút.

Không thay đổi so với quy mô 50ml/mẻ.

Giai đoạn quyết định quy mô bào chế là giai đoạn giảm KTTP. ó nhiều phƣơng pháp đồng nhất hóa liposome đƣợc áp dụng trong các nghiên cứu trƣớc đây [1] [2], trong đó phƣơng pháp tối ƣu nhất đƣợc sử dụng là phƣơng pháp ép đùn qua màng polycarbonat có kích thƣớc giảm dần bằng thiết bị mini extruder. Ƣu điểm của phƣơng pháp này cho liposome kích thƣớc nhỏ (< 150 nm) và độ đồng nhất cao (PDI < 0,1). Tuy nhiên nhƣợc điểm lớn nhất là thể tích liposome đƣợc đùn ép nhỏ 1ml/lần, đồng thời phải đùn lặp lại nhiều lần 10 – 15 chu kỳ/màng lọc, qua nhiều lớp màng lọc khác nhau có kích thƣớc giảm dần (400 – 200 – 100 – 50 nm), thể tích liposome bị mất trong giai đoạn này là lớn nhất nên thời gian giảm kích thƣớc tiểu phân kéo dài, thể tích liposome đồng nhất hóa hạn chế trong khoảng 40-50ml.

Khảo sát phƣơng pháp nén dƣới áp suất cao để giảm KTTP, sử dụng khí nén là N2 ở các áp suất nén khác nhau 5000 và 10.000psi. Kết quả thu đƣợc đã chứng minh phƣơng pháp giảm KTTP bằng máy nén áp suất cao có rất nhiều ƣu điểm vƣợt trội so với phƣơng pháp giảm kích thƣớc bằng mini extruder. Kích thƣớc tiểu phân thu đƣợc nhỏ hơn đặc biệt là có thể tạo đƣợc liposome<100nm giảm đƣợc hiện tƣợng thực bào kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu, tăng cƣờng đƣa thuốc tới đích theo cơ chế thụ động nhờ hiệu ứng EPR. Phân bố kích thƣớc tiểu phân tuy cao hơn so với đùn tay nhƣng vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với thuốc tiêm hỗn dịch, thời gian tiến hành ngắn hơn và thể tích liposome đƣợc giảm KTTP lớn, do đó có khả năng áp dụng đƣợc ở quy mô lớn hơn.

ơ chế đồng nhất hóa áp suất cao tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đùn qua màng lọc: hênh lệch áp suất trong và ngoài buồng nén tạo nên lực hút liposome từ khoang chứa bên ngoài vào buồng nén áp suất. Liposome đƣợc phun vào bên trong buồng nén qua khe hẹp có kích thƣớc xác định, dƣới tác động của áp suất cao tạo nên các lực cắt, và ở nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha của khi phospholipid màng tồn tại ở trạng thái tinh thể lỏng, lớp vỏ liposome linh động và độ nhớt thấp, các tiểu phân liposome kích

68

thƣớc to bị phân tách thành các tiểu phân có kích thƣớc bé hơn. ồng thời, lực nén ép làm cho các liposome trƣợt trên nhau, làm bóc dần các lớp để trở thành liposome đơn lớp. p suất tăng KTTP giảm càng nhanh, nén tuần hoàn nhiều chu kỳ liposome càng đồng nhất. Tuy nhiên, sau 10 chu kì nén ép, khi tiếp tục nén thì KTTP và P I giảm rất ít, không đáng kể. ó thể do lúc này cấu trúc các tiểu phân đã ổn định, phân bố kích thƣớc khá đồng đều, tiếp tục tác dụng lực cũng không dễ dàng làm phân tách hay hợp nhất các tiểu phân nữa. o đó chỉ nên dừng ở 10 chu kì nén ép để tiết kiệm khí nén và thời gian. Quá trình sử dụng khí trơ (thƣờng là khí N2)nên vừa không gây nhiễm tạp, vừa giúp loại bỏ oxy trong sản phẩm giúp ổn định hóa học cho sản phẩm. Vì vậy, có thể áp dụng trong sản xuất thuốc tiêm liposome OX PEG hóa ở quy mô lớn.

4.3. ộ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa

Hiện nay một trong những lý do làm cho liposome chƣa đƣợc đi vào sản xuất hàng loạt là vấn đề về độ ổn định của chế phẩm. Do bản chất lớp vỏ là màng lipid nên rất dễ bị tác động bởi các yếu tố vật lý, hóa học, sinh học gây phá vỡ cấu trúc nên tuổi thọ của liposome ngắn. Trong quá trình bào chế liposome có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng tới đặc tính của chế phẩm liposome tạo thành, trong đó hai yếu tố rất quan trọng phải kể đến là thành phần công thức và quy trình bào chế liposome.

Ảnh hưởng của thành phần công thức: Nghiên cứu đã theo dõi đƣợc độ ổn định của các chế phẩm liposome OX PEG hóa với các môi trƣờng ngoài có tá dƣợc đẳng trƣờng khác nhau trong thời gian 6 tháng. Nhìn chung theo thời gian KTTP và chỉ số P I có xu hƣớng tăng cao, hiệu suất liposome hóa và hàm lƣợng dƣợc chất toàn phần có xu hƣớng giảm xuống. Nguyên nhân có thể do cấu trúc liposome về bản chất là lipid nên rất dễ bị oxy hóa, thủy phân dƣới ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, môi trƣờng và nhiều yếu tố khác. o vậy thời gian càng dài càng dễ bị phá hủy gây giải phóng OX khỏi liposome, DOX bị rò rỉ và lipid kết tụ lại khiến hiệu suất liposome hóa giảm xuống và gây mất ổn định hệ liposome. Theo kết quả theo dõi, công thức có môi trƣờng ngoài glucose là ổn định nhất. Sau 6 tháng KTTP và P I vẫn khá ổn định, hiệu suất liposome hóa vẫn đạt > 90%. Do vậy đã lựa chọn đƣợc môi trƣờng ngoài thích hợp nhất để bào chế liposome OX PEG hóa là glucose 5% + HESPES 20 mM (pH 7,5).

69

Ảnh hưởng của quy trình ào chế: Phƣơng pháp giảm KTTP không chỉ ảnh hƣởng tới quy mô sản xuất mà còn có vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ ổn định của chế phẩm. Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu nhƣợc điểm riêng và phạm vi hoạt động nhất định.

Phƣơng pháp nén đẩy qua màng tạo ra liposome đồng nhất cao PDI <0,05; hiệu suất liposome hóa mới bào chế ~100%, liposome bền vững sau 2 tháng P I<0,1 và hiệu suất liposome hóa>92%, sau 6 tháng hiệu suất liposome hóa ở mẫu glucose vẫn >90%. Tuy nhiên chỉ sản xuất đƣợc ở quy mô phòng thí nghiệm với mục tiêu khảo sát công thức bào chế hay đánh giá tác dụng invitro và invivo.

Tiến hành nâng cấp quy mô 1000ml/mẻ thay đổi phƣơng pháp giảm KTTP liposome bằng phƣơng pháp đồng nhất hóa dƣới áp suất cao. Ƣu điểm rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cao thể tích liposome bào chế, giảm KTTP <100nm. Nhƣợc điểm hiệu suất liposome hóa thấp hơn so với đùn qua màng, P I cao hơn >0,1. Nhƣ vậy để sản xuất liposome với số lƣợng lớn, tuổi thọ cao cần kết hợp các phƣơng pháp đồng nhất và giảm kích thƣớc tiểu phân để đạt đƣợc hiệu quả mong muốn. Bổ sung biện pháp tăng độ ổn định của liposome:

Sử dụng các chất chống oxy hóa tocoferol, butyl hydroxyl toluene,.. để bảo vệ các phân tử phospholipid. Chế phẩm oxil trong thành phần có bổ sung 0,2% α tocoferol có nhiệm vụ bảo vệ liposome khỏi các tác nhân oxy hóa giúp cải thiện độ ổn định chế phẩm [15].

 ông khô hỗn dịch liposome giúp chế phẩm ở dạng bột khô dễ bảo quản hơn, ổn định hơn, tuổi thọ dài hơn [14]. Hiện nay chế phẩm Myocet trên thị trƣờng đƣợc đóng vào 3 lọ riêng biệt: lọ chứa OX đông khô, lọ chứa liposome chƣa mang dƣợc chất trong dung dịch đệm citrat và lọ chứa dung dịch natricarbonat. OX đƣợc nạp vào trong liposome ngay trƣớc khi sử dụng.

ộ ổn định có ý nghĩa rất lớn đến thực tế sản xuất. Khi sản xuất cần kiểm soát chặt ch mọi thông số có thể ảnh hƣởng đến độ ổn định của liposome nhƣ pH, nhiệt độ, độ tinh khiết của nguyên liệu. Mọi quá trình phải đƣợc tiến hành trong điều kiện vô khuẩn tuyệt đối, chế phẩm khi sản xuất ra cần bảo quản trong điều kiện thích hợp. ộ ổn định cao tƣơng ứng với tuổi thọ của thuốc s cao, do vậy càng nâng cao đƣợc

70

độ ổn định thì càng kéo dài đƣợc hạn sử dụng cho chế phẩm. iều này góp phần quan trọng trong việc đảm bảo chất lƣợng cho sản phẩm và tăng lợi nhuận cho nhà sản xuất khi chế phẩm đƣợc đƣa ra thị trƣờng.

4.4. ánh giá tác dụng invitro của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên dòng tế bào ung thƣ ngƣời

Ở dòng tế bào 549 sau 48 giờ liposome OX PEG hóa bắt đầu phát huy tác dụng gây độc tế bào (I 50 = 9,97µg/ml) và có tác dụng mạnh nhất sau 72 giờ (IC50 = 0,7µg/ml). heng và cộng sự cũng thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào 549 với chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa. Kết quả cho thấy, IC50 của sản phẩm này là 3,9 µg/ml sau 48 giờ [16]. Thời gian tiếp xúc với tế bào càng lâu hoặc nồng độ thuốc càng cao, thuốc càng có nhiều cơ hội để đi vào trong tế bào, do đó gây độc tính mạnh hơn. Kết quả này cho thấy liposome OX PEG hóa có thể giải phóng kéo dài trong máu, tăng thời gian tác dụng. Ye và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm với những sản phẩm liposome sử dụng phospholipid nhạy cảm với pH và liposome hƣớng đích folat receptor, với thời gian ủ 48h, trên dòng tế bào 549, các dạng mang khác nhau có IC50 dao động từ 2,7 đến 4,9 µmol/l [61]. Nhƣ vậy, so sánh với các tác giả trên, thuốc tiêm liposome OX PEG nghiên cứu có I 50 là 9,97 µg/ml (tƣơng đƣơng 17,19 µmol/ml) trên cùng dòng tế bào 549 và cùng thời gian tiếp xúc là 48 giờ, có độc tính ít hơn.

Với dòng tế bào HT29, sau 24 giờ đầu tiên liposome OX PEG hóa hầu nhƣ không có tác dụng gây độc tế bào. Sau 48 giờ, liposome gây độc tế bào yếu và sau 72 giờ đạt hiệu quả tốt nhất với IC50 là 0,86 μg/ml. Chế phẩm có I 50 sau 48 giờ rất cao, khoảng 99,9 µg/ml, chứng tỏ thuốc giải phóng khá chậm trong môi trƣờng nuôi cấy và gây chết tế bào rất muộn. Một số tác giả công bố sản phẩm liposome doxorubicin với nồng độ gây IC50 là 2,77 µg/ml, sau 48 giờ tiếp xúc với tế bào HT29 [35].

Kết quả thu đƣợc đã chứng minh sự phụ thuộc tác dụng sinh học liposome DOX PEG hóa trên tế bào vào nồng độ và thời gian. Khi tăng thời gian tiếp xúc với tế bào, hoặc tăng nồng độ thuốc thì I 50 giảm. Với nồng độ dƣợc chất 100 µmol/ml sau 72h tiếp xúc với tế bào, I 50 ở cả hai dòng tế bào đều khá nhỏ, chứng tỏ khả năng gây độc tế bào của liposome doxcorubicin PEG hóa là hiệu quả trên cả hai dòng tế bào. A549

71

nhạy cảm với liposome OX hơn HT29 thể hiện qua giá trị IC50 thấp hơn ở tất cả các thời điểm khảo sát. ặc biệt liposome doxorubicin hóa có tác dụng sinh học trên dòng tế bào 549 chỉ sau 48 giờ trong khi đó trên dòng HT29 phải là sau 72 giờ.

Việc đánh giá sơ bộ độc tính trên tế bào đã cho phép dò liều IC50 của liposome OX PEG hóa, đồng thời cho thấy tiềm năng lớn của liposome OX PEG hóa trong ức chế tế bào ung thƣ, đạt tác dụng giải phóng kéo dài, định hƣớng cho đánh giá tác dụng invivo sau này.

4.5. ánh giá tác dụng invivo của thuốc tiêm liposome OX PEG trên khối u động vật thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng dạng bào chế liposome có khả năng ức chế sự phát triển khối u trên cả 2 dòng tế bào ung thƣ 549 và HT29 trong đó đáp ứng điều trị đƣợc thể hiện rõ rệt qua dòng HT29 với chỉ số ITG lên tới 50%. Ƣu điểm nổi bật của dạng bào chế liposome chính là độc tính thấp, độ an toàn cao, cải thiện tỷ lệ sống sót cũng nhƣ kéo dài thời sống

Trên nhóm chuột ung thƣ phổi A549 mặc dù thể tích khối u giữa các nhóm điều trị chƣa có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên dạng bào chế liposome hóa có khả năng ức chế khối u khoảng 30% gấp 2 lần so với dạng DOX tự do. Tốc độ tăng trƣởng khối u chậm hơn so với dạng dung dịch truyền thống có tiềm năng trong việc sử dụng dài ngày. Tác dụng điều trị invivo trên nhóm chuột mang tế bào ung thƣ đại tràng HT29 rõ ràng hơn so với A549. Thể tích khối u sau 9 ngày điều trị ở nhóm sử dụng dạng bào chế liposome nhỏ hơn so với DOX tự do có ý nghĩa thống kê và thể tích khối u trung bình chỉ bằng ½ so với nhóm chứng. iều này có thể là do cơ chế hƣớng đích thụ động của dạng liposome tuần hoàn dài ở các khối u hoặc các vị trí viêm nhờ hiện tƣợng thoát mạch qua các k hở của thành mạch và đƣợc giữ lại do giảm sự dẫn lƣu của hệ bạch huyết tại các vị trí này. Hiện tƣợng này đƣợc gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lƣu giữ (EPR) [8],[10],[16]. Tuy nhiên sự tích lũy thụ động của liposome tại khối u là quá trình diễn ra tƣơng đối chậm, phụ thuộc nhiều vào đặc điểm sinh lý mạch máu khối u. iều này ảnh hƣởng lớn tới sự tích lũy và phân bố thuốc, khả năng đáp ứng điều trị trên các khối u khác nhau, độ nhạy cảm của các tế bào ung

72

thƣ khác nhau. Vì vậy dẫn tới tác dụng điều trị invivo trên hai dòng tế bào 549 và HT29 có sự khác biệt.

ánh giá tác dụng điều trị khối u đã cho thấy dạng liposome có nhiều tiềm năng lớn trong điều trị ung thƣ. Kết quả đánh giá cũng phần nào cho thấy liposome hƣớng đích theo cơ chế thụ động nhờ hiệu ứng EPR vẫn chƣa thể đem lại hiệu quả điều trị ung thuốc tối ƣu: ít có tác dụng trên các khối u kích thƣớc nhỏ, không có hiệu quả với khối u di căn, phụ thuộc nhiều vào đặc điểm sinh lý mạch máu khối u [10], [17]. ó cũng là lý do mà các nhà nghiên cứu trên thế giới hiện nay đều có xu hƣớng thiết kế các liposome thông minh đa chức năng.

Ở cả hai dòng tế bào ung thƣ, dạng bào chế liposome đều thể hiện ƣu điểm vƣợt trội hơn dạng dung dịch DOX tự do về độ an toàn khi sử dụng. Với dòng tế bào A549, tỷ lệ sống/ chết khi sử dụng dạng liposome cải thiện 1,5 lần và ở dòng HT29 có tỷ lệ sống/ chết cải thiện gấp 3 lần so với DOX tự do, nâng cao thời gian sống trung bình so