hỗn dịch đậm đặc nồng độ cao, trong điều trị lâm sàng thƣờng pha loãng với dung dịch đẳng trƣơng tiêm truyền tĩnh mạch chậm cho ngƣời bệnh.
Tiến hành pha loãng hỗn dịch liposome DOX với dung dịch glucose 5% hoặc Na l 0,9% đạt nồng độ khoảng 200µg/ml. ánh giá các chỉ tiêu P I, KTTP, thế zeta, hàm lƣợng và hiệu suất liposome hóa của mẫu pha loãng sau 1h, 2h và 3h để tại điều kiện thƣờng (Phòng thí nghiệm).
Bảng 3.7: ộ ổn định của liposome DOX pha loãng trong dung dịch tiêm truyền
Dung dịch pha loãng Thời gian KTTP (d.nm) PDI Thế zeta HL DOX toàn phần (mg/ml) Hiệu suất liposome hóa Glucose 5% 0 158,8 0,022 -32,7±2,56 1,98±0,04 > 95,00 1 152,8 0,013 -32,5±2,55 1,99±0,052 > 95,00 2 156,7 0,042 -31,9±2,49 1,98±0,097 >95,00 3 155,2 0,061 -35,7±2,80 1,97±0,103 >95,00 NaCl 0,9% 0 145,6 0,047 -40,4±3,16 2,00±0,116 >95,00 1 149,9 0,036 -40,3±3,16 1,99±0,024 > 95,00 2 150,7 0,074 -39,9±3,12 1,98±0,097 >95,00 3 143,2 0,079 -43,2±3,32 1,99±0,059 >95,00
Nhận xét: Hỗn dịch liposome ổn định khi pha loãng, dung dịch đẳng trƣơng chủ yếu ảnh hƣởng mạnh tới thế zeta của liposome, sử dụng dung dịch NaCl 0,9% làm tăng thế zeta hơn so với dung dịch glucose 5%. ác chỉ tiêu nhƣ KKTP, P I hàm lƣợng dƣợc chất toàn phần và hiệu suất liposome đều không thay đổi khi pha loãng.
3.2.2. Nâng cấp quy trình bào chế liposome OX quy mô 1000 ml/mẻ để bào chế thuốc tiêm thuốc tiêm
Khi nâng cấp quy mô từ 50ml lên 1000ml, có hai giai đoạn quan trọng cần thay đổi:
Giai đoạn tráng film và hydrat hóa phải thu đƣợc hỗn dịch liposome thô trên 1000ml/mẻ. Do vậy cần nâng cấp bình cầu tráng film dung tích lên gấp đôi: từ 1 lít lên 2 lít. Tăng chênh lệch áp suất trong bình cầu (400 mmHg lên 760 mmHg) đảm bảo
44
bay hơi hoàn toàn chloroform, tăng thời gian tráng film (12- 14 giờ) và hydrat hóa (2 giờ). Hỗn dịch liposome tạo ra không có sự khác biệt so với bào chế ở quy mô 50ml/mẻ.
Giai đoạn giảm kích thƣớc tiểu phân: đây là giai đoạn quyết định quy mô bào chế. Việc sử dụng thiết bị đùn tay mini extruder có nhƣợc điểm là thể tích liposome đƣợc đùn ép nhỏ 1ml/lần, thời gian giảm kích thƣớc kéo dài, thể tích liposome đồng nhất hóa hạn chế trong khoảng 50 ml. Vì vậy, để nâng cấp quy mô bào chế, cần thay đổi phƣơng pháp giảm KTTP để tăng thể tích liposome đƣợc đồng nhất hóa.
Tiến hành khảo sát giảm kích thƣớc tiểu phân bằng máy nén áp suất cao, sử dụng khí nén nitrogen. Hỗn dịch liposome thô với thành phần công thức lipid xây dựng đƣợc ở mục 3.2.1 sau hydrat hóa bằng 1000ml dung dịch đệm amonisulfat pH 5.5 đƣợc cho vào bình chứa của máy nén, cố định nhiệt độ hỗn dịch ở 55-60° , thay đổi áp suất của máy nén áp suất cao. Tiến hành nén ép qua nhiều chu kỳ, kiểm tra KTTP và P I đến khi đạt đƣợc kết quả mong muốn. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Sự thay đổi KTTP và P I của liposome sau khi nén ép dƣới áp suất và chu kì khác nhau
Nhận xét: Liposome mới tạo ra có kích thƣớc rất lớn (1000 nm), và không đồng đều (PDI gần 1) chỉ sau 1 chu kỳ PDI giảm còn 0,4 và KTTP là 200nm. Sau 15 chu kì nén, kích thƣớc và P I giảm rõ rệt: PDI giảm xuống 0,108; KTTP từ gần 1000 nm giảm xuống dƣới 100 nm. Với cùng số chu kỳ nén, áp suất 10.000 psi cho kết quả
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PDI KTTP (nm ) Số chu kỳ nén ép KTTP 5000 PSI KTTP 10000 PSI
45
kích thƣớc và P I giảm nhanh hơn so với 5000 psi. Tuy nhiên từ chu kì thứ 10 trở đi, khi tiếp tục nén kích thƣớc vào P I của liposome giảm không đáng kể. o đó, nghiên cứu lựa chọn thông số áp suất 10000 psi và 10 chu kì nén cho quá trình giảm KTTP để tiết kiệm khí nitrogen và thời gian nén.
Song song tiến hành đùn tay giảm KTTP bằng mini extruder để so sánh, tiến hành đùn qua các cỡ màng kích thƣớc giảm dần từ 400 – 50 nm: 10chu kỳ/ màng, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.8
Hình 3.8. So sánh hai phƣơng pháp đùn tay và nén áp suất cao qua 10 chu kì
Nhận xét: phƣơng pháp nén áp suất cao tuy không đạt đƣợc độ đồng nhất cao nhƣ đùn tay qua mini extruder nhƣng P I vẫn nằm trong giới hạn cho phép đối với thuốc tiêm (PDI<0,25), và kích thƣớc tiểu phân thu đƣợc sau khi nén qua 10 chu kì ở áp suất 10.000 psi nhỏ hơn nhiều so với đùn tay (<100 nm).
0 0,05 0,1 0,15 0,2 -40 10 60 110 160
5000 psi 10.000 psi Mini extruder PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
46
Hình 3.9. Ảnh chụp TEM liposome đồng nhất hóa áp suất cao
Nhận xét: Kết quả chụp TEM hình 3 9) cho thấy liposome sau khi nén ép có kích thƣớc khá đồng đều, kích thƣớc các tiểu phân cỡ 80 – 130 nm, các tiểu phân liposome có lớp vỏ mỏng. Liposome sau khi nạp dƣợc chất có kích thƣớc và độ đồng nhất thay đổi không nhiều so với trƣớc khi nạp. Ƣu điểm của phƣơng pháp này chính là thời gian tiến hành đồng nhất hóa ngắn, thể tích liposome đƣợc giảm KTTP lớn, ít ảnh hƣởng tới độ ổn định của liposome, có khả năng áp dụng đƣợc ở quy mô lớn hơn.
Từ những kết quả thu đƣợc, quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa quy mô 1000ml/mẻ nhƣ sau:
Bước 1: Chuẩn bị
Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ
- ác dụng cụ pha chế và chai, lọ thủy tinh đựng mẫu đƣợc rửa sạch, tráng nƣớc cất và sấy ở 180° trong 2h.
-Pha 1L dung dịch đệm amoni sulfat pH 5,5 nồng độ 250mM, lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 µm. óng vào chai thủy tinh. Pha 10L đệm HEPES pH 7,5 nồng độ 20mM trong dung dịch đẳng trƣơng, lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 µm. óng vào bình thủy tinh.
-Hấp tiệt khuẩn cột lọc tiếp tuyến cùng các đƣờng ống dẫn, chai đựng dung dịch đệm citrat, chai đựng dung dịch đệm HEPES ở 121° , 15 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩnbị cơ sở thiết bị
-Buồng chứa của máy nén áp suất đƣợc rửa sạch với cồn và nƣớc cất 2 lần. -Phòng vô khuẩn đƣợc lau sạch trần, tƣờng, sàn, bàn và các thiết bị bên trong bằng nƣớc, sau đó lau lại bằng cồn 70°.
-Chuyển toàn bộ các thiết bị, dụng cụ đã sấy và hấp tiệt khuẩn vào phòng vô khuẩn. Tiệt khuẩn lại các thiết bị, dụng cụ không hấp tiệt khuẩn với tia UV trong tủ an toàn sinh học trong 1h trƣớc khi bắt đầu tiến hành giai đoạn tiếp theo.
Bước 2: ào chế liposome doxorubicin PEG hóa: ác bƣớc bào chế đƣợc tiến hành theo sơ đồ hình 3 10. Sau quá trình cất quay tạo màng film và hydrat hóa, tất cả cả các khâu tiếp theo đƣợc thực hiện trong phòng vô khuẩn.
47
Hình 3.10. Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome OX PEG hóa quy mô 1000 ml/mẻ
Bốc hơi dung môi 12h-14h trên thiết bị cất quay với bình
cầu dung tích 2 lít HSPC Cholesterol DSPE – PEG2000 Nhiệt độ: 50° Tốc độ: 50 vòng/phút Hút chân không
Hòa tan trong cloroform. Lọc qua màng PTFE 0,2 µm
Hydrat hóa trong 2h Nhiệt độ: 55- 60° Tốc độ: 80 vòng/phút Hút chân không 1000 ml dung dịch đệm amoni pH 5,5 ồng nhất hóa bằng phƣơng pháp nén dƣới áp suất cao Nhiệt độ: 55- 60° p suất : 10.000 psi Số chu kì nén : 10 chu kì Lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 µm Lọc tiếp tuyến. iều chỉnh về thể tích 1lit
10 lít dung dịch đệm HEPES pH7,5/ glucose 5%. Thiết bị: MicroKros Màng PS 50 k
ổi đệm tới khi môi trƣờng ngoài liposome có pH = 7,4 – 7,5
Khuấy từ liên tục ở nhiệt độ 55° /15 phút. Trong tủ an toàn sinh học Rắc DOX hydroclorid vào hỗn dịch liposome Bảo quản ở 2-8° Tránh ánh sáng ể hỗn dịch trở về nhiệt độ phòng, lọc qua màng 0,2 µm đóng lọ, vít nắp nhôm
Chai lọ, nút cao su, nút nhôm
48