Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm gingko biloba

 Ảnh hưởng của dung môi Dung môi thường được sử dụng để pha thuốc tiêm là nước cất pha tiêm.Tuy nhiên, trong môi trường nước nhiều dược chất dễ bị thủy phân hoặc có độ tan hạn chế, vì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ AN PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

THUỐC TIÊM GINKGO BILOBA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ AN PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

THUỐC TIÊM GINKGO BILOBA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHẾ

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trần Linh

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Nguyễn Trần Linh – người thầy trực tiếp hướng dẫn, người đã dành nhiều

thời gian chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Long, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế, các bạn và các em sinh viên đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Đình Luyện, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp dược đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty TNHH MTV Dược trường Đại học Dược Hà Nội, toàn thể anh chị em phòng Nghiên cứu phát triển

Khoa-và các bạn đồng nghiệp trong công ty đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng sau đại học cùng các thầy

cô, các cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với người thân trong gia đình, bạn bè, những người luôn dành cho tôi sự quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tận tình

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2013

Học viên

Vũ An Phượng

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc tiêm 2

1.2.6 Phương pháp định lượng 1 số thành phần cao Ginkgo biloba 12 1.2.7 Một số dạng bào chế chứa cao Ginkgo biloba 14 1.3 Độ ổn định của cao Ginkgo biloba trong thuốc tiêm ginkgo biloba 15

1.5 Công trình nghiên cứu đã công bố về ginkgo biloba 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.4.1 Phương pháp bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba 28 2.4.2 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm ginkgo biloba 28 2.4.3 Phương pháp khảo sát độ tan của ginkgo biloba 30 2.4.4 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công

thức và phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá

trình bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba

30

2.4.7 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định và dự đoán tuổi thọ của dung

dịch thuốc tiêm Ginkgo biloba

32

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc tiêm Ginkgo biloba 34 3.1.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 34

3.2 Sơ bộ đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc

tiêm ginkgo biloba

38

3.3 Tối ưu hóa công thức thuốc tiêm ginkgo biloba 47

3.3.3 Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra 50

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố khác đến độ ổn định của thuốc tiêm

ginkgo biloba

57

3.4.3 Ảnh hưởng của chất bảo quản alcol benzylic 58

3.5 Dự thảo qui trình và tiêu chuẩn thành phẩm thuốc tiêm ginkgo

biloba

61

3.5.1 Dự thảo qui trình pha chế thuốc tiêm ginkgo biloba 62

3.6 Theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu 65 3.7 Dự đoán tuổi thọ của thuốc tiêm ginkgo biloba 66

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

EGb 761 : Ginkgo biloba extract (Cao bạch quả)

HPLC : High performace liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

PG : Propylen glycol

PEG : Polyethylen glycol

Rongalite : Natri formaldehyd sulfoxylat

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.2 Giới hạn định lượng các thành phần trong cao Ginkgo

biloba

12

Bảng 1.3 Một số chế phẩm chứa cao Ginkgo biloba 14 Bảng 2.4 Các nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 26 Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký 34 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của hệ thống sắc ký 34 Bảng 3.7 Mối tương quan giữa nồng độ quercetin và Spic 36 Bảng 3.8 Bảng kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp 37 Bảng 3.9 Bảng kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp 38 Bảng 3.10 Khảo sát độ tan của cao ginkgo biloba 39 Bảng 3.11 Khảo sát độ tan của cao ginkgo biloba trong dung môi 40 Bảng 3.12 Khảo sát độ tan của cao ginkgo biloba trong hệ dung môi 42

Bảng 3.17 Bảng ký hiệu và mức cần đạt được của các biến đầu ra 48 Bảng 3.18 Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào 48 Bảng 3.19 Kết quả thực nghiệm giá trị các biến đầu ra 50

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của biến độc lập đến biến phụ thuộc 51 Bảng 3.22 Giá trị tối ưu cho các biến đầu vào trong xây dựng công

thức thuốc tiêm ginkgo biloba

56

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn 59

Bảng 3.26 Kết quả kiểm tra độ vô khuẩn 60 Bảng 3.27 Kết quả theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm ginkgo biloba 66 Bảng 3.28 Phương trình hồi qui tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa

hàm lượng flavonoid glycosid còn lại (C) và thời gian bảo quản (t) của mẫu

67

Hình 3.4 Mặt đáp của ΔpH theo nồng độ natri metabisulfit và pH (Y1,

X1, X4) khi natri edetat là 0,03% và sorbitol là 12,5%

52

Hình 3.5 Mặt đáp của hàm lượng flavonoid glycosid còn lại theo

nồng độ dinatri edetat và pH (Y2, X1, X2) khi dinatri metabisulfit là 0,2% và sorbitol là 12,5%

52

Hình 3.6 Mặt đáp của hàm lượng flavonoid glycosid còn lại theo

nồng độ natri metabisulfit , pH (Y2, X1, X4)khi natri edetat

là 0,03% và sorbitol là 12,5%

53

Hình 3.7 Mặt đáp của hàm lượng flavonoid glycosid còn lại theo

nồng độ natri metabisulfit và dinatri edetat (Y2, X2, X4) khi pH=6,75 và sorbitol là 12,5%

54

Hình 3.8 Mặt đáp của hàm lượng flavonoid glycosid còn lại còn lại

theo nồng độ sorbitol, pH (Y2, X1, X3) khi dinatri edetat là 0,03% và natri metabisulfit là 0,2%

55

Hình 3.9 Sơ đồ quá trình pha chế thuốc tiêm ginkgo biloba dự thảo 62

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, xu hướng dùng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu ngày càng tăng, nguyên nhân là còn rất nhiều hợp chất và hỗn hợp các chất thiên nhiên có tác dụng chữa bệnh tốt mà các nhà khoa học chưa thể tổng

hợp để bào chế thành dạng tây y Cao bạch quả (ginkgo biloba extract – EGb 761) là hỗn hợp các chất thiên nhiên, được chiết xuất từ lá cây ginkgo biloba, đã được tiêu

chuẩn hóa và đưa vào dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc để sử dụng giống như nguyên liệu hóa dược khác

Từ năm 1965, sau khi EGb 761 – chiết xuất từ lá ginkgo biloba thành công, thì cao ginkgo biloba cũng dần được chứng minh là có tác dụng cải thiện tuần hoàn máu

[61], điều hòa trương lực mạch máu [58], phân hủy các gốc tự do bảo vệ tế bào não

[30] và cải thiện sự tập trung ở các cá nhân khỏe mạnh [39], [45], đồng thời cao ginkgo

biloba trở thành nguyên liệu bào chế nhiều dược phẩm dạng viên [22] Đến năm 2002,

nghiên cứu của Anna Rita Bilia về dược động học cho thấy các chế phẩm chứa cao

ginkgo biloba dùng qua đường uống (dạng viên) có sinh khả dụng thấp [10], đây là lý

do ra đời thuốc tiêm ginkgo biloba trên thế giới

Hiện nay, Việt Nam đang sử dụng thuốc tiêm ginkgo biloba nhập khẩu chủ yếu

từ Hàn Quốc, trong nước đã có hai cơ sở đăng ký sản xuất thuốc tiêm này nhưng thực

tế gặp khó khăn về công thức bào chế Vì vậy, chúng tôi chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm Ginkgo biloba” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và tối ưu hóa công thức thuốc tiêm ginkgo biloba chứa 17,5 mg cao

ginkgo biloba / 5 ml

2 Dự thảo tiêu chuẩn chất lượng và theo dõi độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm

ginkgo biloba pha theo công thức tối ưu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về thuốc tiêm và độ ổn định của thuốc tiêm

Độ ổn định của thuốc tiêm phụ thuộc vào các yếu tố: tiêu chuẩn nguyên liệu, thành phần công thức, đồ bao gói, quy trình bào chế và điều kiện bảo quản

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc tiêm

Độ ổn định của thuốc tiêm phụ thuộc nhiều yếu tố bao gồm các yếu tố vật lý, hóa học và sinh học

Nói riêng về yếu tố sinh học: sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc trong chế phẩm có thể làm cho thuốc không đạt các chỉ tiêu về độ vô khuẩn, nội độc tố, đồng thời làm phân hủy dược chất, làm mất đi hình thức cảm quan của thuốc, do đó làm giảm tác dụng và tăng độc tính của thuốc Do vậy, trong quá trình xây dựng công thức thuốc tiêm cần lưu ý các chất bảo quản thuốc cũng như các yếu tố qui trình bào chế đảm bảo

độ ổn định vi sinh (độ vô khuẩn và nội độc tố) trong chế phẩm thuốc tiêm

Ảnh hưởng của yếu tố vật lý, hóa học được mô tả như sau:

1.1.2.1 Yếu tố thuộc về công thức thuốc

 Bản chất của dược chất

Dược chất là thành phần cơ bản trong công thức bào chế, có tác dụng dược lý, quyết định tác dụng điều trị hay phòng bệnh của chế phẩm Do tính chất đặc thù của dạng thuốc tiêm là đưa trực tiếp dược chất vào mô, bỏ qua hàng rào bảo vệ tự nhiên của cơ thể nên dược chất dùng pha thuốc tiêm phải đạt tinh khiết cao về mặt vật lý, hóa học và sinh học, đạt tiêu chuẩn dược điển quy định dùng cho pha thuốc tiêm [1]

Các dược chất khác nhau có tính chất lý hóa học khác nhau, độ bền vững cũng khác nhau Do đó tùy từng dược chất cần phải nghiên cứu xây dựng các công thức và

kỹ thuật bào chế đảm bảo độ ổn định, an toàn và hiệu lực điều trị

 Ảnh hưởng của dung môi

Dung môi thường được sử dụng để pha thuốc tiêm là nước cất pha tiêm.Tuy nhiên, trong môi trường nước nhiều dược chất dễ bị thủy phân hoặc có độ tan hạn chế,

vì vậy người ta thường phối hợp vào công thức các dung môi đồng tan với nước như propylen glycol (PG), glycerin, ethanol, polyethylen glycol 300 (PEG 300), PEG 400 Tùy từng dược chất mà lựa chọn dung môi và tỷ lệ phối hợp cho công thức thuốc tiêm để đảm bảo chế phẩm an toàn, ổn định và sinh khả dụng cao

CT thuốc:

- Bản chất dược chất

pH của dung dịch, loại hệ đệm và nồng độ hệ đệm có thể làm tăng các phản ứng phân hủy, ảnh hưởng đến độ tan, độ ổn định của dược chất và sinh khả dụng của thuốc Các loại hệ đệm có thể sử dụng trong thuốc tiêm citric/citrat, acetic/acetat, đệm phosphat, đệm glutamat Lưu ý không sử dụng đệm boric/borat cho thuốc tiêm vì acid boric có thể gây vỡ hồng cầu

Hệ đệm giúp duy trì ổn định khoảng pH cho dung dịch, giảm nguy cơ gây tủa dược chất sau khi tiêm vào cơ thể

Nồng độ đệm được sử dụng là nồng độ đệm thấp nhất có tác dụng duy trì đệm mà

cơ thể có thể có thể dụng nạp được Thường sử dụng ở nồng độ 10 mM

 Ảnh hưởng của các tá dược

Tùy thuộc từng dược chất cần nghiên cứu sử dụng các tá dược thích hợp (chất chống oxy hóa, chất hiệp đồng chống oxy hóa, chất bảo quản…) để đảm bảo độ ổn định của chế phẩm

Các chất chống oxy hóa: được dùng để bảo vệ dược chất và các thành phần trong chế phẩm khỏi quá trình oxy hóa – khử Dựa vào cơ chế tác dụng, chất chống oxy hóa cho thuốc tiêm nước được chia 3 nhóm [1]:

- Các chất sinh SO2 gồm muối natri sulfit, natri bisulfit, natri metabisulfit

- Các chất khử như acid ascorbic, cystein, natri formaldehyd sulfoxylat (Rongalite)

- Các chất tạo phức chelat gồm dẫn chất và muối của acid ethylendiamin tetra acetic, thường sử dụng nhất là dinatri edetat (có thể kết hợp với natri metabisulfit)

Các chất sát khuẩn: giúp đảm bảo độ vô khuẩn của thuốc tiêm trong suốt quá trình bảo quản, sử dụng Các chất sát khuẩn thường dùng là alcol benzylic, thimerosal, các paraben [1]

 Ảnh hưởng của bao bì

Bao bì đựng thuốc tiêm luôn tiếp xúc trực tiếp với dược chất, trong quá trình bảo quản, các thành phần từ bề mặt bao bì có thể khuếch tán vào thuốc, tương tác với các thành phần có trong thuốc làm ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc

Bao bì thuốc tiêm bao gồm ống tiêm bằng thủy tinh, chai lọ bằng thủy tinh có nút cao su, túi và chai bằng chất dẻo, bơm tiêm Bao bì thuốc tiêm phải đạt tiêu chuẩn chất lượng, không hấp phụ hay nhả tạp chất vào trong thuốc tiêm, bền vững trong quá trình tiệt khuẩn ở nhiệt độ và áp suất cao Những dược chất dễ bị phân hủy do tác động của ánh sáng cần sử dụng bao bì tránh sáng hoặc bao bì thứ cấp như hộp carton để bảo quản [1], [66]

1.1.2.2 Yếu tố thuộc kỹ thuật bào chế

Một số yếu tố thuộc kỹ thuật bào chế ảnh hưởng đến độ ổn định của thuốc tiêm bao gồm: điều kiện pha chế kín hay hở, nhiệt độ và thời gian pha, trình tự pha, sự sục khí trơ, đuổi oxy ra khỏi dung môi, các thông số của quá trình tiệt khuẩn

Để hạn chế phản ứng phân hủy dược chất cần tiến hành pha chế nhanh, hạn chế tiếp xúc với không khí, bào chế kín, hòa tan tá dược trước rồi mới hòa tan dược chất, đóng và hàn ống trong bầu khí trơ

Phương pháp tiệt khuẩn cũng ảnh hưởng lớn đến độ ổn định của thuốc tiêm Tiệt khuẩn với nhiệt độ và thời gian thích hợp giúp hạn chế sự phân hủy của thuốc đồng thời vẫn đảm bảo tiêu diệt các vi sinh vật, duy trì độ vô khuẩn cho thuốc tiêm

Một số dược chất không bền nhiệt có thể tiệt khuẩn bằng cách lọc qua màng lọc 0,2 µm, đóng và hàn ống sau khi lọc trong điều kiện vô trùng [1], [66]

1.1.2.3 Yếu tố về điều kiện bảo quản

Các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… trong quá trình bảo quản có thể xúc tác cho phản ứng phân hủy dược chất, vì vậy các chế phẩm cần được nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp để đảm bảo độ ổn định trong suốt thời gian bảo quản thuốc [2]

1.2 Đại cương về cao Ginkgo biloba

1.2.1 Nguồn gốc

Cây bạch quả có tên khoa học là Ginkgo biloba L., là loài cây thân gỗ duy nhất còn sinh tồn trong họ Ginkgoaceae, lớp Ginkgoatae Cây Bạch quả có nguồn gốc từ

Trung Quốc, Nhật Bản, hiện nay được trồng ở nhiều nước châu Á, châu Âu, Bắc Mỹ và New Zealand [10]

Cao ginkgo biloba được chiết xuất từ lá cây bạch quả, có thành phần flavonoid,

terpenoid, các acid hữu cơ, polyprenol và các chất khác như đường, steroid… [22] Cách chiết xuất: lá cây bạch quả còn xanh (trồng theo tiêu chuẩn GAP - thực hành nông nghiệp tốt) thu hái vào tháng 7-9 được sấy khô, phân tích đạt tiêu chuẩn (giới hạn kim loại nặng, giới hạn chất bảo vệ thực vật, aflatoxin, hàm lượng các thành phần,…) được chiết xuất với dung môi hữu cơ (aceton, alkan có 1-3 carbon, alcol…) hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ với nước (hỗn hợp aceton-nước) [10] Dịch chiết thu được đem tinh chế qua nhiều giai đoạn (lắng, lọc, chiết nhiều lần với các dung môi hữu cơ: n-butanol, n-hexan, methylethylaceton,…, cho dịch chiết chạy qua cột sắc kí – chất nhồi cột là polyvinyl pyrolidon hoặc polyamid) để loại tạp chất, mục đích chính là loại

acid ginkgolic – thành phần gây tác dụng không mong muốn cho cao ginkgo biloba

Dịch chiết cuối cùng được đem bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ

60-800C, thu được cao ginkgo biloba [10]

Cao ginkgo biloba có màu vàng nâu hoặc nâu đen, dễ hút ẩm, được bảo quản

trong bao bì kín ở nơi khô ráo, tránh ánh sáng [64]

1.2.2 Thành phần

Cao ginkgo biloba chứa nhiều nhóm hoạt chất được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1.1.Thành phần của lá ginkgo biloba

Thành phần Các hoạt chất chính

Terpenoid Diterpen: ginkgolid A, B, C, J, M

Sesquiterpen: bilobalid Flavonoid (flavon,

flavonol glycosid,

aglycon)

Kaempferol, quercetin, isorhamnetin, rutin, luteolin,

delphidenon, myricetin

Biflavonoid Sciadopitysin, ginkgetin, isoginkgetin, amentoflavon,

bilobetin, 5’-methoxybilobetin Acid hữu cơ Acid benzoic, acid ginkgolic và dẫn chất

Polyprenol di-trans-poly-cis-ictadecaprenol

Các chất khác Steroid, 2-hexenal, cardanol, đường, catechin,

proanthocyanidin, phenol, acid aliphatic, rhamnose Trong đó có hai nhóm hoạt chất chính quyết định tác dụng dược lý của cao là flavonoid và terpenoid, và một nhóm gây ra tác dụng không mong muốn là các acid

ginkgolic [9], [19], [20]

1.2.2.1 Flavonoid

Flavonoid glycosid chiếm khoảng 24% trong cao ginkgo biloba chuẩn hóa, gồm

các phân nhóm [13]:

 Flavon: luteolin, 2-hydroxyluteolin, tricetin,…

 Flavonol: kaempferol, quercetin, isorhamnetin và flavonol glycosid (rutin, quercetin…)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số flavonoid chính trong caoginkgo biloba

Các glycosid của kaempferol, quercetin, isorhamnetin với đường glucose và rhamnose chiếm tỉ lệ lớn phần lớn tổng hàm lượng flavonoid

Ginkgo flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa, dập tắt gốc tự do và ức chế sự tạo thành các lipid peroxyd, do đó có tác dụng bảo vệ màng tế bào và các mô tránh khỏi hàng loạt các tổn hại gây ra bởi các gốc tự do [30]

1.2.2.2 Terpenoid

Terpenoid chiếm khoảng 6% trong cao ginkgo biloba chuẩn hóa, gồm các

ginkgolid hay terpen trilacton - hoạt chất diterpen 20 carbon có khung cấu trúc đặc biệt

chỉ tìm thấy ở cao ginkgo biloba [10]

Một số nhà nghiên cứu đã tìm thấy 5 ginkgolid A, B, C, J, M và bilobalid, một số sesquiterpen 15 carbon có cấu trúc tương tự 5 ginkgolid trên nên cũng được xếp vào nhóm này

Ginkgolid có tác dụng ức chế tác nhân hoạt hóa tiểu cầu (PAF - platelet activating

factor) vì vậy cao ginkgo biloba có hiệu quả lâm sàng trong điều trị các bệnh liên quan

đến PAF như: hen, suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi, rối loạn tim mạch… và các bệnh rối loạn hệ tuần hoàn khác Trong các ginkgolid, ginkgolid B là hoạt chất có hoạt tính dược lý mạnh nhất [61]

1.2.2.3 Acid ginkgolic

Các acid ginkgolic là thành phần chủ yếu gây nên tác dụng không mong muốn

của cao bạch quả [10], [54] Vì vậy, trong cao ginkgo biloba chuẩn hóa, thành phần

này được kiểm soát dưới 5 ppm theo tiêu chuẩn dược điển Mỹ USP 36, dược điển Anh

BP 2014 và 10 ppm theo tiêu chuẩn dược điển Trung Quốc CP 2010

Tác dụng của cao ginkgo biloba là tổng hợp tác dụng của các thành phần trong

cao, bao gồm 5 tác dụng chính như sau:

 Tác dụng phân hủy các gốc tự do: nhiều công trình nghiên cứu cho thấy cao

ginkgo biloba có hoạt tính chống oxy hóa rất hiệu quả trong việc phân hủy các gốc

superoxid và gốc hydroxyl, ức chế tạo lipid peroxid do vậy bảo vệ màng tế bào tránh khỏi hàng loạt những tổn hại gây ra bởi gốc tự do [6],[8], [28], [47], [48], [52], [51], [53] Tác dụng này có ý nghĩa đặc biệt đối với tế bào não – tế bào chứa thành phần lipid với tỷ lệ cao [30]

 Tác dụng cải thiện tuần hoàn máu: cao ginkgo biloba làm tăng lưu lượng

máu đến não, tăng cung cấp chất dinh dưỡng và oxy đến các cơ quan, rút ngắn chu kỳ tuần hoàn do làm giảm độ nhớt của máu, tăng độ đàn hồi của hồng cầu và bạch cầu, do

đó làm giảm triệu chứng lạnh chi, giúp nhanh lành vết loét [38], [41], [42], [50], [61],[62], [63]

 Tác dụng bảo vệ mô: cao ginkgo biloba có tác dụng cung cấp glucose, oxy

đến các mô bị thiếu máu, đồng thời làm tăng lượng chất dẫn truyền thần kinh và mật độ receptor dẫn truyền thần kinh như: receptor muscarinic, adrenergic và setoronic[5], [31], [35], [36], [69]

 Tác dụng điều hòa trương lực mạch máu: cao Ginkgo biloba có tác dụng

duy trì trương lực động và tĩnh mạch do tăng giải phóng và ức chế sự phân hủy catecholamin, làm giãn động mạch thông qua việc đối kháng với EDRF/ nitrogen oxyd (endothelium-derived relaxing factor) nên tăng giải phóng prostacyclin [42], [50]

 Tác dụng ức chế và đối kháng với tác nhân hoạt hóa tiểu cầu và các chất trung gian hóa học như: thromboxan A2, histamin, bradykinin, serotonin, leucotrien nên làm giảm triệu chứng của phản ứng dị ứng, phản ứng viêm [7], [11], [29], [32]

Hiện nay, các hướng nghiên cứu tác dụng dược lý mới của cao ginkgo biloba

ngày càng phát triển và đa dạng Một số tác dụng khác đã được nghiên cứu là: tác dụng chống viêm, nhất là phản ứng viêm ở mắt, viêm da mạn tính [21], [70] Theo Ilieva và

cộng sự, cao ginkgo biloba 1 mg dùng qua đường tĩnh mạch có tác dụng ức chế phản

ứng viêm mắt tương đương với prednisolon ở cùng liều và đường dùng [27], [37]

Theo kết quả nghiên cứu của Sener, cao ginkgo biloba có tác dụng bảo vệ các cơ

quan khỏi tổn thương oxy hóa gây ra bởi tia phóng xạ, có ý nghĩa trong việc giảm tác dụng phụ của điều trị bằng tia phóng xạ [30]

Trong một vài trường hợp, cao ginkgo biloba có thể cải thiện đáng kể sự tập trung

ở các cá nhân mạnh khỏe [39], [45] Tác dụng gần như là ngay tức thì và đạt tới đỉnh điểm trong vòng 2,5 giờ sau khi dùng [18]

Y học hiện đại đang nghiên cứu thêm tác dụng của cao ginkgo biloba trên não bộ

và tác dụng điều trị trong chống Parkinson Năm 2011, Zubeldia và cộng sự đã chứng minh tác dụng điều trị Parkinson của EGb 761 và cơ chế tác dụng [73] Năm 2011, Anatol Nacu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu điều trị các triệu chứng thần kinh của bệnh mất trí nhớ bằng EGb 761 hằng ngày [7].Năm 2013, Oskouei D S và cộng sự

tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của EGb 761đối với trường hợp đột quỵ thiếu máu cục

bộ cấp tính với mù đôi, placebo và ngẫu nhiên trên lâm sàng cho kết quả tốt [33]

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, cao ginkgo biloba còn có tác dụng tốt trong điều trị bệnh hen, dị ứng… nhiều nghiên cứu còn phối hợp cao ginkgo biloba trong

thành phần mỹ phẩm để tăng khả năng bảo vệ da chống lại những tổn thương gây ra bởi các gốc tự do, các chất oxy hóa, tia UV, làm mềm mịn và chống lão hóa da [22], [26]

Tại Việt Nam, nhiều bài thuốc được nghiên cứu với mục đích giúp tăng cường tuần hoàn máu não, cải thiện tình trạng giảm trí nhớ, tập trung, đau đầu Trong đó các sản phẩm như Ích Trí Minh, Hoàn ích Trí là thành quả của y học cổ truyền với chiết xuất từ cao lá bạch quả Một bài thuyết trình tại hội nghị năm 2004 đã tổng quát hóa kết quả các thử nghiệm khác nhau cho thấy bạch quả có triển vọng trong điều trị bệnh Alzheimer, mặc dù cần có thêm các nghiên cứu bổ sung

1.2.4 Công dụng/ chỉ định

1.2.4.1 Công dụng theo đường uống

Từ những tác dụng dược lý kể trên, cao ginkgo biloba được sử dụng ngày càng

phổ biến dưới dạng viên nén, viên nang (thường là thực phẩm chức năng) hỗ trợ điều trị trong các trường hợp sau:

- Suy giảm chức năng hoạt động não, suy giảm tuần hoàn não cấp và mạn tính: giảm hoạt động trí lực, giảm trí nhớ, trầm cảm, bệnh Alzheimer…

- Rối loạn tuần hoàn máu và thần kinh ở tai (ù tai, suy giảm thính giác), ở mắt (bệnh thoái hóa võng mạc, thoái hóa điểm vàng)

- Rối loạn tuần hoàn máu ngoại biên và thần kinh: tắc nghẽn động mạch ngoại biên, tổn thương mạch máu trong bệnh tiểu đường, hội chứng Raynaud… [5]

1.2.4.2 Công dụng theo đường tiêm

Thuốc tiêm ginkgo biloba được sử dụng điều trị trong các trường hợp sau:

- Suy giảm tuần hoàn não

- Rối loạn dinh dưỡng não

- Giảm chức năng hoạt động của não với các dấu hiệu sau: giảm hoạt động trí lực, lo lắng, chóng mặt, ù tai, nhức đầu, rối loạn thị giác, giảm trí nhớ, trầm cảm, suy giảm thính lực, điếc, giảm khả năng nói chuyện do biến đổi di truyền của mạch máu và

có nguồn gốc chuyên hóa và do hội chứng ở cột sống cổ

- Rối loạn phân phối máu ở các mạch máu ngoại biên:

 Xơ cứng động mạch

 Bệnh tiểu đường có biến chứng hoại tử mạch máu

 PAOD (các bệnh tắc nghẽn rải rác động mạch ngoại biên hay chứng đi khập khiễng cách hồi)

 Hội chứng Raynaud’s

 Các dấu hiệu rối loạn mạch máu do nội tiết hay thần kinh

 Bệnh về mạch máu

 Bệnh mạch máu do rối loạn dinh dưỡng mạch máu

1.2.5 Tác dụng không mong muốn và độc tính

Cao ginkgo biloba có thể có tác dụng không mong muốn là tăng thời gian đông

máu, tăng nguy cơ chảy máu, đặc biệt là những người sử dụng các thuốc chống đông

máu như aspirin và warfarin, mặc dù các nghiên cứu gần đây cho thấy cao ginkgo

biloba có ít hoặc không có tác động đối với tính chất chống đông hay dược động lực

học của warfarin [39], [71]

Cao ginkgo biloba cũng không nên dùng cho những người đang sử dụng các chất

ức chế monoamin oxidase (MAO) hay cho các phụ nữ đang mang thai mà không có sự

tư vấn của bác sĩ chuyên môn [55], [68]

Thực tiễn lâm sàng cho thấy, cao ginkgo biloba thường được dung nạp tốt Trong một số trường hợp cá biệt, cao ginkgo biloba gây đau đầu chi, rồi loạn dạ dày-ruột, rối

loạn tuần hoàn, sốc hoặc có biểu hiện nôn mửa, hoa mắt, đánh trống ngực, bồn chồn [13], [57]

1.2.6 Phương pháp định lượng 1 số thành phần cao Ginkgo biloba

Cả 3 dược điển Trung Quốc, Mỹ, Anh đều nêu phương pháp kiểm nghiệm thành

phần cao Ginkgo biloba và thuốc viên có chứa cao Ginkgo biloba; trong đó phương

pháp định tính là dùng sắc kí lớp mỏng và phương pháp định lượng là dùng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [16], [64], [65] Giới hạn định lượng được nêu trong bảng sau:

Bảng 1.2 Giới hạn định lượng các thành phần trong cao ginkgo biloba

Thành phần Dược điển Trung

Quốc ( CP 2010)

Dược điển Mỹ (USP 36)

Dược điển Anh (BP 2014)

Acid ginkgolic Không quá 10 ppm Không quá 5 ppm Không quá 5 ppm Flavonoid glycosid

toàn phần Không dưới 24 % Không dưới 22 %

Nguyên tắc định lƣợng các thành phần trong cao ginkgo biloba:

1.2.6.1 Định lượng flavonoid theo dược điển Anh BP 2014

Pha dung dịch thử là cao ginkgo biloba và dung dịch chuẩn là quercetin dihydrat

có nồng độ tương đương trong methanol, dùng acid hydrocloric loãng để thủy phân

ginkgo biloba thành quercetin

Tiến hành sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện thích hợp Từ diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử tính được hàm lượng flavonoid glycosid trong cao

1.2.6.2 Định lượng terpenoid theo dược điển Anh BP 2014

Dung dịch thử: Chiết xuất terpenoid trong lượng chính xác mẫu cao ginkgo

biloba nguyên liệu bằng cột nhồi kieselguhr

Dung dịch đối chiếu a: 30 mg alcol benzylic được hòa tan trong 100 ml pha động

Dung dịch đối chiếu b: Chiết xuất terpenoid từ lượng chính xác mẫu cao ginkgo

biloba chuẩn giống như dung dịch thử

Tiến hành sắc kí trong điều kiện thích hợp Hàm lượng terpen lacton bằng tổng hàm lượng ginkolid, ginkgolid A, B, C

1.2.6.3 Định lượng acid ginkgolic theo dược điển Anh BP 2014

Dung dịch mẫu thử: Hòa tan 0,500 g cao khô trong 8 ml methanol, siêu âm nếu

cần thiết, thêm methanol đến đủ 10 ml

Dung dịch chuẩn: Hòa tan 10 mg acid ginkgolic trong 8 ml methanol, siêu âm nếu cần thiết, thêm methanol đến đủ 10 ml Pha loãng 2 ml của dung dịch này thành 10 ml trong bình định mức bằng methanol

Tiến hành sắc ký trong điều kiện thích hợp Tính hàm lượng acid ginkolic dựa trên diện tích pic của acid C13, C15 và C17

1.2.7 Một số dạng bào chế chứa caoGinkgo biloba

Dạng thuốc uống: chủ yếu bào chế theo dạng viên như viên bao phim, viên bao

đường, viên nang mềm với hàm lượng hoạt chất cao ginkgo biloba là 40 mg/viên, 60

mg/viên, 120 mg/viên

Dạng thuốc tiêm có hàm lượng hoạt chất cao ginkgo biloba là 3,5 mg/ml

Bảng 1.3.Một số chế phẩm chứa cao ginkgo biloba

Biệt dược Dạng bào chế Hãng sản xuất Thành phần

Giloba Viên nang mềm 40

Ginkgo biloba

phytosome, sáp ong trắng, lecithin, dầu đậu

Ginkgo biloba Ext và

Koreamin Dung dịch tiêm 17,5

mg/ 5 ml YuYu Inc (Hàn Quốc)

Ginkgo biloba Ext và

tá dược

Nerfiline Dung dịch tiêm 17,5

mg/ 5ml

A-Nam Pharmaceutical Co., Ltd (Hàn Quốc)

Ginkgo biloba Ext.,

D-sorbitol và tá dược

1.3 Độ ổn định của caoginkgo biloba trong thuốc tiêm ginkgo biloba

Dược chất của thuốc tiêm ginkgo biloba là cao ginkgo biloba – một loại cao có nguồn gốc dược liệu Cao ginkgo biloba là hỗn hợp nhiều hợp chất thiên nhiên chưa

xác định được cụ thể từng loại cũng như tỷ lệ phần trăm mỗi loại mà chỉ có thể xác định thành phần chính gồm flavonoid glycosid toàn phần, terpenoid và các acid

ginkgolic Do vậy sự ổn định của cao ginkgo biloba trong thuốc tiêm ginkgo biloba phụ thuộc vào sự ổn định của các thành phần cấu thành cao ginkgo biloba bao gồm các

tính chất lý hóa của mỗi loại hợp chất, các yếu tố khác trong công thức, yếu tố bào chế

và yếu tố bảo quản Trong phạm vi đề tài này, xin đề cập đến ảnh hưởng của các nhóm

chất như flavonoid, terpenoid và acid ginkolic tới độ ổn định của cao ginkgo biloba trong thuốc tiêm ginkgo biloba

Các thành phần có tác dụng dược lý mang đặc điểm rất khác nhau: Kaempferol hơi tan trong nước, tan trong alcol nóng, và kiềm; dạng kaempferol 3-glucosid kết tinh trong methanol; Quercetin dihydrat tan trong alcol nóng, acid acetic băng và dung dịch kiềm, không tan trong nước

Do khả năng tan trong nước của các flavonoid rất khác nhau, nên khi các flavonoid glycosid bị phân hủy tạo ra nhiều aglycon flavonoid có thể gây hiện tượng

vẩn đục dung dịch tiêm, khiến chế phẩm thuốc tiêm ginkgo biloba không ổn định

Ngoài ra, các cation authocyanidin biến đổi màu theo pH, có thể gây ra sự biến màu của dung dịch thuốc tiêm, và các flavonoid là hoạt chất dễ bị oxy hóa bởi ánh sáng

và tác nhân oxy hóa khác [3], [15]

1.3.2 Thành phần terpenoid

Thành phần terpenoid là các sesquiterpen lacton dễ bị thủy phân phá vỡ vòng lacton làm giảm hoặc mất tác dụng của thuốc

Các ginkgolid tan trong aceton, ethanol, methanol, ethyl acetat, pyridin, DMSO,

ít tan trong ether, nước và không tan trong hexan, benzen

1.3.3 Thành phần khác

Bên cạnh các thành phần đã kể trên, trong cao ginkgo biloba còn rất nhiều thành

phần khác với lượng rất nhỏ Các thành phần này rất có thể sẽ tương tác với nhau hoặc với các thành phần khác trong công thức thuốc tiêm xây dựng sau này

Như vậy, sự phong phú trong thành phần cao ginkgo biloba một mặt tạo ra tác

dụng điều trị của chế phẩm, mặt khác lại là mối đe dọa độ ổn định cho chế phẩm

Muốn chế phẩm thuốc tiêm chứa cao ginkgo biloba tăng được độ ổn định, yêu cầu bắt

buộc là cần hạn chế sự thủy phân, hạn chế sự oxy hóa, đồng thời tăng được độ tan của hoạt chất mà không làm tủa các thành phần khác trong dung dịch thuốc tiêm

1.4 Một số phương pháp làm tăng độ ổn định của thuốc tiêm ginkgo biloba

Theo phân tích mục 1.3, để tăng độ ổn định của thuốc tiêm ginkgo biloba thì quá

trình xây dựng công thức và qui trình bào chế cần hạn chế phản ứng thủy phân, hạn chế

phản ứng oxy hóa Dưới đây là một số biện pháp hạn chế phản ứng thủy phân, hạn chế

phản ứng oxy hóa có thể sử dụng khi pha chế thuốc tiêm ginkgo biloba

1.4.1 Phương pháp hạn chế sự thủy phân

Sự phân hủy ginkgo biloba do phản ứng thủy phân là một trong những con đường

phân hủy chính của thuốc do hợp chất terpenoid chứa vòng lacton

Phản ứng thủy phân được xúc tác bởi ion hydrogen, các tác nhân là acid và base

có trong dung dịch thuốc Vì thế bào chế thuốc tiêm cần điều chỉnh pH đến khoảng giá trị pH mà dược chất ổn định nhất Ngoài ra, việc điều chỉnh pH còn nhằm mục đích làm tăng độ tan của dược chất, giảm đau, giảm kích ứng khi tiêm [1], [14]

Sự có mặt của nước trong dung dịch hoặc không khí ẩm tham gia tích cực vào phản ứng thủy phân Do đó trong công thức thuốc tiêm, người ta thường thêm dung môi như PG, glycerin, ethanol, PEG 300, PEG 400 để thay thế một phần hay toàn bộ lượng nước trong dung dịch Bên cạnh đó, các dung môi này còn là môi trường tốt để hòa tan hay phân tán nhiều dược chất trong cùng một dung dịch thuốc tiêm [1], [14] Tuy nhiên, các dung môi này có thể chứa tạp chất (ion kim loại, peroxid, ) là xúc tác cho phản ứng thủy phân và oxy hóa dược chất, ví dụ như PEG có cấu trúc peroxid là

một tác nhân oxy hóa dược chất Do đó, trong quá trình pha chế thuốc tiêm ginkgo

biloba cần khảo sát sự ảnh hưởng của các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhằm hạn

chế thủy phân, tăng độ tan và ổn định thuốc tiêm ginkgo biloba trong điều kiện bảo

quản thích hợp

Dùng chất diện hoạt cũng có thể làm giảm sự thủy phân Nguyên nhân là do phân

tử dược chất được phân tán trong lòng các micell tạo bởi chất diệt hoạt, nên ngăn cản

sự tiếp xúc của dược chất với nước, làm giảm sự thủy phân [14]

Tạo dẫn chất: dược chất dễ bị thủy phân là do cấu trúc hóa học có nhóm chức dễ tham gia phản ứng thủy phân, do đó có thể thay thế nhóm thế dễ thủy phân băng các nhóm thế thích hợp trong cấu tạo phân tử mà không làm thay đổi tác dụng cũng là một biện pháp tăng độ ổn định cho chế phẩm Tuy nhiên, việc tạo dẫn chất đối với cao

ginkgo biloba không làm được vì cao ginkgo biloba là hỗn hợp nhiều thành phần chưa

+ Ánh sáng có thể xúc tác cho phản ứng thủy phân, nên hạn chế sự tiếp xúc với ánh sáng trong quá trình bào chế, bảo quản và lưu mẫu

+ Ion kim loại có mặt trong dung dịch cũng có tác động lên sự thủy phân dược chất, nên sử dụng nước cất pha tiêm, bổ sung chất tạo phức chelat để khóa các ion kim loại còn sót lại trong dung dịch

+ Bao bì tiếp xúc trực tiếp với thuốc tiêm trong suốt quá trình bảo quản, do đó cần lựa chọn bao bì có chất lượng tốt, có thể xử lý bề mặt để hạn chế sự nhả thành phần không mong muốn vào dung dịch thuốc tiêm

1.4.2 Phương pháp hạn chế sự oxy hóa

Các flavonoid glycosid trong cao ginkgo biloba rất dễ bị oxy hóa Quá trình oxy

hóa là các phản ứng dây chuyền, diễn ra dưới tác động của oxy, hay phản ứng tự oxy hóa, được khởi động bởi các gốc tự do, vết ion kim loại Phản ứng oxy hóa xảy ra gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn khơi mào phản ứng: một chuỗi các phản ứng xảy ra tạo các gốc tự

do (X●)

- Giai đoạn phát triển phản ứng: các gốc tự do này liên tiếp tác động vào các phân tử dược chất để tạo ra các gốc tự do mới

X● + RH XH + R●

R● + O2 ROO● ROO● + R1H ROOH + R1●

- Giai đoạn kết thúc phản ứng: các gốc tự do được tạo ra ở trên kết hợp lại tạo các phân tử mới

R● + R● R-R

R1● + R1● R1-R1ROO● + R● ROOR ROO● + R1● ROOR1

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa

- Sự có mặt của oxy nguyên tử hoặc các gốc tự do

- Các yếu tố xúc tác cho phản ứng oxy hóa dược chất bao gồm:

 pH: các dược chất khác nhau sẽ ổn định trong dung dịch có pH nằm trong khoảng thích hợp, ở đó tốc độ phản ứng oxy hóa dược chất thấp nhất

 Bức xạ tử ngoại: bức xạ tử ngoại có năng lượng cao có thể chuyển phân tử dược chất lên trạng thái năng lượng cao do đó dược chất dễ tham gia phản ứng oxy hóa hoặc tác động vào các chất phụ tạo gốc tự do làm phân hủy nhanh dược chất

 Vết kim loại nặng: các kim loại nặng chỉ cần ở dạng vết cũng có thể xúc tác cho chuỗi phản ứng oxy hóa phân hủy dược chất

 Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến hầu hết các phản ứng phân hủy dược chất, thông thường khi tăng nhiệt độ lên 10o

C thì tốc độ phản ứng tăng 2 - 5 lần

 Muốn hạn chế phản ứng oxy hóa phân hủy cao ginkgo biloba có thể sử dụng một số biện pháp sau:

- Thêm chất chống oxy hóa như: natri sulfit, acid ascorbic, cystein, natri metabisulfit, dithionit, natri bisulfit, Rongalite với nồng độ thích hợp

- Sử dụng các chất hiệp đồng chống oxy hóa (tác dụng khóa các ion kim loại nặng): dinatri edetat, acid tatric, acid citric, acid fumaric, acid malic…

- Điều chỉnh pH thích hợp

- Loại oxy hòa tan trong nước cất pha tiêm trước và trong khi pha chế, hàn ống trong bầu khí trơ

- Hạn chế sự tác động của ánh sáng trong quá trình bảo quản, sử dụng ống đóng

có màu hổ phách và bao bì ngoài tránh sáng

- Hạn chế sự tác động của nhiệt độ trong quá trình pha chế, bảo quản [1], [14]

1.5 Một số nghiên cứu đã công bốvề ginkgo biloba

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2008, Đỗ Thị Thu Hương đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc

tiêm ginkgo biloba”[4] Kết quả nghiên cứu đã xây dựng công thức chế phẩm thuốc

tiêm ginkgo biloba với thành phần:

Cao ginkgo biloba (CP 2005) 17,5 mg

Nước cất pha tiêm vđ 5,0 ml

Nghiên cứu sử dụng phương pháp định lượng flavonoid glycosid là HPLC theo tiêu chuẩn CP 2005, nghiên cứu đã theo dõi độ ổn định trong 3 tháng của chế phẩm Tuy nhiên, công thức này chưa đạt được độ ổn định mong muốn khi bào chế ở qui mô lớn

1.5.2 Nghiên cứu nước ngoài

1.5.2.1 Các nghiên cứu về phương pháp định lượng và thành phần hóa học cao ginkgo biloba

Theo sự phát triển của phương pháp định lượng, khi tiến hành định lượng thành

phần flavonoid nói chung rồi thành phần flavonoid glycosid trong cao ginkgo biloba

nói riêng, các nhà khoa học đã dần khám phá ra thành phần hóa học phong phú của cao

ginkgo biloba

- Năm 1988, Daigle và Conkerton đã nghiên cứu về phương pháp HPLC định lượng flavonoid Detector UV được coi là công cụ sử dụng rất phổ biến và mạnh nhất lúc đó [17]

- Năm 1993, Sticher đề xuất phương pháp tiêu chuẩn hóa thuốc từ dược liệu là hợp chất flavonol Sau đó Li và Fitzloff sử dụng phương pháp HPLC với detector mảng diod để so sánh flavonol aglycon trong các chế phẩm thuốc và công bố phương pháp định lượng terpen lacton và flavonol aglycon bằng HPLC với detector tán xạ bay hơi (evaporative light scattering detection - ELSD) [59] Tiếp sau đó Kressmann và cộng sự định lượng flavonoid toàn phần trong thuốc, phương pháp HPLC bắt đầu có

giá trị áp dụng với các chế phẩm Ginkgo biloba trên thị trường thuốc tại Mỹ [40]

- Năm 2004, Dubber, Kanfer và công sự nghiên cứu xác định 5 thành phần: rutin, quercetin, quercitrin, Kaempferol và isorhamnetin sử dụng phương pháp HPLC, cột C18 (250 x 2 mm) ở 45 0C, pha động là hỗn hợp acetonitril: acid formic (0,3 %) với tốc

độ dòng 0,4 ml/phút, sử dụng detector mảng quang học diod Kết quả cho phương pháp này tuyến tính trên phạm vi nồng độ là 3-26 µg/ml cho tất cả các flavonoid và giới hạn

định lượng các thành phần của cao ginkgo biloba lần lượt là 2,76; 0,77; 1,11; 1,55 và

1,03 µg/ml đối với rutin, quercetrin, quercetin, kaempferol và isorhamnetin Phương pháp được phát triển và sử dụng để định lượng các chế phẩm rắn đường uống từ cao

Ginkgo biloba Ưu điểm của phương pháp là độ chính xác cao hơn, tiết kiệm thời gian

hơn [24], [25]

- Theo Dubber và cộng sự, định lượng terpenoid bằng detector tán xạ bay hơi có nhiều ưu điểm hơn cả, ít tốn kém, phù hợp để phân tích các hợp chất không bay hơi và chứa nhóm mang màu yếu như các ginkgolid [23]

- Năm 2008, Yang Zhao và cộng sự định hướng nghiên cứu phương pháp định

lượng đồng thời các thành phần trong ginkgo biloba bằng LC-MS/MS

- Năm 2009, Teris A van Beek và Paola Montoro đã báo cáo tổng kết các phân

tích hóa học và kiểm soát chất lượng của cao ginkgo biloba chiết xuất từ lá cây bạch quả một cách toàn diện như sau: Từ năm 2001, hơn 3000 nghiên cứu về ginkgo biloba,

trong đó có khoảng 400 nghiên cứu về phân tích hóa học Cùng thời gian này hơn 2500 bằng sáng chế được nộp liên quan đến thành phần flavonoid glycosid, terpenoid (các ginkgolid và bilobalid), biflavones, proanthocyanidins, alkylphenol và polyprenols Việc tách và phát hiện các hợp chất được tiến hành bởi RP-HPLC với ELSD, RI hoặc MS; hoặc phương pháp GC/FID hoặc GC/MS

- Năm 2010, Hu Jun và cộng sự đã chứng minh sự phù hợp của phương pháp thủy

phân cao Ginkgo biloba bằng acid, xác định tổng lượng flavonoid trong huyết tương

thỏ bằng HPLC mảng diod có thể áp dụng trong nghiên cứu dược động học thuốc [34]

Nhƣ vậy:

Sự phát triển của công nghệ đã giúp các nhà khoa học tìm ra thành phần cao

ginkgo biloba ngoài các hợp chất flavonoid glycosid còn có terpenoid và acid

ginkgolic

Các phương pháp định lượng kể trên đều phát triển từ phương pháp HPLC đã được đưa vào dược điển, nhưng sử dụng detector hiện đại hơn detector UV trong dược điển như detector khối phổ, tán xạ bay hơi nhằm đạt được mục đích nghiên cứu nhất định Ví dụ: với mục tiêu tiết kiệm thời gian định lượng, các nhà khoa học đã tìm ra

phương pháp định lượng đồng thời các thành phần của cao ginkgo biloba là

LC-MS/MS

Bên cạnh đó, các phương pháp định lượng nhanh hỗ trợ trong nghiên cứu dược động học thuốc có giá trị khoa học rất lớn

1.5.2.2 Các nghiên cứu về thuốc viên chứa cao ginkgo biloba

Kể từ khi tác dụng của cao ginkgo biloba được công bố, có rất nhiều chế phẩm chứa cao ginkgo biloba ra đời, ban đầu là dạng viên nang và viên nén Song song với

việc bào chế thuốc dạng viên, các nhà khoa học tìm cách đánh giá sinh khả dụng của thuốc dùng theo đường uống Sau đây là một số kết quả:

- Năm 2004, Lena và Philip đã tiến hành nghiên cứu về độ ổn định của flavonoid

từ cao ginkgo biloba và chế phẩm viên nén trong đường tiêu hóa mô phỏng Kết quả

cho thấy các flavonoid bị phân hủy thành các glycosid aglycon, rồi thành aglycon Đối với các chế phẩm viên nén theo đường tiêu hóa, thành phần flavonid bị phân hủy bởi men tiêu hóa là rất lớn [45]

- Năm 2005, Dubber tiến hành nghiên cứu xác định đồng thời flavonoid glycosid

và aglycon trong chế phẩm đường uống chứa ginkgo biloba bằng HPLC EI-MS[25]

- Năm 2008, Shinji Shimada và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế dạng gingko biloba nano cải thiện đáng kể khả năng hấp thu và tác động lớn đến chức năng não bộ [58]

- Năm 2012, Liang Haidong và cộng sự đã công bố nghiên cứu về việc sử dụng

kết hợp gôm arabic, maltodextrin và protein đậu nành để tạo thành microencapsul

chống lại quá trình oxy hóa cao Ginkgo biloba một cách hiệu quả, sử dụng làm nguyên

liệu cho viên nang [43]

Như vậy, vấn đề sinh khả dụng của cao ginkgo biloba khi uống thấp được lý giải

là do các flavonoid glycosid bị phân hủy bởi men tiêu hóa Từ đó, các nhà bào chế đã

và đang cố gắng chuyển cao ginkgo biloba dạng bột sau chiết xuất thành dạng nano

hoặc dạng microencapsul để bảo vệ dược chất tránh sự phân hủy do men tiêu hóa Tuy nhiên, hiệu quả chưa cao

1.5.2.3 Các nghiên cứu về thuốc tiêm chứa cao ginkgo biloba

Với mong muốn tăng sinh khả dụng của thuốc, các nhà bào chế đã nghiên cứu đưa cao dược liệu vào thuốc tiêm Tuy nhiên, với yêu cầu tiêu chuẩn rất cao của thuốc

tiêm, không phải nguyên liệu cao ginkgo biloba nào cũng có thể bào chế được Dưới đây là một vài nghiên cứu về thuốc tiêm chứa cao ginkgo biloba:

- Năm 1995, giáo sư Klaus- Peter Schwabe đã được cấp bằng sáng chế với dạng thuốc tiêm đông khô [57] với 2 ống:

Ống đông khô có chứa: 50,0 mg dịch chiết ginkgo biloba + 94,7 mg mannitol

Điều chỉnh pH bằng natri hydroxyd 6N tới pH = 4,0 - 4,4

Ống dung môi sử dụng cho tiêm: 26,0 mg dinatri hydrophosphat + 2974,0 mg nước cất pha tiêm

- Năm 2003, sự chuẩn bị dung dịch chiết xuất cao ginkgo biloba làm thuốc tiêm được cấp bằng sáng chế [72] Sáng chế đã trình bày về thành phần cao ginkgo biloba

được sử dụng làm thuốc tiêm có flavonoid glycosid chiếm 24-60%, ginkgolid chiếm

6-15% trọng lượng Cao ginkgo biloba được hòa tan trong dung môi ethanol-nước có tỷ

lệ từ 0,1 đến 0,4:1.Quá trình thao tác: cao ginkgo biloba được hòa tan trong ethanol,

khuấy từ từ và thêm gelatin 2-5% đến khi xuất hiện kết tủa, lọc vô trùng Điều chỉnh

pH từ 3,5 đến 7,5 và thêm các chất chống oxy hóa 0,05-0,2% Phương pháp tiệt khuẩn

là dùng nhiệt 110-115oC trong 20-30 phút

- Năm 2011, để tạo ra nguyên liệu cho thuốc tiêm có chất lượng cao, Chunjian

Zhao và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp chiết xuất ginkgo biloba bằng carbon

dioxyd lỏng siêu tới hạn

- Năm 2012, sáng chế về quá trình tạo dung dịch ginkgo biloba sử dụng cho thuốc tiêm ra đời [71] Theo sáng chế này, dung dịch ginkgo biloba trong nước dùng làm thuốc tiêm được chuẩn bị như sau: Pha dung dịch gelatin 0,1 – 0,3 %, hòa cao ginkgo

biloba vào dung dịch này, lọc và làm khô cao ginkgo biloba trong chân không thu được

hỗn hợp terpenoid và flavonoid glycosid (thường có tỷ lệ 1:4)

- Năm 2012, thuốc tiêm hỗn hợp cao ginkgo biloba và dipyridamole được cấp

bằng sáng chế [71] có thành phần gồm:

Cao ginkgo biloba 0,38% – 0,46 %

Dipyridamole 0,036% - 0,044%

dạng nguyên liệu ginkgo biloba tránh sự phân hủy của thuốc trong đường tiêu hóa như

dạng nano hoặc nghiên cứu thuốc tiêm nhằm mục đích tăng sinh khả dụng

Hầu hết các bằng sáng chế về thuốc tiêm ginkgo biloba có nguồn gốc nước ngoài,

chủ yếu là Trung Quốc Trong nước, chỉ có duy nhất một nghiên cứu về thuốc tiêm

ginkgo biloba, tuy nhiên công thức chưa thực sự ổn định Do đó, tiếp tục nghiên cứu và

xây dựng công thức thuốc tiêm ginkgo biloba để ứng dụng vào sản xuất trong nước là

cần thiết

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.4 Các nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

1 Cao Ginkgo biloba Thụy Sỹ Tiêu chuẩn cơ sở(xem

phụ lục 5)

2 2-pyrolidon Trung Quốc Tinh khiết hóa học

3 Acid acetic Trung Quốc Tinh khiết hóa học

4 Acid citric Trung Quốc Tinh khiết hóa học

5 Acid hydrocloric Trung Quốc Tinh khiết hóa học

7 Alcol benzylic Trung Quốc Tinh khiết hóa học

8 Dinatri edetat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

9 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

10 D-sorbitol Trung Quốc Tinh khiết hóa học

11 Ethanol tuyệt đối Việt Nam DĐVN IV

13 Kali dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

17 Natri citrat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

18 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa học

19 Natri metabisulfit Trung Quốc Tinh khiết hóa học

20 Nước cất pha tiêm Việt Nam DĐVN IV

24 Xylitol Trung Quốc Tinh khiết hóa học

25 Lọ thủy tinh 2ml không

26 Ống thủy tinh, nút cao su,

27

Chế phẩm Nefiline

Lô R001, HSD 20012015 (VN-4183-07)

Hàn Quốc Tiêu chuẩn cơ sở

28 Chất chuẩn Quercetin

2.2 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

Các phương tiên, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này đều thuộc Bộ môn Bào chế - trường Đại học Dược Hà Nội, bao gồm:

- Máy đóng và hàn thuốc tiêm ROTA

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao THERMO-FINNIGAN

- Máy đo pH INOLAB

- Máy lọc nén Sartorius SM16249

- Bể siêu âm Ultrasonics

- Cân phân tích Sartorius - BP121S,

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 412

- Tủ vi khí hậu CLIMACELL

- Tủ sấy KOTTERMANN

- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, cốc có chân, pipet, bình định mức

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng các thành phần chính flavonoid glycosid

của cao Ginkgo biloba trong chế phẩm

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức thuốc tiêm ginkgo

biloba

- Tối ưu hóa công thức thuốc tiêm ginkgo biloba

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình bào chế thuốc tiêm ginkgo

biloba với công thức tối ưu

- Dự thảo tiêu chuẩn thành phẩm thuốc tiêm ginkgo biloba

- Theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu và dự đoán tuổi thọ của thuốc

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba

Các mẫu thuốc tiêm được pha theo các bước sau:

- Hòa tan cao ginkgo bilobavà các tá dược trong dung môi

- Điều chỉnh pH (nếu cần thiết)

- Thêm nước vừa đủ

- Thêm nước đến đủ thể tích cần pha Khuấy đều

Đo pH của dung dịch thuốc tiêm ginkgo biloba bằng máy đo pH Chênh lệch giá

trị pH được kí hiệu là ΔpH, là hiệu của giá trị pH ban đầu trừ giá trị pH sau bảo quản, trong đó:

- Giá trị pH ban đầu: là giá trị pH của dung dịch thuốc tiêm ban đầu ngay sau khi pha

- Giá trị pH sau bảo quản: là giá trị pH của dung dịch thuốc tiêm sau khoảng thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản nhất định

2.4.2.3 Phương pháp định lượng flavonoid glycosid

Định lượng thành phần flavonoid glycosid của caoginkgo biloba trong thuốc tiêm

bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), cụ thể nhưsau:

Dung dịch thử: Hút chính xác 20 ml dung dịch thuốc tiêm ginkgo biloba, cho vào

bình định mức100 ml Thêm 20 ml methanol, 15 ml dung dịch acid hydrocloric loãng

và 5 ml nước, đóng nút kín và đun cách thủy trong 60 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol vừa đủ thể tích 100ml

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10,0 mg quercetin dihydrat trong 20 ml methanol trong bình định mức 100 ml, thêm 15 ml acid hydrocloric loãng và 5 ml nước, bổ sung methanol đến đủ thể tích 100 ml

Tiến hành sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC với điều kiện như sau:

- Cột C18 (chiều dài 0,125 m, đường kính 4 mm), kích thước hạt nhồi 5 µm;

- Chạy sắc ký với hệ dung môi pha động là Methanol: Acid phosphoric 0,5% (52:48)

- Tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV 370 nm

- Thể tích tiêm mẫu thử và mẫu chuẩn 20 µl

Công thức tính hàm lượng flavonoid trong cao Ginkgo biloba:

t c

c t

C S

p C

S ml mg

(

Trong đó:

 Sc: Diện tích pic Quercetin dung dịch chuẩn

 St: Tổng diện tích pic Quercetin, kaempferol, isorhamnetin

 Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

 Ct: Nồng độ dung dịch thử (mg/ml)

 p: hàm lượng quercetin trong quercetin dihydrat

 2,514: Hệ số chuyển đổi từ Quercetin sang flavonoid glycosid