- Năm 2012, Liang Haidong và cộng sự đã công bố nghiên cứu về việc sử dụng kết hợp gôm arabic, maltodextrin và protein đậu nành để tạo thành microencapsul
Chƣơng 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng thuốc tiêm ginkgo biloba
3.1.2. Thẩm định quy trình định lượng
35
Pha dung dịch mẫu chuẩn quercetin có nồng độ khoảng 100 µg/ml như trên. Pha dung dịch mẫu thử như sau: Cân chính xác 0,200 gam nguyên liệu ginkgo biloba vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, 5 ml acid hydroclorid 25%, 5
ml nước, đem siêu âm đến tan hoàn toàn. Hỗn hợp được đun sôi cách thủy 30 phút, để nguội về nhiệt độ phòng. Bổ sung methanol cho đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ khoảng 2000 µg cao/ml (tương ứng nồng độ quercetin khoảng 200 µg/ml). Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Pha mẫu trắng: 5 ml acid hydroclorid 25%, 5 ml nước, methanol vừa đủ 100 ml. Tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử qua cột sắc ký với các điều kiện ghi ở mục 2.4.2.3 thu được sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử (phụ lục 1, 2, 3).
Kết quả:
Đối với mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có pic nào xuất hiện trong các khoảng thời gian lưu của các chất trong cao ginkgo biloba (phụ lục 1).
Đối với mẫu chuẩn, trên sắc ký đồ cho 1 pic cân xứng với thời gian lưu 15,82 phút, là pic của quercetin (phụ lục 2).
Đối với mẫu thử, trên sắc ký đồ cho 3 pic cân xứng với thời gian lưu 15,6; 26,6 và 29,7 phút lần lượt là pic của quercetin, kaempferol và isorhamnetin (phụ lục 3).
Nhận xét:
Phương pháp có tính đặc hiệu tốt, quercetin có 1 pic ở tR= 15,6 phút, kaempferol có 1 pic ở tR= 22,6 phút, isorhamnetin có 1 pic ở tR= 29,7 phút. Do đó có thể định lượng flavonoid toàn phần trong chế phẩm thu được dựa vào tổng diện tích 3 pic quercetin, kaempferol và isorhamnetin.
3.1.2.2. Tính tuyến tính
Pha dãy dung dịch chuẩn có hàm lượng quercetin là 20, 40, 60, 80, 100, 200 µg/ml, định lượng các dung dịch này bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký ghi ở mục 2.4.2.3, kết quả diện tích pic được ghi trong bảng 3.7.
36
Bảng 3.7. Mối tương quan giữa nồng độ quercetin và Spic
STT Nồng độ (µg/ ml) Spic (mAU.s) 1 20 1207 2 40 2534 3 60 3894 4 80 1741 5 100 6450 6 200 12211
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ quercetin và Spic
Nhận xét:
Kết quả trên cho thấy giữa diện tích pic và nồng độ quercetin có sự phụ thuộc tuyến tính với nhau trong khoảng nồng độ từ 20 đến 100 µg/ml, hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
3.1.2.3. Độ lặp lại
37
Pha mẫu: Hút chính xác 5 ml chế phẩm Nerfiline cho vào bình định mức 25 ml, thêm 5 ml methanol, 5 ml acid hydroclorid 25%, 5 ml nước, siêu âm 10 phút rồi đun cách thủy sôi 30 phút thấy dung dịch chuyển màu vàng sậm. Bổ sung thêm methanol đủ 25 ml. Lọc dung dịch mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm.
Với mỗi mẫu chế phẩm, tiến hành định lượng với 3 lần tiêm mẫu thu được sắc ký đồ của chế phẩm Nerfiline. Tổng diện tích 3 pic quercetin, kaempferol, isorhamnetin gọi là diện tích pic flavonoid glycosid (Sflavonoid glycosid ) của mỗi lần tiêm mẫu. Kết quả trong bảng 3.8 là giá trị diện tích pic flavonoid glycosid tính trung bình thu được từ 3 lần tiêm mẫu.
Bảng 3.8. Bảng kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp (n = 6)
STT Sflavonoid glycosid trung bình (mAU.s) 1 4289 2 4354 3 4333 4 4297 5 4400 6 4376 X 4341,5 SD 43,76643 RSD (%) 1,01%
Nhận xét:Phương pháp cho độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%.
3.1.2.4. Độ đúng
Dùng 9 mẫu thử có nồng độ quercetin đã xác định ở phần độ lặp lại, thêm vào chất chuẩn quercetin dihydrat: 3 mẫu đầu thêm 80%, 3 mẫu tiếp theo thêm 100%, 3 mẫu còn lại thêm 120% so với nồng độ đã có trong mẫu thử. Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống HPLC với các điều kiện ghi ở mục 2.4.2.3. Từ diện tích pic, xác định hàm
38
lượng quercetin, tính tỷ lệ thu hồi (% lượng chất chuẩn tìm thấy được sau khi thêm vào dung dịch thử). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Bảng kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp (n=3)
Tỷ lệ chuẩn thêm Hàm lƣợng quercetin trong mẫu (µg/ml) Lƣợng chất chuẩn
thêm (µg/ml) Tỷ lệ thu hồi (%)
Trung bình (%) Thêm Tìm thấy 80% 36,54 29,23 29,12 100,30 99,63 36,54 29,23 29,07 100,18 36,54 29,23 29,18 100,45 100% 36,54 36,54 36,62 101,24 100,10 36,54 36,54 36,53 101,06 36,54 36,54 36,58 101,16 120% 36,54 43,85 43,61 99,35 99,57 36,54 43,85 43,71 99,52 36,54 43,85 43,66 99,43 Nhận xét:
Phương pháp cho độ lặp lại tốt RSD < 2%. Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ % tìm lại chất chuẩn đều nằm trong giới hạn cho phép (98 – 102%)
Kết luận:
Phương pháp HPLC khảo sát đạt tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này vào thực tế để định lượng thành phần flavonoid glycosid của ginkgo biloba trong chế phẩm.