Nghiên cứu tình hình miễn dịch chống bệnh Gumboroở gà giết mổ và cảm nhiễm virus Gumboro ở gà giết mổ, gà nuôi liền kề và ở xa lò mổ Thủy Dương bằng phương pháp IHA và SSIA

biến đổi” có thành phần nucleotide biến đổi trong giới hạn nhất định, khônghoặc rất ít làm thay đổi acid amin của vùng “siêu biến đổi” nói chung và dãyepitope nói riêng, thì tính miễn dị

Avibirnavirus, họ Birnaviridae gây ra ở gà 1 - 12 tuần tuổi [24] Virus gây bệnh

làm tê liệt hệ thống miễn dịch gây suy giảm miễn dịch của gà Bệnh lây lan cựcnhanh, thường xảy ra khi gà ở giai đoạn từ 3 - 6 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm bệnh có

thể lên đến 100% và tỷ lệ chết có thể từ 20 - 50%[8] Do đó, việc phòng bệnh

Gumboro cho gà là điều cần thiết

Ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1981 ở một số trại nuôi gàcông nghiệp thuộc các tỉnh phía Bắc, vào các năm 1987 - 1993 bệnh phát triểnrất mạnh gây chết rất nhiều gà Theo các điều tra gần đây tại nước ta, gà côngnghiệp có tỷ lệ mắc bệnh rất cao, gà ta nuôi theo phương thức bán công nghiệpcũng mắc bệnh trên nhiều đàn tỷ lệ chết lên đến 20 - 25% Không những gây táchại trên đàn gà công nghiệp, bệnh Gumboro đã thấy xuất hiện trên đàn gà RiViệt Nam Khả năng bệnh sẽ còn lây lan hơn trước nữa nếu không được đầu tưnghiên cứu để có biện pháp phòng chống thích đáng [1]

Đặc biệt trong tình trạng kiểm soát vệ sinh giết mổ ở nước ta vẫn còn khóquản lý, mầm bệnh Gumboro có thể lây lan thông qua các lò mổ, từ quá trìnhvận chuyển, giết mổ, xử lý chất thải… Cho tới nay vẫn chưa có nhiều nghiêncứu đánh giá ảnh hưởng của các lò mổ tới tình hình dịch Gumboro ở vùng xungquanh Để kiểm soát bệnh và hiểu rõ hơn về độc tính của mầm bệnh hiện lưuhành tại tỉnh Thừa Thiên Huế, chẩn đoán nhanh và có những đề xuất liên quanđến việc đảm bảo vệ sinh thú y lò mổ gia cầm, được sự cho phép của trường Đạihọc Nông Lâm Huế, sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn PGS TS Phạm Hồng

Sơn tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tình hình miễn dịch chống bệnh Gumboro

ở gà giết mổ và cảm nhiễm virus Gumboro ở gà giết mổ, gà nuôi liền kề và ở xa

lò mổ Thủy Dương bằng phương pháp IHA và SSIA”

1.2 Mục đích của đề tài

Đánh giá ảnh hưởng dịch tễ của các lò mổ gia cầm đến tình hình nhiễmbệnh Gumboro trên địa bàn xung quanh thành phố Huế từ đó đề xuất biện phápngăn ngừa dịch bệnh từ lò mổ đến hộ gia đình

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

-Đánh giá khả năng kháng bệnh của nguồn gia cầm nhập vào lò mổ(kháng thể nguồn gà nhập, tỉ lệ tiêm phòng), sự lưu hành của virus cúmGumboro trên địa bàn huyện Hương Thủy

- Khảo sát tỉ lệ gia cầm mắc bệnh Gumboro ở trong cơ sở giết mổ gia cầmThủy Dương (Hương Thủy) và các đàn gia cầm trên địa bàn lân cận

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu phản ánh tình hình gia cầm nhiễm bệnh trong vàngoài lò mổ, tìm ra được sự ảnh hưởng nhất định của công tác vệ sinh thú y tạicác lò mổ tới sự lưu hành virus Gumboro trên hai địa bàn

- Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi cũng mong muốn giúp người chănnuôi cũng như các lò mổ có ý thức trong việc đảm bảo môi trường chăn nuôicũng như giết mổ phù hợp nhằm phòng và tránh bệnh Gumboro

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát điều kiện tự nhiên thị xã Hương Thủy

2.1.1 Vị trí địa lý

Thị xã Hương Thủy nằm ở khu vực trung tâm tỉnh Thừa Thiên - Huế, phíaĐông Nam thành phố Huế, không tiếp giáp với biển Đông [37]

Địa giới hành chính:

- Phía Đông giáp huyện Phú Lộc

- Phía Tây giáp thị xã Hương Trà và huyện A Lưới

- Phía Bắc giáp thành phố Huế và huyện Phú Vang

Thị xã Hương Thủy nằm trên trục đường giao thông quan trọng xuyên suốtBắc - Nam trên quốc lộ 1 và tuyến đường sắt xuyên Việt chạy dọc theo tỉnh, trụchành lang Ðông - Tây nối Thái Lan - Lào - Việt Nam theo đường 9 Toàn huyện

có 11 xã và 1 thị trấn, trong đó có hai xã vùng núi [37]

2.1.2 Khí hậu

Mùa mưa trùng với mùa bão lớn từ tháng 8 đến tháng 11 với lượng mưatrung bình từ 2.500 - 2.700 mm Mùa khô kéo dài từ tháng 3 đến tháng 7, mưa ít,lượng nước bốc hơi lớn, thường xuyên bị hạn hán, nước mặn đe dọa Nhiệt độtrung bình hàng năm cao nhất là 35,9 oC, thấp nhất là 12 oC, nhiệt độ trung bình

các tháng trong năm là 87,3% [37]

2.1.3 Địa hình đất đai

Toàn bộ lãnh thổ của huyện thuộc lưu vực sông Tả Trạch, thuộc hệ thốngsông Hương Sông Tả Trạch là nhánh sông chính bắt nguồn từ vùng núi trungbình huyện Nam Đông với độ cao tuyệt đối 900 m Sông chính chảy theo hướngchung Nam Đông Nam – Bắc Tây Bắc cho tới ngã ba Tuần thì hội nhập vớisông Hữu Trạch và trở thành sông Hương Tổng chiều dài của sông Hữu Trạchchảy qua huyện Hương Thủy khoảng 32km, chảy qua địa bàn các xã Dương Hòa

và Thủy Bằng

Tổng diện tích đất tự nhiên của huyện là 457,34 km2 Dân số toàn huyện

là huyện lỵ, dân số toàn huyện được phân bố theo các địa bàn hành chính

2 2 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại thị xã Hương Thủy và số lượng gia cầm du nhập ở tỉnh Thừa Thiên Huế

2.2.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại thị xã Hương Thủy

Chăn nuôi gia cầm tại thị xã Hương Thủy tồn tại dưới nhiều hình thức trang

trại, gia trại, nuôi nhốt, thả vườn… Đến nay toàn huyện có khoảng 50 hộ chănnuôi gia cầm có quy mô gia trại từ 100 con trở lên Trên địa bàn ccó khoảng 12

cơ sở ấp nở gia cầm thủy cầm giống có công suất từ 11 ngàn đến 14 ngàn con,chưa đáp ứng nguồn giống chăn nuôi và trứng thành phẩm tại chỗ… Do đầu tưchưa thỏa đáng nên phần lớn hộ dân trên địa bàn tỉnh chủ yếu chăn nuôi theophương thức nhỏ lẻ, tự phát Theo thông tư 24 của Bộ NN&PTNT thì những môhình có doanh thu từ 1 tỷ đồng trở lên mới gọi là trang trại Như vậy, hiện naynói một cách đúng nghĩa trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên - Huế có khoảng 10 trangtrại chăn nuôi gia cầm có doanh thu từ 1 tỷ đồng trở lên, số còn lại khoảng từ

400 - 500 gia trại vừa và nhỏ [35] Tại Hương Thủy chưa có trang trại theo đúngquy mô quy định

2.2.2 Số lượng gia cầm du nhập ở tỉnh Thừa Thiên Huế

Một nghịch lý đang diễn ra hiện nay hàng tháng số lượng gia cầm nhậpvào địa bàn tỉnh Thừa Thiên - Huế lên đến hàng chục nghìn con đến các lò mổ.Riêng trong tháng 9/2011 Thừa Thiên - Huế nhập 31.070 con gia cầm, trong đó8.250 con vịt 6,7 tấn thịt gà đông lạnh trong lúc đó thị trường đầu ra cho cáctrang trại, gia trại gặp hết sức khó khăn Tại địa bàn Phú Lộc, nhiều trang trại,gia trại chăn nuôi gia cầm phải phát triển một cách cầm chừng, một số trang trạikhác lại phá sản Qua tìm hiểu phỏng vấn các lò mổ, lượng gia cầm du nhập chủyếu từ các tỉnh phía nam như Đà Nẵng, Quảng Nam, Bình Định, Quãng Ngãi…

2.3 Giới thiệu bệnh Gumboro

2.3.1 Tình hình bệnh Gumboro trên thế giới và ở Việt Nam

Bệnh được Cosgrove phát hiện năm 1962 tại một trại gà ở làng Gumboro,bang Delaware của nước Mỹ [31] Sau khi công bố ở Mỹ, bệnh được phát hiện ởchâu Âu, châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và trở thành một vấn đề của toàn thế giới

Tại châu Âu người ta phát hiện được bệnh Gumboro khá sớm Ở nướcAnh vào năm 1962 Năm 1966 bệnh Gumboro được phát hiện ở Ý Năm 1967phát hiện ở Đức…

Tại châu Á năm 1966 phát hiện bệnh Gumboro ở Israel, đến năm 1973 pháthiện ở Thái Lan bắt đầu xuất hiện bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi công nghiệp

Tại châu Úc, năm 1974 có dấu hiệu của bệnh Gumboro xảy ra trong mộtđàn gà ở Australia, sau đó các tác giả phân lập được mầm bệnh [4]

Năm 1986 người ta đồng thời phát hiện được virus Gumboro có độc lực cao

ở nhiều quốc gia châu Âu Hà Lan Anh, Pháp, Tây Ban Nha Các tác giả cho rằngvirus Gumboro có độc lực mạnh từ một ổ dịch lan truyền thành một vùng dịch

Tại châu Phi năm 1986 bệnh Gumboro xảy ra quanh năm ở Negieria Năm 1991 tại Ai Cập, Malaysia, Kenia, Singapore, các nhà nghiên cứu

đã công bố dịch và phân lập được virus cường độc

Ở nước ta, từ khi được chính thức phát hiện vào đầu những năm 1980đến nay, bệnh xảy ra ngày càng trầm trọng và toàn diện trên toàn quốc, gây thiệthại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm [1]

Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh Gumboro tại Việt Nam,nhưng bệnh vẫn tiếp tục xảy ra chưa khống chế được một cách triệt để và vẫn làmối đe dọa to lớn [4]

2.4 Giới thiệu chung về virus gây bệnh Gumboro

Virus gây bệnh Gumboro (Infectious bursal disease virus – IBDV), hay

thường gọi là virus Gumboro, virus này thuộc chi Avibirnavirus, họ

Birnaviridae, là họ mới trong hệ thống phân loại virus động vật và người [4]

Virus có dạng hình khối, gồm 20 mặt đều, kích thước khoảng 50 - 60 nm.Một tế bào bị nhiễm có thể chứa một hay vài tập hợp virus và chúng sắp xếp đềuđặn cạnh nhau, giống như tổ ong ở trong nguyên sinh chất của tế bào VirusGumboro không có vỏ bọc ngoài mà chỉ là dạng virus trần, bao gồm lõi chứa acidribonucleic (ARN) và bao quanh hệ gen ARN là lớp vỏ protein hay còn gọi làcapsid Virus Gumboro bao gồm 32 đơn vị hình thái, mà mỗi đơn vị hình thái gọi làcapsomer, hợp thành lớp vỏ bọc capsid bao lấy acid ribonucleic bên trong [11], [4]

2.4.1 Đặc điểm hình thái và phân loại virus Gumboro

2.4.1.1 Đặc điểm hình thái

Virus Gumboro có dạng hình khối, gồm 20 mặt đều, kích thước khoảng

50 - 60 nm Một tế bào bị nhiễm có thể chứa một hay vài tập hợp virus và chúngsắp xếp đều đặn cạnh nhau, giống như tổ ong ở trong nguyên sinh chất của tếbào Virus Gumboro không có vỏ bọc ngoài mà chỉ là dạng virus trần, bao gồmlõi chứa acid ribonucleic (ARN) và bao quanh hệ gen ARN là lớp vỏ protein haycòn gọi là capsid Virus Gumboro bao gồm 32 đơn vị hình thái, mà mỗi đơn vịhình thái gọi là capsomer, hợp thành lớp vỏ bọc capsid bao lấy acid ribonucleicbên trong [11], [4]

2.4.1.2 Các type, các chủng virus Gumboro

Virus Gumboro gồm có 2 serotype serotype I gây bệnh ở trên gà, tùythuộc vào mức độ độc lực, người ta chia thành 4 nhóm chính đó là nhóm rấtcường độc, nhóm cổ điển, nhóm biến đổi và nhóm nhược độc Giữa các chủngtrong cùng serotype I có thể có mức độ cộng đồng kháng nguyên không đồngđều, nhiều trường hợp chủng này chỉ cho 30% miễn dịch chéo với chủng khác

Do vậy rất cần lưu ý trong việc sử dụng các loại vaccine nhược độc phòng bệnhGumboro Serotype II bao gồm tất cả các chủng virus cường độc Gumboro gâynhiễm và được phân lập ở gà tây [4]

Một số chủng virus Gumboro hiện nay được sử dụng trên thế giới là Các chủng cường độc thuộc type I bao gồm

- Chủng CVL 52/70 đang được sử dụng làm chủng cường độc chuẩn theo

đề nghị của Tổ chức dịch tễ thú y thế giới (OIE)

- Chủng ST-C, D78, IM, 2512, MC, MT… được phân lập ở Mỹ trở nêncác chủng cường độc chuẩn Gumboro

- Chủng LVN của Lukert, chủng VNJO của Pháp được sử dụng làmvaccine vô hoạt

- Các chủng nhược độc thuộc type I bao gồm chủng Sal, BB, Lukert,được dùng để chế vaccine Gumboro nhược độc [4]

2.4.2 Cấu trúc phân tử của virus Gumboro

Virus Gumboro bao gồm một hệ thống gen chứa hai sợi ARN và đượcphân bố trong hai phân đoạn khác nhau gọi là phân đoạn A và phân đoạn B [24]

Phân đoạn B có độ dài khoảng 2800 nucleotide, chứa duy nhất cho mộtcấu trúc gen mã hóa cho sự tổng hợp một protein duy nhất có tên gọi là VP1(VP – viral protein) VP1 có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzymeARN-polymerase của virus Enzyme này có vai trò xúc tác trong quá trình tổnghợp nguyên liệu ARN, vật liệu di truyền của virus [4]

Phân đoạn A trong hệ gen của virus Gumboro có độ dài tổng cộng là

3200 nucleotide bao gồm 2 bộ phận gen tổng hợp Bộ phận thứ nhất là một cấutrúc đơn gen (monocistronic) mã hóa cho một tiền protein có phân tử lượng là

108 kDa mà trong quá trình tiếp theo sẽ được phân cắt thành các protein cấu trúc

có tên gọi là VP1, VP2, VP4 [33] Bộ phận thứ 2 là một phần ADN trong phânđoạn A, mã hóa cho một loại protein khác có tên gọi là VP5, mà chuỗi ADN nàylồng vào trong phần gen của VP2

Do vậy, hai loại protein này sử dụng chung một phần chuỗi nucleotitdelàm thành phần của mình nhưng bộ ba mã hóa cho thành phần acid amin là khácnhau, VP5 là một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ (17 kDa), mới đượcphát hiện gần đây có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợpprotein, đặc biệt trong quá trình khởi phát sự “tự nguyện chết” của tế bào dẫnđến suy giảm miễn dịch [22] Ngoài ra VP5 còn có vai trò quan trọng trong tiếntrình gây bệnh, bởi vì một số thực nghiệm đã chứng minh nếu virus thiếu thànhphần hoặc khiếm khuyết thành phần VP5, sẽ dẫn đến khả năng mất một phầnhay hoàn toàn tính gây bệnh tức là không thể hiện bệnh tích vi thể và đại thể ởtúi Fabricius [28]

Protein VP2 và VP3 là protein cấu trúc, cấu tạo nên thành phần ngoàicùng của virus đó chính là capsid Trong cấu trúc capsid, VP2 trình diện lên bềmặt, là thành phần protein bề mặt, còn VP3 lặn sâu vào bên trong, là thành phầncấu tạo bên trong VP4 chính là protease một loại enzyme có chức năng phân cắtprotein có vai trò cắt rời chuỗi polypeptide do toàn bộ phân đoạn A tổng hợp gọi

là protein chung hay protein đa phần (polyprotein) Protein được tổng hợp dotoàn bộ cấu trúc đa gen (polycistronic) của phân đoạn A [34]

Protein VP2 đã được chứng minh là một loại protein có tính khángnguyên và có tính chất bảo vệ virus, do vậy VP2 đại diện cho tính độc lực vàtính gây bệnh của virus Protein bao gồm một vùng gọi là trung tâm khángnguyên, mà ở đó có một phần cấu trúc có chứa một đoạn giới hạn khoảng 150acid amin gọi là epitope, có vai trò trong quá trình kích thích cơ thể động vật bịnhiễm sản sinh ra kháng thể trung hòa [26] Sự biến đổi bất kỳ nào một acidamin trong VP2 đề có thể dẫn tới sự thay đổi nhất định của tính kháng nguyên

và tính gây bệnh Tuy nhiên có một vùng hẹp trong cấu trúc gen của VP2 gọi làvùng “siêu biến đổi” (hypervariable region), có thành phần nucleotide và acidamin thay đổi trong các chủng khác nhau, định vị ở chính giữa của gen VP2 tính

từ nucleotide thứ 103 đến nucleotide thứ 1176, bao gồm 474 nucleotide, vớikhoảng 150 acid amin, chịu trách nhiệm đặc biệt về tính kháng nguyên Protein

sử dụng vùng “quyết định kháng nguyên” để kích thích cơ thể sản sinh ra khángthể có tính chất thuộc loại kháng thể tham gia phản ứng trung hòa (VN – virusneutralization) Một dãy gồm 12 - 20 acid amin khung, xen kẽ trong các acidamin khác vùng “siêu biến đổi” gọi là epitope Epitope có cấu trúc vòm đặc biệt,chịu trách nhiệm kích thích và kết hợp với kháng thể tương ứng Nếu vùng “siêu

biến đổi” có thành phần nucleotide biến đổi trong giới hạn nhất định, khônghoặc rất ít làm thay đổi acid amin của vùng “siêu biến đổi” nói chung và dãyepitope nói riêng, thì tính miễn dịch vẫn được đảm bảo trong quan hệ tương táckháng nguyên - kháng thể giữa các virus Gumboro tương ứng Như vậy, VP2chính là loại hình kháng nguyên ts (type-specific) [3]

Về cơ bản hầu hết các chủng virus Gumboro trong cùng một giống virus,đều giống nhau ở các gen quy định sự tổng hợp protein VP1, VP3, VP4 và VP5.Chúng chỉ khác nhau ở gen quy định sự tổng hợp protein VP2, hay chính xáchơn chúng chỉ khác nhau ở vùng “siêu biến đổi” của gen VP2 Chính vì vậy,

“vùng siêu biến đổi” được dùng làm đích để so sánh, chẩn đoán các chủng viruscường độc Gumboro, qua thao tác trung gian bằng phương pháp sinh học phân

tử Tóm lại, VP2 được sử dụng nhằm phân biệt type và độc lực khác nhau củacác chủng virus [4]

Quá trình “nhược độc hóa” (biến đối từ chủng cường độc thành nhượcđộc yếu hơn) hoặc trở nên “vô độc” hoặc “lại độc” đều là hệ quả của quá trìnhbiến đổi có tính quy luật của bộ acid amin làm khung nằm trong epitope củaprotein VP2

VP3 là thành phần protein làm khung cấu tạo nên capsid và có tính khángnguyên thuộc loại hình kháng nguyên gs (group-specific), kích thích cơ thể sảnsinh ra kháng thể kết tủa, mà virus Gumboro thuộc cả serotype I và serotype IIđều kích thích sản sinh được Vì vậy, VP3 dễ dàng cho phản ứng kết tủa chéo vàchỉ có tác dụng nhận biết virus Gumboro với các loại virus khác họ khác [32]

2.4.3 Cơ chế phân tử quá trình nhân lên của virus Gumboro

Sau khi virus được thụ thể có trên bề mặt của màng tế bào tiếp nhận thìvirus thực hiện quá trình xâm nhập sâu hơn Thụ thể tế bào là một thành phầncấu trúc trên màng tế bào được biến đổi đặc hiệu để tiếp nhận virus Gumboro.Tiếp theo virus phải lột vỏ capsid để giải phóng hệ gen ARN Quá trình đầu tiênđược thực hiện là virus sao chép thông tin và tổng hợp protein VP1, bởi vì VP1

có giá trị làm enzyme xúc tác ARN-polymerase cho các quá trình tiếp theo [29]

Tiếp theo là sự tổng hợp một loại protein chung từ phân đoạn A của ARNcủa hệ gen virus Protein này còn gọi là tiền protein có phân tử lượng 108 kDa.Trong giai đoạn tiếp theo, protein chung này được phân cắt thành hai loạiprotein khác Một loại có tên gọi là VP2a có phân tử lượng 40 - 50 kDa Loạithứ hai chứa VP3 và VP4 có phân tử lượng là 35 - 60 kDa

Giai đoạn này gọi là giai đoạn phân cắt Tiếp theo, sau khi cắt bỏ mộtphần nhỏ không cần thiết, VP2a được phân cắt tiếp thành VP2b có phân tửlượng 40 - 45 kDa và là thành phần bề mặt của vỏ capsid có trách nhiệm về tínhkháng nguyên và tính độc lực của virus, hay còn được chính thức gọi là VP2kháng nguyên thành phần tham gia phản ứng trung hòa Còn VP3 và VP4 đượcphân cắt thành hai loại hình protein riêng biệt Loại thứ nhất có phân tử lượng bé(28 kDa) gọi là VP4 có hoạt tính sinh học làm enzyme protease, giúp cho thaotác phân cắt protein khác của virus Loại thứ hai có tên gọi là VP3 (30 - 32 kDa)làm thành phần bên trong của vỏ capsid, chịu trách nhiệm như một protein cấutrúc và đó cũng là thành phần kháng nguyên tham gia phản ứng kết tủa khuếchtán trên thạch [4]

Trong chuỗi ARN có rất nhiều phần ARN ngắn có tác dụng trong vấn đềchuyển nạp thông tin, điều hòa quá trình sao chép gen, đóng vai trò khởi động(promotor), kích hoạt (enhancer) hoặc làm vị trí cho protein bám vào (bindingsite) Một số chuỗi có cấu trúc lặp, cấu trúc vòm, cấu trúc bậc hai nhằm đảm bảo

an toàn cho hệ gen virus Tất cả những chuỗi này thường nằm ở vùng 5’ hay 3’tức là ở trước và sau cấu trúc gen của virus

ARN cũng được nhân lên để tạo nguyên liệu cho virus mới VP1 xúc tácnhư một ARN polymerase để tổng hợp nên sợi ARN hệ gen - các phân đoạn A

và B Các phân đoạn này tập hợp với nhau và coi là sợi dương làm khuôn chovirus tổng hợp nên sợi âm Các sợi này là thành phần chính trong hệ gen củavirus Sau khi được nhồi vào trong vỏ capsid thì phân đoạn A lại kết hợp với phânđoạn B tạo nên một hình thái ARN hai sợi Các virus mới được hình thành này tiếpcận màng tế bào (lympho B) gây áp lực lên màng tế bào làm thành phần màng tếbào biến đổi và giúp virus trồi ra ngoài màng tế bào

Giai đoạn này là giai đoạn “nảy chồi” Có hàng chục nghìn virus đượcgiải phóng ra khỏi tế bào theo cơ chế này [4]

2.4.4 Đặc tính nuôi cấy

2.4.4.1 Nuôi cấy trên phôi gà

Phôi gà 10 - 11 ngày, có thể tiêm bệnh phẩm chứa virus, vào màng niệu,vào xoang niệu mô, vào túi lòng đỏ Trong đó phương pháp tiêm vào màng niệu

là tốt nhất Sau khi tiêm virus, phôi có thể chết từ ngày thứ 3 - 5, bệnh tích chủyếu là gây sung huyết, xuất huyết màng niệu, màng dày lên, phôi bị sung huyết,thùy thũng ở vùng bụng, có điểm xuất huyết dưới da, nhất là vùng da đùi, đầu vàhai bên sườn của phôi, gan sưng có điểm xuất huyết và hoại tử [16]

2.4.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào

Bao gồm các tế bào có nguồn gốc từ phôi như tế bào phôi gà, tế bào Phôi

gà tây, tế bào phôi vịt hoặc tế bào thận thỏ, thận khỉ… Nhưng virus không thíchứng ngay khi nuôi cấy trên môi trường tế bào, mà phải qua vài đợt cấy chuyểntiếp đời thì virus mới thích ứng và gây bệnh tích cho tế bào

Hiện nay hay dùng môi trường tế bào tổ chức xơ phôi gà để phân lập nhângiống và nghiên cứu tính kháng nguyên của virus, thường 48 - 96 giờ sau khinuôi cấy virus, có thể quan sát được sự hủy hoại của tế bào như tế bào co cụmlại, biến dạng

Nếu cấy chuyển liên tiếp nhiều đợt qua môi trường tế bào tổ chức thì độclực của virus giảm dần và có thể sử dụng giống virus này làm vaccine [16]

2.4.4.3 Nuôi cấy trên gà thí nghiệm

Dùng gà 3 - 6 tuần tuổi để nuôi cấy virus, chọn gà chưa tiêm phòngGumboro và kiểm tra trong huyết thanh gà không có kháng thể Gumboro Gàđược tiêm virus sau 24 - 72 giờ virus sẽ nhân lên trong các cơ quan lympho đặcbiệt là túi Fabricius, làm túi bị viêm, sưng, các tổ chức túi bị phá hủy, biến màu,túi tăng về kích thước và trọng lượng Nếu thu hoạch túi Fabricius vào thời điểm

48 - 72 giờ sau khi gây nhiễm sẽ thu được lượng virus lớn nhất và độc lực củavirus mạnh

Ngoài biểu hiện đặc trưng ở túi Fabricius, gà còn có những triệu chứnglâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh Gumboro

Virus Gumboro khi cấy chuyển nhiều đợt trên phôi gà 3 - 6 tuần tuổi thìđộc lực của virus được tăng cường [16]

2.4.5 Sức đề kháng

Virus có sức đề kháng cao trong tự nhiên, đặc tính này là nguyên nhân tồntại của mầm bệnh trong các trại nuôi gà, nếu như không thực hiện triệt để côngtác vệ sinh tiêu độc sau khi đã hết dịch

Virus bị vô hoạt ở độ pH 12 và pH 2, ở nhiệt độ 56 °C virus bị diệt trong 5giờ, 60 °C trong 30 phút, 70 °C virus chết nhanh chóng Các chất hóa học thôngthường có thể diệt được virus như formalin 0,5% trong 6 giờ, phenol 0,6% trong

1 giờ, chloramin 0,5% trong 10 phút

Trong phân rác, chất độn chuồng và nền chồng gà bị nhiễm, virus tồn tạirất lâu, đây chính là nguồn tồn trữ virus dẫn đến việc bệnh xảy ra lưu cữu quanhnăm [16]

có tác dụng gây miễn dịch, ví dụ như đối với bệnh Newcastle, đồng thời khi gàmắc bệnh Gumboro sẽ tạo điều kiện cho một số bệnh khác phát ra như Marek,CRD… [16]

2.4.7 Đường lây truyền

Bệnh có tính chất truyền lây rộng rãi, rất dễ dàng từ gà này sang gà khácbởi phân, hơi thở, dịch viêm, truyền qua quần áo, dụng cụ chăn nuôi giữa cáctrại Truyền lây qua trứng, qua vaccine chế từ trứng gà bị nhiễm mầm bệnh

Khi virus vào cơ thể, sinh sôi phát triển trong đại thực bào, lâm ba cầu rồivào tuyến Fabricius, tuyến Fabricius viêm sưng to, sau đó teo nhỏ không cònkhả năng sản sinh kháng thể Sức chống đỡ bệnh của cơ thể kém hẳn, khả năngbội nhiễm các bệnh truyền nhiễm khác tăng lên Khi gà bị bệnh Gumboro cácbệnh khác như CRD, ỉa chảy do vi trùng… được dịp phát triển, việc dùng thuốckháng sinh rất ít có hiệu quả [18]

2.5 Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể virus lan truyền nhanh và tập trung ở các cơquan lympho và các nang túi, gây sưng phù thũng, xuất huyết, kìm hãm chứcnăng của tế bào lympho, gây hoại tử tế bào Virus Gumboro đầu tiên vào cơ thểgia cầm theo đường tiêu hóa Sau đó chúng xâm nhập qua niêm mạc ruột vàđược các thực bào tiếp nhận, đồng thời chúng tiếp xúc với lympho B còn non vàlympho B trưởng thành đang lưu động Virus bắt đầu thực hiện quá trình nhânlên cục bộ, chỉ sau khoảng 6 - 8 giờ có một số lượng virus đáng kể được giảiphóng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn Thông thường 9 - 11 giờ sau khi vào hệtiêu hóa một số lượng virus đáng kể đã có mặt trong túi Fabricius và bắt đầu tấncông loại hình lympho B, đó là lympho B trưởng thành và lympho B tiền thân.Tại đây virus nhân lên với một tốc độ hết sức mãnh liệt, chỉ trong vòng vài chụcgiờ số lượng lympho B giảm nhiều do bị phá hủy đồng thời xuất hiện một sốbệnh tích vi thể và đại thể trong túi Fabricius và một số cơ quan liên quan [4]

Số lượng virus Gumboro giải phóng ra đã xâm nhập vào hệ thống tuần hoànđợt thứ hai và gây nên sự nhiễm trùng máu Qua hệ tuần hoàn virus Gumboro lạiđược đưa đến các cơ quan thích ứng và bắt đầu gây nên các bệnh tích đặc trưng, tại

đó virus rất thích ứng với các tế bào lympho B, với các phôi bào lympho B, tấncông và nhân lên trong các tế bào, phá hủy và làm giảm đáng kể loại tế bào này Số

tế bào lympho mất đi không được bù đắp làm cho chức năng miễn dịch giảm, gâynên hiện tượng suy giảm miễn dịch, mức độ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào độclực của virus, thời gian và nơi xâm nhập vào cơ thể gà

Năm 1980, Skeels chứng minh được cơ chế sinh bệnh và bệnh tích dựatrên phức hợp miễn dịch bệnh lý Ông cho rằng bệnh tích là kết quả của phảnứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể với sự có mặt của bổ thể Bình thườngtrong cơ thể gà có rất ít bổ thể khi bị nhiễm virus Gumboro chỉ sau 1 - 3 ngàylượng bổ thể bắt đầu tăng lên và làm tăng nhanh tốc độ của phản ứng Khi lượng

bổ thể tham gia vào phức hợp miễn dịch bệnh lý thì chu trình bệnh cũng kếtthúc, một chu trình bệnh lý thông thường kéo dài 8 - 10 ngày Những cá thể nàotrong đàn không có khả năng chống đỡ nổi sự bất cân bằng do quá trình bệnh lýgây ra sẽ bị chết

Kết thúc quá trình bệnh, túi Fabricius mất hết các nang lympho, chứcnăng miễn dịch của gà bị suy giảm, sự chống đỡ với các bệnh khác không còn,

gà dễ dàng bị nhiễm các bệnh khác [3]

Về nguyên lý để chống lại virus Gumboro cần vô hiệu hóa chúng ngay từđầu, không cho chúng gây bệnh tích, gia cầm không bị suy giảm miễn dịch ảnhhưởng đến các chương trình vaccine khác Sự tác hại của sự suy giảm miễn dịch

có thể còn trầm trọng hơn nhiều so với chính tác hại của virus gây ra Tiến trình

và mức độ suy giảm miễn dịch do virus Gumboro gây ra có thể tóm tắt như sau:

- Nếu gà bị nhiễm virus cường độc Gumboro vào lúc một vài ngày tuổisau khi nở, thì gà con sau khi lớn lên có thể bị suy giảm miễn dịch suốt đời Gà

bị bệnh ở lứa tuổi này thường bị bệnh ở thể cận lâm sàng hoặc thể ẩn nhiễm,nhưng các cơ quan và các tế bào thẩm quyền miễn dịch bị tổn thương trầm trọngdẫn đến suy giảm miễn dịch nặng nề Các chương trình vaccine sau này trở nên

- Nếu bị nhiễm virus từ 2 - 3 tuần tuổi thì tác hại gây suy giảm miễn dịchkhông lớn, lúc này một lượng lớn các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trưởngthành đã thoát ra khỏi túi đến các cơ quan ngoại biên và lưu động trong hệ tuầnhoàn nên mặc dù bị virus cường độc Gumboro tấn công túi và các tế bào còn lạitrong túi song vai trò hoạt động miễn dịch vẫn được tế bào khác trong cơ thểđảm nhiệm thay thế [4]

2.6.2 Bệnh tích

Kết quả mổ khám cho thấy cho thấy túi Fabricius là nơi xảy ra những biếnđổi ác liệt và đặc trưng nhất Giai đoạn đầu túi Fabricius sưng to gấp 2 - 3 đợt sovới bình thường các múi nang lồi ra có màu trắng ngà hay màu kem, có hiệntượng thẩm dịch nhầy gelatin bao bọc quanh túi, xuất huyết thẩm dịch bên trongtúi, cắt đôi túi Fabricius thấy có dịch nhầy màu vàng có thể thấy những điểmxuất huyết li ti hình đinh ghim Sau khoảng 5 - 6 ngày trọng lượng và kích thướctúi trở lại như ban đầu, trong túi có những cục đông vón protein hay sợi fibrinthường gọi là “bã đậu” Lúc này các nang lympho bị phá hủy nặng nề, các tổchức liên kết và tổ chức xơ phát triển Ngày thứ 8 trở đi trọng lượng và kíchthước túi lúc này chỉ bằng 1/4 - 1/8 ban đầu [2]

Một điển hình khác của bệnh Gumboro là sung huyết và xuất huyết nội

cơ, thường thấy ở cơ ngực và cơ đùi có các chấm hoặc mảng xuất huyết Ngoài

ra lách có thể hơi sưng thường có những điểm hoại tử màu ghỉ trải đều trên bềmặt Dạ dày tuyến và dạ dày cơ có thể bị xuất huyết Tuyến tụy có thể xuấthuyết lấm chấm hay có những đám hoại tử màu ghỉ xám Thận có thể bị sưngnặng, tuyến ức có xuất huyết điểm hay mảng [8]

Xét nghiệm vi thể cho thấy ngay 24 giờ sau nhiễm, phần lớn tế bàoLympho bắt đầu bị phá hủy, số lượng của chúng bắt đầu giảm mạnh Các váchnang giảm dần rộng ra, nang hẹp lại và có hình tròn, hình chữ nhật, hình oval.Trung tâm bị hoại tử, rỗng, không có hoặc chỉ có một số ít tế bào lympho vùngngoại vi của nang, thay vào đó là các tế bào bắt đầu dị màu, tế bào liên kết võngnội mô Ở giờ thứ 72 - 96 hầu như 100% các nang đều có biểu hiện bệnh tích vithể nói trên Khi các biến đổi viêm sưng mất dần, cũng là lúc xuất hiện quá trìnhtiêu viêm, lúc này các mô liên kết tăng sinh, xâm lấn vào lòng nang, có xuhướng lấp đầy các lòng nang, làm cho cấu trúc túi trở nên dày, dai và xơ [4]

2.7 Miễn dịch của cơ thể khi nhiễm virus

Virus là một sinh vật nội bào Về cấu trúc chúng chỉ gồm có vỏ bọc vànhân (ARN hoặc ADN) Muốn sống và nhân lên chúng phải tồn tại trong các tếbào khác, sử dụng acid nucleic cùng với bộ máy tổng hợp protein của tế bàochủ Để xâm nhập vào tế bào trước tiên chúng phải gắn với các phân tử có trên

Trước sự tấn công như vậy, cơ thể tự bảo vệ mình bằng các cơ chế miễndịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu

2.7.1 Miễn dịch không đặc hiệu

Có ba cơ chế chính của miễn dịch tự nhiên chống virus

+ Tăng sản xuất interferone (IFN) từ tế bào nhiễm chức năng quan trọngnhất của IFN là cảm ứng để tế bào sản sinh ra protein ngăn cản sự khởi đầu dịch

mã và phá hủy ARN thông tin của virus do đó ức chế sự nhân lên của virus tạichỗ cũng như đối với các tế bào lân cận, hạn chế sự lan truyền của yếu tố gâybệnh Nhiều người cho rằng vai trò ức chế sự nhân lên của virus chủ yếu là doIFN vì IFN được hình thành tại chỗ và nhanh chóng hơn kháng thể đặc hiệu.IFN không chỉ do virus kích thích tạo thành mà còn do hàng loạt các yếu tố cảmứng khác như ARN lạ hai sợi, polysaccharide của vi sinh vật, polynucleotidetổng hợp, một số thuốc gây giãn mạch như theophyllin, pirydamol

Hiện nay, người ta đã chiết đến 22 gen ở nhiều loại tế bào khác nhau nhưđại thực bào, tế bào NK, nguyên bào sợi, các tế bào thuộc cơ quan có khả năngsản xuất IFN

+ Tế bào NK tăng hoạt động, ly giải những tế bào nhiễm virus

+ Một số chất sinh học có khả năng tiêu diệt virus (lysozyme, mật) Ngoài

ra còn có sự tham gia của bổ thể, của hoạt động thực bào vào quá trình tiêu diệtvirus gây bệnh [6]

2.7.2 Miễn dịch đặc hiệu

dịch tế bào Các kháng thể dịch thể virus có vai trò quan trọng trong giai đoạnsớm của quá trình nhiễm, khi virus vẫn còn tự do xâm nhập vào tế bào Các IgM

và sau đó là IgG sẽ gắn với các protein của vỏ nhân hoặc bao ngoài virus, ngăncản chúng bám dính và đi vào tế bào chủ Kháng thể IgA tiết có tác dụng ngănchặn sự tấn công của virus theo đường niêm mạc Nói chung kháng thể dịch thểtrong một số trường hợp chứng tỏ có hiệu quả Vì vậy một số vaccine thực sự có

ý nghĩa trong việc phòng chống bệnh do virus

Tuy vậy với nhiều loại virus khác, kháng thể dịch thể không có tác dụng,

mà cơ chể chính lại là vai trò của miễn dịch tế bào mà chủ yếu là tế bào lymphođộc Tc Tc có tác dụng ly giải tế bào nhiễm, kích thích cytokine hoạt động nhưinterferone, hạn chế sự xâm nhập hoặc tiêu diệt virus [6]

2.7.2.1 Miễn dịch thụ động

Muốn tạo ra miễn dịch cho gà con phải tiến hành tiêm ngừa Gumboro cho

gà mẹ, kháng thể truyền qua trứng sẽ bảo hộ gà con khỏi bệnh Gumboro Thờigian bảo hộ thay đổi theo lượng kháng thể của gà mẹ Thông thường nếu sứckhỏe gà mẹ ổn định và được tiêm phòng tốt, hàm lượng kháng thể thụ động sẽcao, có thể bảo hộ gà con đến 4 tuần Song các nghiên cứu gần đây cho thấykháng thể truyền từ gà mẹ sang gà con không ổn định, lúc cao, lúc thấp, khôngđồng đều giữa các con trong đàn gà, đa số các trường hợp đều bảo hộ gà conkhông quá 20 ngày Chính sự tạo miễn dịch không ổn định trên gà mẹ đã gâynhiều khó khăn cho việc xác định lịch tiêm chủng, vì khó có thể căn cứ vào kếtquả xét nghiệm kháng thể mẹ truyền trên một số mẫu gà con để xác định lịchchủng ngừa cho cả đàn gà Khuynh hướng hiện nay là coi như không có khángthể mẹ truyền, do đó lịch chủng ngừa cho gà mẹ tỏ ra không cần thiết để từ đó

có thể tiêm chủng cho gà con lúc 1 ngày tuổi thay vì phải chờ đến khi hàmlượng kháng thể mẹ truyền xuống dưới mức bảo hộ mới được tiêm phòng [36]

2.7.2.2 Miễn dịch chủ động

Được tạo ra nhờ sự tiêm phòng Cần lưu ý do virus nhiễm qua đường tiêuhóa, do đó việc tạo miễn dịch tại chỗ trên đường tiêu hóa bằng cách cho uốngvaccine là rất quan trọng

- Miễn dịch chủ động tạo ra không mạnh, do đó phải chủng ngừa lặp lạisau đợt đầu 10 - 14 ngày Đồng thời phải lưu ý đến sự trung hòa vaccine dokháng thể thụ động và loại vaccine sử dụng [36]

2.8 Vaccine phòng bệnh Gumboro

2.8.1 Khái niệm về vaccine phòng bệnh Gumboro

Nếu xét về góc độ miễn dịch thì vaccine là chế phẩm sinh học hoặc bánsinh học, được con người tạo ra và đưa vào cơ thể để gây miễn dịch, tập dượccho cơ thể thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh,khi chúng xâm nhập vào cơ thể những đợt sau đó Có thể nói vaccine là yếu tốkhởi phát của quá trình đáp ứng miễn dịch, mà thành phần cơ bản của vaccine làkháng nguyên Kháng nguyên có thể là một protein hoàn toàn hoặc mộtpolypeptide nhỏ chứa nhóm hoạt động có tính kháng nguyên, hoặc là một nguồngen tạo sản phẩm kháng nguyên ngay tại cơ thể đối tượng được hưởng vaccine.Như vậy vaccine là chế phẩm có mang kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền sảnxuất kháng nguyên đó [4]

2.8.2 Vaccine ADN thế hệ mới phòng chống bệnh Gumboro

2.8.2.1 Khái niệm về vaccine ADN thế hệ mới

Một loại vaccine được gọi là vaccine thế hệ mới, phải là thành phẩm củamột quá trình có sự can thiệp, sử dụng, thao tác của công nghệ gen Nó đượcphân biệt với vaccine thế hệ cũ là vaccine thế hệ cũ được nghiên cứu sản xuấtbằng công nghệ lý học, hóa học, tế bào học tác động gián tiếp đến gen đốitượng, nhưng không trực tiếp can thiệp bằng kỹ thuật gen Những vaccine đượctạo bằng kỹ thuật gen được gọi là vaccine tái tổ hợp gen, hay vắn tắt là vaccinecông nghệ gen Thành phẩm vaccine thuộc loại này được gọi là vaccine thế hệmới Các loại vaccine thế hệ mới đã được thử nghiệm thành công và ứng dụngtrong thực tế phòng chống bệnh Gumboro bao gồm vaccine dưới nhóm; vaccinetái tổ hợp có vector truyền; vaccine virus Gumboro không có lõi và vaccineADN Vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng cả bốn hướng nói trên tỏ ra có hiệuquả thực tế phòng chống bệnh Gumboro tại nhiều nước trên thế giới [4]

Vaccine ADN là một loại hình vaccine đặc biệt thuộc thế hệ mới nhất củavaccine thế hệ mới, đó chính là acid deoxiribonucleic của một plasmid vectorbiểu hiện, được tái tổ hợp gen kháng nguyên với một hệ thống promoter mạnh,được tạo ra bằng công nghệ gen Sau khi đã được plasmid vector tái tổ hợpmang gen kháng nguyên, chúng được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng, ví

dụ E coli, vi sinh vật thích ứng, thì chỉ sau một thời gian ngắn nuôi cấy, chúng

ta có thể tách chiết, tinh chế một lượng lớn ADN để làm vaccine [4]

2.8.2.2 Tính cần thiết của việc nghiên cứu vaccine thế hệ mới

Cho dù chương trình phòng chống bệnh Gumboro được thực hiện mộtcách nghiêm ngặt, bao gồm chương trình vaccine chủ động và thụ động sử dụngvaccine nhược độc sống, vaccine phân tử và vaccine vô hoạt, cũng như sử dụngkháng huyết thanh, bệnh Gumboro vẫn hoành hành nghiêm trọng ở nhiều nước.Phòng chống bệnh chưa đạt hiệu quả cao do sử dụng không hoặc chưa đúng loạivaccine (do Gumboro có nhiều biến chủng và kháng nguyên thay đổi), dovaccine kém chất lượng do bảo quản và phương thức sử dụng không đúng Một

số vaccine Gumboro tuy có bảo vệ miễn dịch, nhưng có tác dụng phụ gây suygiảm miễn dịch làm ảnh hưởng đến hiệu quả các chương trình vaccine phòngchống các bệnh khác như Newcastle, Marek… là những bệnh nguy hiểm ở giacầm Mặt khác, các quá trình sản xuất, virus nhược độc Gumboro làm vaccine

có khả năng tăng cường độc lực và trở nên gây bệnh

Một loại hình vaccine thế hệ mới là ADN đang được ứng dụng rộng rãiđối với nhiều bệnh vật nuôi, trong đó có bệnh Gumboro trong vòng 5 - 7 nămgần đây Thực chất vaccine ADN chính là sử dụng ADN của chính plasmid tái

tổ hợp có chứa gen kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh Gen kháng nguyênđược phân lập (kỹ thuật PCR) và được ghép vào vector dẫn truyền về biểu thịgen (là các loại plasmid) đã được thiết kế phù hợp Plasmid tái tổ hợp gen khángnguyên được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng Tế bào chủ tiếp nhậnplasmid tái tổ hợp gen kháng nguyên được nuôi cấy và plasmid tái tổ hợp chứagen kháng nguyên được tách chiết, tinh khiết và sử dụng như là một vaccine.Khi sử dụng làm vaccine, người ta chỉ pha loãng ADN của plasmid có chứa hệthống gen kháng nguyên này và tiêm vào cơ thể Bằng một cơ chế đặc biệt,ADN hỗn hợp này cảm ứng nhập gen vào tế bào cơ thể và trở nên là nguồn genkháng nguyên cố định, luôn được sản xuất ra để tạo nên miễn dịch lâu bền cho

cơ thể Vì có bản chất là ADN, nên vaccine loại này rất bền với nhiệt độ tiện lợibảo quản lúc sử dụng, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới [4]

Hiện nay ở nước ta vaccine phòng bệnh Gumboro được chia làm hainhóm:

- Nhóm vaccine chết, gồm Gumboriffa, Cevac IBDK vaccine này tạomiễn dịch rất mạnh, rất an toàn Tuy nhiên thời gian từ khi chủng đến lúc bảo hộđược cho gà phải mất trên một tuần, vì vậy chỉ khuyến cáo dùng cho gà mẹ hoặcnếu dùng cho gà con thì phải kết hợp với vaccine sống

- Nhóm vaccine sống nhược độc, là loại vaccine sống làm giảm độc bằngcách cấy chuyển nhiều đời liên tục qua động vật, phôi hoặc môi trường tế bàokhông cảm thụ, dẫn đến sự biến đổi sinh học đặc biệt trong chủng đó Sự biếnđổi ở đây phải đảm bảo nguyên tắc cơ bản là độc lực virus bị giảm nhưng vẫngiữ nguyên vẹn tính kháng nguyên Tùy theo độc lực của virus vaccine người tachia vaccine làm 4 loại:

+ Vaccine nhược độc Gumboro có độc lực tương đối cao ngày nay thườngkhông được dùng vì nó có khả năng biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng và gâysuy yếu miễn dịch cho gà mẫn cảm Do đó nó được chế thành vaccine vô hoạt

+ Vaccine nhược độc trung bình cộng được chế từ virus làm nhược độc ít,gồm có IBD Blen, Bursa Plus, Bursa Blen, Nobilis PBG 98,

+ Vaccine có độc lực trung bình loại vaccine này dùng cho đàn gà mẫncảm hoặc gà có kháng thể thụ động cao mà không gây phản ứng vaccine hoặcsuy giảm miễn dịch và cũng không sợ virus bị trung hòa chết, vaccine này gồm

có Bur 706, Bursine - 2, Clone vac D78,

+ Vaccine có độc lực thấp rất an toàn khi sử dụng nhưng có kích thíchmiễn dịch kém và có thể bị trung hòa hết không nhân lên được nếu đàn gà đượcphòng có lượng kháng thể thụ động cao Vaccine này gồm có Gumboral CT,Burosin - 1 [36]

2.9 Chương trình tiêm chủng

Chương trình tiêm chủng và vaccine có thể được quản lý bởi chính sáchcủa chính phủ Chính sách phải phù hợp để thích ứng với từng bệnh cảnh vànhiều yếu tố khác, bao gồm sự có mặt của vaccine, miễn dịch từ mẹ, sử dụngvaccine khác, sự hiện diện của vi sinh vật, độ lớn của đàn hướng sản xuất, sự cómặt của phòng thí nghiệm, tình trạng lâm sàng, lịch sử tiêm chủng và giá cả Gàmái cần được tiêm chủng bổ sung để duy trì miễn dịch trong suốt cuộc đời của

chúng Ở nhiều nước việc tiêm chủng địa phương hoặc tiêm chủng mở rộng,thời gian tiêm chủng không phù hợp tất cả sẽ gây hậu quả nghiêm trọng Khókhăn và áp lực là vấn đề hàng đầu của nông dân nuôi gia cầm của các nước đangphát triển và gây hậu quả mà được gọi là “lạm dụng vaccine” [21]

* Lịch chủng ngừa

Đợt Đối với gà nuôi thả Đối với gà công nghiệp

sống trung bình

kháng thể để xác định ngày chủng đợt đầu, dùng thuốc chủng trung bình trên 1liều/con uống hoặc nhỏ miệng, sau đó 10 ngày lặp lại đợt hai bằng 1 liều vaccinesống trung bình hoặc kết hợp với 1/2 liều vaccine chết [36]

2.10 Các phương pháp chẩn đoán bệnh Gumboro

Một số quy định chung trong việc lấy mẫu để chẩn đoán Lấy mẫu bệnhphẩm ở từng cơ quan tổ chức nào của từng bộ phận cơ thể động vật hoặc từ xácđộng vật đã chết về bệnh cho phù hợp, nguyên tắc chung là nên lấy bệnh phẩm

từ những cơ quan, tổ chức có bệnh tích điển hình, thì việc chẩn đoán xét nghiệm

sẽ thuận lợi hơn

- Bệnh phẩm là máu cần dùng bơm hoặc kim tiêm vô trùng, hút từ tĩnhmạch cánh đối với gà cho vào ống nghiệm có nút cao su, lọ thủy tinh có nút mài

- Bệnh phẩm là các dịch họng dùng tăm bông ngoáy vào niêm mạc đường

hô hấp sau đó đựng vào các dụng cụ bình thủy tinh vô trùng có nút kín

- Bệnh phẩm là phân dùng tăm bông lấy từ hậu môn hoặc ngay sau khi bàitiết phân ra ngoài, phân được đựng trong túi polyethylene vô trùng

Việc vận chuyển các bệnh phẩm chứa virus cần được giữ trong môitrường bảo quản lạnh

Trước khi chẩn đoán cần xử lý nghiền nát trộn với nước sinh lý quay lytâm loại bỏ cặn, chắt lấy nước trong nếu cần thì phải xử lý tạp khuẩn bằng khángsinh [17]

2.10.1 Chẩn đoán lâm sàng và bệnh tích

Chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như dựa vào triệuchứng như kém ăn, bỏ ăn, háo nước, ỉa chảy, phân loãng… qua bệnh tích khi mổkhám như xuất huyết cơ, bệnh tích túi Fabricius… qua bệnh tích vi thể túiFabricius quan sát sự hủy hoại bên trong túi, đặc biệt là nang lympho [4]

2.10.2 Chẩn đoán phân biệt

- Phân biệt với bệnh Newcastle gà mọi lứa tuổi đều bị bệnh, sốt cao, ủ rũ,

sã cánh và triệu chứng thần kinh, phân có màu xanh, dạ dày tuyến xuất huyếtnhưng ở trên đỉnh ống tuyến, không có bệnh tích túi ở Fabricius

- Phân biệt với bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, gà dưới 6 tuần tuổi dễ

2.10.3 Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus

Tiêm hỗn hợp dung dịch 10 - 20% túi Fabricius và lách gà bệnh cho phôi

gà 9 - 10 ngày tuổi vào xoang niệu mô Theo dõi phôi gà trong 7 - 8 ngày saukhi tiêm Nếu có virus, phôi gà sẽ chết bắt đầu vào ngày thứ 3 và kéo dài đếnngày thứ 7 Bệnh tích của phôi chết bao gồm thủy thũng vùng bụng, sung huyết,xuất huyết lấm chấm dọc sống lưng, sau gáy và khớp chân, gan hoại tử và xuấthuyết lấm chấm, tim màu nhạt như bị nhúng qua nước sôi, hoại tử lấm chấm ởthận Màng nhung niệu có thể có xuất huyết nhẹ [8]

2.10.4 Chẩn đoán virus học

Túi Fabricius hoặc lách của gà mắc bệnh nghiền với nước sinh lý theo tỷ

lệ 1/5 hoặc 1/10, xử lý bằng kháng sinh, ly tâm loại bỏ cặn, lấy nước trong ở trênnhỏ vào miệng, mắt, hậu môn cho gà từ 3 - 6 tuần tuổi gà này chưa được tiêmphòng vaccine Gumboro, không nằm trong phạm vi có dịch Gumboro và kiểmtra trong huyết thanh không có kháng thể Gumboro Triệu chứng sớm nhất pháthiện thấy gà quay đầu lại mổ vào hậu môn của chính nó (vì túi Fabricius nằm sáthậu môn trên trực tràng) biểu hiện này liên quan tới bệnh tích sớm nhất xảy ra ởtúi Fabricius

Sau 2 - 3 ngày gây nhiễm, gà có triệu chứng quệt mỏ, ỉa phân trắng, loãnghoặc toàn nước, có khi lẫn máu trong phân, gà ủ rũ, bỏ ăn, lông xù, lông dínhđất, run rẩy, đôi khi gà loạn hướng, nằm liệt rồi chết, gà chết do mất nước nhiều

Khi mắc bệnh gà sốt cao, sau đó thân nhiệt giảm, gà gầy khô, nhìn bềngoài có thể thấy túi Fabricius sưng to Túi Fabricius là nơi chịu tác động củavirus nhiều nhất nên bệnh tích biểu hiện chủ yếu ở túi Fabricius như túi biến đổi

về kích thước, màu sắc, hình dạng, độ bền Lúc đầu sưng, xuất huyết, phù thũng,

có bã đậu, sau đó teo dần theo thời gian tiến triển bệnh Cơ ngực, cơ đùi xuấthuyết, ruột tăng sinh dày lên Đến ngày thứ 3 - 4 sau khi nhiễm virus thể tích túi

to gấp 3 đợt bình thường, đến ngày thứ 5 - 6 túi trở lại kích thước và trọnglượng ban đầu, sau đó teo dần đi đến ngày thứ 8 thì trọng lượng của túi chỉcòn lại 1/3 so với trọng lượng túi của gà cùng lứa tuổi không mắc bệnh [16]

Phương pháp gây nhiễm cho gà thí nghiệm đạt các kết quả chính xác hơn

cả, nhưng chi phí để kiểm nghiệm một mẫu bệnh phẩm khá tốn kém, thời gian

có kết quả thường lâu hơn Phương pháp này thường được áp dụng khi triệuchứng, bệnh tích trên lâm sàng không đủ để kết luận bệnh và xác định ổ dịch đểcông bố dịch

2.10.5 Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học

- Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể:

Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liênkết lý hóa như lực liên kết phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Walder-Wals,lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức với nhau, ví dụ giữa nhóm amin và nhómcarboxyl, lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau, lực kỵ nước

- Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học:

Virus Gumboro (IBDV) khi xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sinh

ra kháng thể dịch thể, kháng thể này có trong máu với một lượng tương đối lớn,

do đó có thể dùng phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng thể này khi cókháng nguyên chuẩn là virus Gumboro và ngược lại khi có kháng huyết thanh

chuẩn Gumboro thì có thể phát hiện được kháng nguyên [16].

2.10.5.1 Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGP (agar gel precipitation test)

- Nguyên lý:

Khi một kháng nguyên và một kháng thể tương ứng, nằm cách nhau mộtkhoảng trong thạch, chúng sẽ khuếch tán và tại chỗ gặp nhau sẽ hình thànhđường kết tủa trắng Sự kết tủa này xảy ra ở vùng mà tỷ lệ kháng nguyên vàkháng thể phải tương ứng đồng đều

Phản ứng AGP dùng để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên chuẩn

và ngược lại có thể phát hiện ra kháng nguyên khi có kháng thể chuẩn

- Phản ứng AGP cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ tiến hành, nên được sửdụng nhiều trong chẩn đoán [17]

Phản ứng đòi hỏi đối chứng dương tính và đôi khi do nồng độ giữa cácthành phần phản ứng không thích hợp, phản ứng có thể xảy ra ngay mép lỗthạch chứa kháng nguyên hay kháng thể nên rất khó phát hiện, đòi hỏi phải làmlại phản ứng với nồng độ kháng nguyên hay kháng thể thay đổi Với phươngpháp này cho độ nhạy thấp [13]

2.10.5.2 Phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu (IHA)

- Nguyên lý:

Hiện tượng ngưng kết trực tiếp hồng cầu chỉ xảy ra ở một số virus nhấtđịnh như virus Newcastle, virus cúm, còn đa số virus không trực tiếp gây ngưngkết hồng cầu, do đó muốn tạo ra sự ngưng kết thì phải xử lý kháng nguyên tức làtạo cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên hữu hình bằng cách gắnkháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu đóng vai trò là giá đỡ cho khángnguyên Khi kháng nguyên đã gắn trên hồng cầu, thì kháng nguyên đó trở thànhkháng nguyên hữu hình và phản ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng hơn

- Chuẩn bị hồng cầu gắn kháng nguyên:

Chế hồng cầu mẫn cảm kháng nguyên Khi làm phản ứng dung dịch hồngcầu 5% đem ly tâm 1800 vòng/phút Sau đó ủ với dung dịch kháng nguyên với

nguyên bám chặt trên bề mặt hồng cầu Tiếp tục rửa hồng cầu kháng nguyên 3đợt với PBS, rồi pha thành dung dịch hồng cầu 5% để tiến hành phản ứng

Ngoài ra còn có các phương pháp gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặthồng cầu như

+ Xử lý bằng các hóa chất như acid tannic, benzidine, muối chrom,glutaraldehyde… Các hóa chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và mộtnhóm chức gắn lên kháng nguyên

+ Dùng các hạt chất dẻo như hạt latex, bentonite… các hạt này có tácdụng hấp phụ kháng nguyên hòa tan vào trong [17]

Phản ứng dương tính trong trường hợp huyết thanh miễn dịch (kháng thể)tương ứng với kháng nguyên (virus) thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên,

mà kháng nguyên thì đã gắn trên bề mặt của hồng cầu do đó cũng làm cho hồngcầu ngưng kết theo

Phản ứng âm tính trong trường hợp huyết thanh miễn dịch (kháng thể)không tương ứng với virus (kháng nguyên) thì kháng thể sẽ không kết hợp đượcvới kháng nguyên, nên không kéo theo hồng cầu kết hợp được, hiện tượngngưng kết hồng cầu không xảy ra

2.10.5.3 Phản ứng xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA: Shifting assay

of standardized indirert agglutination)

- Nguyên lý:

Nếu cho tiếp xúc với enzyme cắt thụ thể bề mặt, hồng cầu động vật sẽ mấttính ngưng kết với virus trực tiếp gây ngưng kết hồng cầu, khi đó có thể sử dụngchúng làm giá thể để gắn các loại kháng nguyên của virus mầm bệnh khác nhau,

kể cả các virus gây ngưng kết hồng cầu như virus cúm, virus Newcastle Hồngcầu sạch thụ thể sẽ được gắn kết với một lượng thích hợp hỗn hợp kháng nguyêncủa virus Gumboro và sử dụng làm phản ứng ngưng kết gián tiếp (IHA) vớikháng thể huyết thanh (nên gọi là kháng nguyên IHA)

Nếu có sẵn kháng thể chuẩn (gamma-globulin) kháng Gumboro, chúng ta

có thể thiết lập phản ứng ngưng kết (gián tiếp) ổn định với kháng nguyên IHA.Khi đó nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus Gumbororồi sau đó cho tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của khángthể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với khángnguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với khángnguyên IHA Như vậy, ta có thể sử dụng cặp kháng nguyên IHA và kháng thểchuẩn để phát hiện kháng nguyên virus Gumboro Ngược lại, nếu trong bệnhphẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với khángthể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với khángnguyên IHA Phản ứng cho thể bị ngăn trở hoặc được tăng cường nếu trong dịchbệnh phẩm chứa, tương ứng, kháng nguyên hoặc kháng thể, hay có sự xê lệchngưng kết gián tiếp chuẩn [15]

2.10.5.4 Phản ứng trung hòa virus (virus neutralization test - VN)

- Nguyên lý:

Phản trung hòa là phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (virus) tươngứng với kháng thể có trong huyết thanh Bệnh phẩm chứa virus hỗn hợp vớihuyết thanh miễn dịch (kháng thể tương ứng) sau một thời gian nhất định, giữhỗn hợp trong tủ ấm thì virus sẽ trung hòa và virus không có khả năng gây bệnhcho động vật được

Muốn thực hiện phản ứng trung hòa cần phải chuẩn bị:

Kháng nguyên là huyền dịch chứa virus, huyền dịch này được đựng trong

theo yêu cầu sử dụng mà lấy các ống đó từ tủ lạnh ra

Kháng thể là huyết thanh miễn dịch, huyết thanh phải trong suốt hoàntoàn và được bảo quản trong tủ lạnh

Việc chuẩn bị virus huyết thanh cũng như việc pha loãng chúng phải thựchiện trong các điều kiện vô trùng, pha loãng virus từ huyền dịch ban đầu vớinước sinh lý theo các tỷ lệ 1/10, 1/100… 1/1.000.000 và cao hơn nữa

Virus sau khi pha loãng được trộn với huyết thanh miễn dịch và giữ ởnhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, mỗi độ pha loãng gây bệnh cho 4 - 6 độngvật thí nghiệm hay phôi thai gà hay lọ tế bào

Hiện tượng trung hòa được xác định theo sức sống của động vật thínghiệm, của phôi thai hay sự phát triển bình thường của các lọ tế bào

Tỷ lệ gây chết chính xác nhất, tính theo liều làm chết không phải toàn bộcác động vật hay số phôi thai thí nghiệm cũng như sự phá hoại toàn bộ các lọ tếbào, mà chỉ là 50%

Phản ứng trung hòa có thể được tiến hành trên phôi thai gà đang pháttriển, trên động vật thụ cảm, hay trên lọ tế bào

Ưu điểm của phương pháp này là có tính đặc hiệu cao và dễ giải thích kếtquả nhưng nhược điểm là mất quá nhiều thời gian, ít nhất phải mất 16 giờ, bêncạnh những yêu cầu của việc nuôi cấy tế bào tổ chức [33] Đối với nước taphương pháp này khá tốn kém do giá thành kháng thể đánh dấu (conjugate) còncao và ta chưa chủ động được nguồn cung cấp [11]

2.10.5.5 Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (ELISA:Enzyme-linked immunosorbent assay)

- Nguyên lý

Dựa trên cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể có thể sử dụng enzyme

và chất phát quang hóa học nhằm phát hiện sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể Kỹ thuật này lợi dụng đặc tính hấp phụ tự nhiên củaprotein trên một số cơ chất nhất là polystyrene để gắn kháng nguyên hoặc khángthể lên chất mang đó Rồi sau đó mới cho kháng thể hoặc kháng nguyên tươngứng vào để tạo nên phản ứng Kháng thể gắn (đánh dấu) enzyme sẽ được đưa vàosau đó để gắn đặc hiệu với kháng thể trước đó do kháng thể của một loài động vật

có tính kháng nguyên đối với loài khác (ELISA gián tiếp), hoặc thay thế vị trí củakháng thể đặc hiệu kháng nguyên (ELISA trực tiếp) Khi có sự kết hợp giữa khángnguyên và kháng thể thì enzyme sẽ xúc tác phản ứng oxi hóa cơ chất không màuthành sản phẩm màu So màu trên quang phổ kế sẽ xác định được mức độ phảnứng Kỹ thuật ELISA có độ nhạy và độ chính xác rất cao [29]

- Nguyên lý chẩn đoán, phát hiện kháng thể Gumboro:

Dùng để định lượng kháng thể Gumboro có trong huyết thanh gà Sửdụng ủ các mẫu kiểm tra trong các giếng, đã phủ kháng nguyên, kháng thể đặchiệu của Gumboro tạo ra một hỗn hợp với kháng nguyên phủ trong giếng Saukhi khi rửa đi những chất không gắn trong các giếng ta thêm kháng thể thứ haigắn enzyme vào Rửa những chất không gắn và thêm cơ chất vào Màu đượchình thành sau đó tương ứng với lượng kháng thể Gumboro có trong mẫu

Tuy nhiên giá thành xét nghiệm ELISA còn cao và nước ta chưa chủ độngkháng thể đánh dấu và khay nhựa hấp phụ protein chuyên dụng

2.10.5.6 Chẩn đoán bằng phương pháp phân tích genome virus

ARN virus có tính đặc hiệu cao đặc trưng cho loài và có thể làm khuôn tổnghợp in vitro phân tử ADN tương bù một sợi enzyme sao chép ngược (RT: reversetranscriptase) Sau đó ADN một sợi được tách khỏi ARN khuôn và lại làm khuôn

để tổng hợp ADN tương bù với nó nhờ enzyme DNA-polymerase (polymerasechain reaction) đoạn ADN có kích thước đặc hiệu phù hợp với một cặp mồioligonucleotide được tổng hợp Tổ hợp từ hai phản ứng trên được gọi là RT-PCR.Hiện nay, nhiều công trình RT-PCR liên quan đến việc chẩn đoán bệnh