3.3.2.1. Phương pháp pha hóa chất
- Dung dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS) 0,15M, pH 7,2 và pH 6,4
Hòa tan 11,87 gam Na2HPO4. 2H2O (hoặc 9,47 gam Na2PO4) vào trong 1000 ml
nước cất. Bên cạnh đó, hòa tan 9,08 gam KH2PO4 vào trong 1000 ml nước cất.
Sau đó, lấy 720 ml dung dịch Na2HPO4 hòa tan với 280 ml dung dịch KH2PO4 ta thu được dung dịch A. Lấy 300 ml dung dịch A hòa với 700 ml dung dịch sinh lý ta có dung dịch PBS pH 7,2. Hấp cao áp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Nếu pha 150 ml dung dịch Na2HPO4 với 150 ml dung dịch KH2PO4 rồi pha 300 ml dung dịch này với 700 ml dung dịch sinh lý muối ta có dung dịch PBS, pH 6,4. Hấp cao áp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 phút.
- Dung dịch sinh lý 0,85% có pH 7,2 Hòa tan 8, 5 g NaCl vào trong 1000
- Dung dịch Alsever:
Hòa tan 2,5 g Glucose, 8 g Acid Citric và 4,2 gam NaCl trong 1000 ml nước cất, hấp cao áp tuyệt trùng ở 121°C trong vòng 15 phút.
- Dung dịch tannin xử lý bề mặt hồng cầu:
Hòa tan 0,1 gam acid tanic vào 100 ml nước cất ta có dung dịch tannin 1/1000. Lấy 1 ml dung dịch này pha với 19 ml dung dịch sinh lý (NaCl) ta có dung dịch tannin 1/20.000, hấp cao áp 121 °C trong 15 phút.
2.3.3.2 Phương pháp chế kháng nguyên hồng cầu gắn virus
- Máu ngan nhổ lông vùng cổ và vô trùng vùng da nơi tĩnh mạch cần lấy máu, cắt da và tĩnh mạch bằng dao sắc và cho máu chảy trên thành bình vào bình chứa dung dịch Alserver, đến khi đạt tỷ lệ 1:1, lắc đều. Dung dịch Alsever vừa có tác dụng chống đông vừa có tác dung bảo dưỡng hồng cầu. Vì vậy, có thể bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ 4°C trong khoảng 1 tuần. Tuy nhiên nếu có dấu hiệu dung huyết thì không thể sử dụng vì hồng cầu mất tế bào chất (“ghost”) sẽ gây trở ngại cho quá trình sa lắng tự nhiên trong các phản ứng sau này. Rửa hồng cầu ba đợt bằng dung dịch PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm với tốc độ 1.800 vòng/phút trong vòng 5 phút, ở đợt rửa cuối cùng sau khi đã loại bỏ nước trong ở trên thì tiến hành cân và pha loãng hồng cầu với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 50%.
- Xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu (Lasota hóa) Kỹ thuật xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu được mô tả trước đây. Việc xử lý này làm mất thụ thể gây ngưng kết trực tiếp với virus, do trên bề mặt virus Lasota có protein bề mặt có hai chức năng gây ngưng kết hồng cầu và cắt đứt neuraminic acid bề mặt gây mất ngưng kết hồng cầu. Thông thường, phản ứng mất ngưng kết xuất hiện sau khoảng 2 giờ.
Hồng cầu sau khi đã được rửa ba đợt bằng PBS, cân trừ bì để tính khối lượng (ướt) và được pha loãng 1% (khối lượng/thể tích) và được dùng để kiểm tra hiệu giá dung dịch vaccine Lasota sử dụng để cắt thụ thể ngưng kết trên bề mặt hồng cầu. Quy trình kiểm tra hiệu giá bao gồm các bước pha vaccine thành dãy 50 µl pha loãng cấp số hai trong PBS trên khay 96 lỗ, thêm 50 µl huyền dịch hồng cầu 1%, để ở nhiệt độ phòng và xác định hiệu giá vaccine sau 15 - 60 phút khi đối chứng âm gồm hồng cầu và PBS chìm hẳn xuống đáy lỗ khay. Hiệu giá HA của virus Lasota được sử dụng để tính lượng vaccine cần thiết dùng làm
sạch thụ thể bề mặt toàn bộ khối lượng hồng cầu chuẩn bị xử lý thành hồng cầu - kháng nguyên.
Công thức tính lượng tối thiểu virus Lasota để gây ngưng kết và làm sạch thụ thể hồng cầu là V=T * (M/m)
Trong đó
T là hiệu giá (số thập phân có tử số = 1) của virus Lasota cần dùng. V là thể tích (tính bằng ml) dịch Lasota gốc cần dùng.
M là khối lượng hồng cầu cần xử lý (đo bằng gam).
m là khối lượng (gam) hồng cầu phản ứng trong mỗi lỗ khay
(bằng 0,05 x 0,01).
Do đó V=T*M*2*103 là công thức được sử dụng trong trường hợp trắc định cụ thể với 0, 05ml hồng cầu 1% nêu trên. Sử dụng liều gấp đôi lượng tối thiểu đó để xử lý lượng hồng cầu nguyên liệu. Hồng cầu ngan (huyễn dịch 20% trong PBS) được trộn với virus Lasota trong bình tam giác, khuấy từ tính và để ở nhiệt độ phòng 5 - 6 giờ hoặc qua đêm. Rửa hồng cầu bằng cách đổ bớt nước mặt, thêm nước sinh lý, san ra các ống nghiệm và quay ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ nước mặt, thêm nước sinh lý mới, khuấy đều và lặp lại việc rửa hồng cầu 2 - 3 đợt. Lấy một lượng nhỏ hồng cầu pha thành huyễn dịch 1% và thực hiện phản ứng ngưng kết với virus Lasota. Hồng cầu đạt tiêu chuẩn phải không có dấu hiệu dung huyết, chìm tự nhiên trong lỗ khay chứa nước sinh lý và không ngưng kết với virus Lasota.
- Xử lý hồng cầu bằng formalin làm ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% nói trên với một lượng tương đương dung dịch formalin 20 % pH 7,2 (pha formalin 40% vào dung dịch PBS pH 7,2 theo tỷ lệ 1:1) trong bình tam giác, đậy miệng bình và lắc đều thường xuyên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó rửa huyễn dịch hồng cầu 3 đợt trong PBS pH 7,2 hoặc nước sinh lý pH 7,2 rồi cân hồng cầu pha thành huyễn dịch hồng cầu 3% trong PBS pH 7,2.
- Tannin hóa hồng cầu Pha huyễn dịch hồng cầu 3% với một lượng tương đương dung dịch tannin 1:20.000 lắc nhẹ thường xuyên trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi rửa lại bằng dung dịch nước sinh lý pH 7,2 hai đợt, đợt thứ ba rửa bằng dung dịch PBS pH 6,4; cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thành huyễn dịch hồng cầu 50% trong PBS pH 6,4. Chú ý sau khi xử lý tannin cần
tránh cho hồng cầu tiếp xúc với dung dịch protein vì làm như vậy sẽ làm mất khả năng gắn kết hồng cầu với kháng nguyên qua cầu nối tannin.
- Xử lý hồng cầu bằng virus Virus hóa hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% đã được tannin hóa với một lượng tương đương virus Gumboro. Lượng kháng nguyên này nếu quá thấp sẽ không gây ngưng kết chắc chắn với kháng thể, ngược lại nếu quá cao thì một mặt giá thành cao và mặt khác độ nhạy của phản ứng bị giảm do cần lượng kháng thể lớn để có ngưng kết vững chắc. Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi xác định được tỷ lệ 1 gam
hồng cầu cần 3 ml Lasota hiệu giá 4log2 (1500 HA/g, mức che phủ 50%). Đậy
nắp bình và lắc trộn đều trên đá lạnh trong 2 giờ để kháng nguyên kết bám trên bề mặt hồng cầu đã tannin hóa. Sau đó rửa lại bằng PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm 3 đợt, cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thêm dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 1,5%. Như vậy, ta có kháng nguyên hồng cầu gắn virus hay kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên IHA). Kháng nguyên hồng cầu đạt tiêu chuẩn để làm phản ứng là hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết giả (hồng cầu không chìm xuống đáy lỗ khay sau 5 giờ) và có hiệu giá phản ứng từ 4log2 trở lên.
Lưu ý trong quá trình bảo quản kháng nguyên hồng cầu cần thêm một lượng formalin để đạt nồng độ formaldehyde 4/1000 để chống nhiễm khuẩn và nấm.
3.3.2.2 Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA)
Thực hiện với hồng cầu gắn kháng nguyên để phát hiện kháng thể của gà
được giết mổ lò mổ gia cầm ở hai huyện Phú Vang và Hương Thủy. Để phát hiện kháng thể, người ta gắn kháng nguyên lên nền mượn (hồng cầu ngan). Khi kháng nguyên gặp kháng thể đặc hiệu lúc này sẽ xuất hiện hiện tượng ngưng kết.
Các bước thực hiện IHA:
Phản ứng tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ đáy chữ U. Để xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virus Gumboro trong huyết thanh gà mỗi dãy 12 lỗ được sử dụng cho một phản ứng, thí nghiệm được lặp lại 3 đợt.
Đầu tiên cho vào tất cả các lỗ 50 µl dung dịch sinh lý NaCl (pH 7,2), sau đó cho vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh cần kiểm. Trộn đều bằng cách hút nhả 5 - 6 đợt rồi hút qua lỗ thứ hai, lại trộn đều rồi hút 50 µl sang lỗ thứ ba và tiếp tục thao tác cho đến lỗ thứ 10 thì hút bỏ 50 µl (vào dung dịch sát trùng). Thêm vào tất cả các lỗ 50 µl hồng cầu gắn kháng nguyên 1,5%. Huyễn dịch hồng cầu gắn kháng nguyên này được khuấy thường xuyên trên máy khuấy từ tính nhằm
tránh sự sa lắng hồng cầu để có huyễn dịch hồng cầu đồng nhất cho tất cả các lỗ khay thí nghiệm.
Đậy kín khay để tránh bị khô, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 - 4 giờ. Đọc kết quả dựa vào lỗ đối chứng (đối chứng âm và đối chứng dương) ở các lỗ thứ 11, 12.
- Đọc kết quả
+ Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống tâm đáy, hình thành chấm tròn. + Phản ứng dương tính: có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu chìm chậm với thời gian kéo dài thường trải đều trên đáy khay, tạo thành lớp nhăn nheo, tạo thành vòng có đường kính lớn hơn 3/4 đường kính lỗ khay.
3. 3. 2. 3 Phản ứng xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA)
Phản ứng SSIA (xê lệch ngưng kết hồng cầu gián tiếp chuẩn) một phương
pháp chỉ mới được áp dụng để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm gần đây (Phạm H C H C H C H C H C H C H C H C Hồng cầu gắn kháng nguyên Kháng thể (huyết thanh cần kiểm hoặc đối chứng dương) Kháng thể kết hợp kháng nguyên Bước 2: H C Hc C H c C C Hc Hồng cầu gắn kháng nguyên Hồng cầu Hồng cầu đã tanin hóa
Acid tanic Kháng nguyên
Bước 1:
Hồng Sơn, 2009) phản ứng SSIA được sử dụng xác định tỉ lệ và cường độ nhiễm của gà trong và ngoài lò mổ gia cầm ở hai huyên Phú Vang và huyện Hương Thủy.
Nguyên lý phản ứng nếu có sẵn kháng thể chuẩn (γ-globulin) kháng Gumboro, chúng ta có thể thiết lập phản ứng ngưng kết (gián tiếp) ổn định với kháng nguyên IHA. Khi đó nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus Gumboro rồi sau đó cho tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của kháng thể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với kháng nguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Như vậy, ta có thể sử dụng cặp kháng nguyên IHA và kháng thể chuẩn (γ-globulin kháng Gumboro) để phát hiện kháng nguyên virus Gumboro. Ngược lại, nếu trong bệnh phẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với kháng thể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Bệnh phẩm thích hợp được cho tiếp xúc với kháng thể chuẩn trước khi tiếp xúc với kháng nguyên IHA và phản ứng cho thể bị ngăn trở hoặc được tăng cường nếu trong dịch bệnh phẩm chứa, tương ứng, kháng nguyên hoặc kháng thể, hay có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn.
Các bước thực hiện SSIA:
Để tiến hành phản ứng trước tiên ta phải xác định hiệu giá kháng huyết thanh chuẩn.
Để tiến hành phản ứng SSIA, chúng tôi cần một lượng kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá không đổi để xử lý hết các mẫu. Máu sau khi lấy ở được lấy ở lò mổ về thì dùng pipet để hút phần kháng huyết thanh ở trên bề mặt vào các ống Eppendorf, sau đó cho các ống nghiệm vào trong tủ lạnh để trong vòng 5-7 giờ thì tận thu huyết thanh đợt nữa. Tiến hành dùng phản ứng IHA để kiểm tra hiệu giá của huyết thanh, với những huyết thanh đạt hiệu giá 4log2, 5log2, 6log2, 7log2, 8log2. thì được giữ lại và pha với nước sinh lý để dưa về hiệu giá chuẩn 4log2
Kháng huyết thanh sau khi đã được pha về hiệu giá chuẩn 4log2 sẽ được cho vào các ống Eppendorf và được bảo quản ở -200C.
- Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, đáy chữ U. Ta đặt khay nằm dọc, sẽ được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ sử dụng cho một phản ứng
với mẫu kiểm (bệnh phẩm) hoặc mẫu chuẩn. Trên mỗi khay 11 mẫu kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay.
Dãy lỗ cuối cùng mỗi khay được sử dụng làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp với kháng huyết thanh chuẩn, làm cơ sở xác định phản ứng âm tính của các mẫu kiểm.
Các dãy mẫu kiểm ta tiến hành các bước như sau:
Bước 1. Dùng pipet cho vào lỗ thứ 2 đến số 8 của mỗi dãy, mỗi lỗ 50 µl
nước sinh lý (để trống lỗ thứ nhất).
Bước 2. Cho vào lỗ thứ nhất của các dãy 50 µl dịch chiết mẫu bệnh phẩm
(phân), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy).
Bước 3. Hút 50 µl kháng huyết thanh chuẩn 5log2 cho vào lỗ thứ nhất của
mỗi dãy. Dùng pipet đó trộn và hút 50 µl chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ hai, rồi từ lỗ thứ hai sang lỗ thứ ba, và tiếp tục trộn-chuyển như vậy đến lỗ số 8 thì hút bỏ 50 µl (mỗi lỗ trộn 4 - 5 đợt).
Bước 4. Cho vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch hồng cầu gắn kháng
nguyên Gumboro.
Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) thường được thực hiện ở dãy cuối cùng của mỗi khay, gồm các bước như sau:
+ Cho vào tất cả các lỗ khay của dãy đầu tiên 50 µl nước sinh lý.
+ Nhỏ vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh gà chuẩn đã biết hiệu giá 4log2 nêu trên, hút trộn và chuyển 50 µl sang lỗ thứ 2, trộn và chuyển 50 µl sang lỗ thứ 3 và tiếp tục trộn chuyển như vậy cho đến hết dãy thì hút bỏ 50 µl.
+ Nhỏ vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch 1,5% hồng cầu gắn kháng
nguyên Gumboro.
Đậy nắp khay, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra kết quả khi phản ứng ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ.
Đọc kết quả
+ Phản ứng âm tính không có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng so với
dãy đối chứng (lỗ số 4 là lỗ cuối cùng có ngưng kết) theo thiết kế nhưng có thể có sự thay đổi thành 3log2 hoặc 5log2.
+ Phản ứng dương tính có sự xê lệch cuối lỗ ngưng kết cuối cùng sang trái (ngưng kết cuối cùng ở các lỗ 4, 3, 2 hoặc 1) so với dãy đối chứng.
3.3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 3.3.2.3.1. Hiệu giá trung bình nhân 3.3.2.3.1. Hiệu giá trung bình nhân
Giá trị này được tính theo công thức: GMT = (T1 × T2 × T3×... ×Tn)1/n
Trong đó: T (Titration): là hiệu giá các kháng nguyên hoặc kháng thể trong các mẫu phân hay các mẫu huyết thanh.
n là số mẫu.
GMT: là giá trị trung bình nhân, nên nó không phải là kỳ vọng toán của
đám đông số liệu. Khi tính GMT, để tránh kết quả bằng không do có ít nhất một mẫu âm tính, trước hết là vận dụng giá trị logarit hóa theo cơ số 2 như bội số pha loãng mẫu.
logGMT = log2GMT = (log2T1 + log2T2 + log2T3 +... + log2Tn)/n Từ đây, ta rút ra được giá trị GMT = 2logGMT .
3.3.2.3.2. Hàm phân bố chuẩn So sánh hai tỷ lệ ta dùng hàm phân bố χ2 χ2 thực nghiệm = 2 ( ) ( ) ( )( )( )( ) ad bc a b c d a b c d a c b d − + + + + + + + Trong đó:
a: số mẫu phân dương tính b: số mẫu dịch họng dương tính c: số mẫu phân âm tính
d: số mẫu dịch họng âm tính.
Sử dụng hàm phân bố χ2 để so sánh tỷ lệ. Nếu χ2 thực nghiệm > χ2 α = 0,05 thì tỉ lệ quan sát khác nhau và ngược lại.
Khoảng tin cậy của tỷ lệ được xác định theo bài giảng thống kê sinh vật học và phương pháp nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi [10].
3.3.2.3.3 Tỷ lệ bảo hộ
Đối với bệnh Newcastle, tỷ lệ gà có kháng thể bảo hộ phải đạt từ 70% trở lên. Tỷ lệ bảo hộ (%) = (Số mẫu đạt hiệu giá kháng thể bảo hộ/Số mẫu xét