2.11.1. Phòng bệnh
- Chủng ngừa vaccine
Vaccine vô hoạt có bổ trợ dầu dùng cho gà trưởng thành, gà bố mẹ, thường sau khi tiêm 7 ngày gà có miễn dịch và lượng kháng thể đạt cao nhất vào ngày thứ 21 đến 30, sau khi tiêm và miễn dịch này có thể truyền cho gà con sau khi nở.
Vaccine nhược độc dùng gây nhiễm cho gà con, gà mới nở bằng phương pháp nhỏ mắt, mũi, miệng hoặc cho uống vào lúc 7, 14, 21 ngày tuổi.
- Vệ sinh thú y:
Xử lý chuồng trại một cách thường xuyên và định kỳ trước và sau mỗi đợt xuất chuồng. Nếu chuồng nuôi đã xuất hiện bệnh thì phải xử lý mỗi tuần một đợt và có khoảng trống chuồng ít nhất 15 ngày. Có thể dùng thuốc sát trùng Chloramin T (Halamide) 0,2% hoặc Chloramin B 0,5%. Thuốc có dạng tinh bột kết tinh màu trắng, hòa tan trong nước, độc tính thấp, trong nước phân giải và giải phóng chlor hoạt tính, thuốc có tác dụng diệt khuẩn nấm siêu vi trùng mạnh, được dùng để tẩy uế chuồng trại, cống rãnh, kho tàng, thiết bị, phương tiện vận tải, nước uống, sát trùng tay. Hai loại thuốc sát trùng trên có tác dụng diệt virus này rất nhanh. Chỉ cần nồng độ 0,5% phun liên tục trong 10 phút là virus này bị tiêu diệt. Chọn mua gà giống ở những cơ sở phòng bệnh tốt, nên mua con giống ở những nơi sử dụng vaccine nhũ dầu cho đàn mẹ vì chúng được miễn dịch thụ động đến 21 ngày tuổi [18].
2.11.2. Điều trị bệnh
Khi đã phát hiện bệnh, ngoài việc dùng vaccine can thiệp, cần cung cấp đủ lượng nước (vì gà sốt cao, ỉa chảy nên mất nước) có thể cho thêm đường glucose, vitamin, kháng sinh vào nước uống để tăng sức đề kháng và phòng các bệnh thứ phát chứ không có thuốc đặc trị chống virus.
Dùng các thuốc bồi dưỡng, nâng cao thể trạng của gà tăng cường sức đề kháng chống lại các bệnh như Hanminvit - super, B - comlex, Multivit - fort, thuốc điện giải.
Anti-Gumboro pha 1 ml thuốc với 0, 5 ml nước, pha 28 g bột điện giải với 2 - 3 lít nước, cho gà uống liên tục 3 - 5 ngày.
- Vime C Electrolyte 1 g pha cho 1 lít nước dùng liên tục 3 - 5 ngày. - Vimeperos 5 g cho 1000 gà con, 500 gà giò, 200 gà đẻ.
- Vimix Plus 1 g pha cho 1 lít nước dùng liên tục 3 - 5 ngày. - Vimevit Electrolyte Gói 100 g pha cho 200 lít nước uống. - Aminovit Gói 100 g pha cho 500 lít nước uống.
- Vitaral 1 ml pha cho 1 lít nước dùng liên tục 3 - 5 ngày [35].
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Gà được giết mổ tại lò mổ gia cầm Thủy Dương huyện Hương Thủy. - Gà nuôi trên địa bàn huyện Hương Thủy liền kề lò mổ Thủy Dương (bán kính 3km).
- Gà nuôi trên địa bàn huyện Hương Thủy cách xa lò mổ Thủy Dương (ngoài bán kính 3km).
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ 05/01/2012 đến 05/05/2012.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thí nghiệm phòng thí nghiệm vi sinh vật học, bộ môn Kí sinh -Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Huế.
- Địa điểm lấy mẫu lò mổ Xuân Phú, huyện Phú Vang và lò mổ Thủy Dương, huyện Hương Thủy tỉnh Thừa Thiên Huế và các hộ gia đình xung quanh lò mổ trên.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định hiệu giá kháng thể của gà được giết mổ tại lò mổ gia cầm Thủy Dương huyện Hương Thủy (sử dụng IHA).
- Xác định tỉ lệ và cường độ nhiễm của gà trong và ngoài lò mổ gia cầm Thủy Dương huyện Hương Thủy (sử dụng SSIA).
- So sánh và đánh giá ảnh hưởng của các lò mổ gia cầm đến tình hình nhiễm bệnh Gumboro ở khu vực trong, liền kề và ở xa lò mổ.
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các loại hóa chất NaCl (sodium chloride), C72H52O46 (acid tannic), C6H8O7 (acid citric), HCHO (formalin 20%), C6H12O6 (glucose), cồn….
- Các loại dung dịch Alsever, PBS pH 7, 2, sinh lý pH 7, 2, nước cất … - Dụng cụ lấy mẫu bao polyethylene, tăm bông, dây cao su, bình giữ nhiệt, dây nilon…
- Các dụng cụ cần thiết cho phản ứng như Ống Eppendorf, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, đèn cồn, khay nhựa vi chuẩn độ (microtitration plate) 96 lỗ đáy U, pipet Eppendorf các cỡ.
- Các thiết bị tủ đông, tủ sấy, máy lắc, máy khuấy từ, máy hấp cao áp, máy li tâm, tủ lạnh, buồng cấy, cân điện tử...
- Vaccine Lasota để xử lý bề mặt hồng cầu và vaccine Gumboro để virus
hóa hồng cầu.
- Ngan có khối lượng khoảng 2,5 - 3 kg/con để lấy hồng cầu dùng chế
kháng nguyên hồng cầu gắn virus Gumboro.
- Mẫu phân và mẫu máu gà được lấy từ lò mổ và các hộ nuôi gà xung quanh
+ Mẫu phân Mẫu phân được lấy tại lò mổ gia cầm Thủy Dương, mỗi con
lấy một đoạn trực tràng có chứa phân khoảng 3 - 5 cm cho vào túi polyethylene, ghi nhãn. Mẫu phân được lấy từ địa bàn xung quanh hai lò mổ trên được lấy từ trực tiếp từ hậu môn hoặc mẫu phân tươi. Sử dụng tăm bông và túi polyethylene để hứng,trích mẫu cột lại và ghi nhãn.
+ Mẫu máu chỉ lấy ở lò mổ, dùng ống nghiệm vô trùng lấy máu từ tĩnh
mạch cổ, mỗi ống nghiệm lấy 3 - 5 ml để nghiêng cho đến khi máu đông lại rồi bỏ vào thùng xốp bảo quản mang về phòng thí nghiệm. Dùng pipet hút và tận thu huyết thanh vào Eppendorf. Sau đó dùng phản ứng IHA để kiểm tra hiệu giá và tiến hành pha các mẫu có hiệu giá kháng thể cao với nước sinh lý để có huyết thanh chuẩn hiệu giá 4log2.
- Mẫu sau khi xử lý xong đem bảo quản lạnh -20 °C cho đến khi tiến hành
làm phản ứng.
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu3.3.2.1. Phương pháp pha hóa chất 3.3.2.1. Phương pháp pha hóa chất
- Dung dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS) 0,15M, pH 7,2 và pH 6,4
Hòa tan 11,87 gam Na2HPO4. 2H2O (hoặc 9,47 gam Na2PO4) vào trong 1000 ml
nước cất. Bên cạnh đó, hòa tan 9,08 gam KH2PO4 vào trong 1000 ml nước cất.
Sau đó, lấy 720 ml dung dịch Na2HPO4 hòa tan với 280 ml dung dịch KH2PO4 ta thu được dung dịch A. Lấy 300 ml dung dịch A hòa với 700 ml dung dịch sinh lý ta có dung dịch PBS pH 7,2. Hấp cao áp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Nếu pha 150 ml dung dịch Na2HPO4 với 150 ml dung dịch KH2PO4 rồi pha 300 ml dung dịch này với 700 ml dung dịch sinh lý muối ta có dung dịch PBS, pH 6,4. Hấp cao áp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 phút.
- Dung dịch sinh lý 0,85% có pH 7,2 Hòa tan 8, 5 g NaCl vào trong 1000
- Dung dịch Alsever:
Hòa tan 2,5 g Glucose, 8 g Acid Citric và 4,2 gam NaCl trong 1000 ml nước cất, hấp cao áp tuyệt trùng ở 121°C trong vòng 15 phút.
- Dung dịch tannin xử lý bề mặt hồng cầu:
Hòa tan 0,1 gam acid tanic vào 100 ml nước cất ta có dung dịch tannin 1/1000. Lấy 1 ml dung dịch này pha với 19 ml dung dịch sinh lý (NaCl) ta có dung dịch tannin 1/20.000, hấp cao áp 121 °C trong 15 phút.
2.3.3.2 Phương pháp chế kháng nguyên hồng cầu gắn virus
- Máu ngan nhổ lông vùng cổ và vô trùng vùng da nơi tĩnh mạch cần lấy máu, cắt da và tĩnh mạch bằng dao sắc và cho máu chảy trên thành bình vào bình chứa dung dịch Alserver, đến khi đạt tỷ lệ 1:1, lắc đều. Dung dịch Alsever vừa có tác dụng chống đông vừa có tác dung bảo dưỡng hồng cầu. Vì vậy, có thể bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ 4°C trong khoảng 1 tuần. Tuy nhiên nếu có dấu hiệu dung huyết thì không thể sử dụng vì hồng cầu mất tế bào chất (“ghost”) sẽ gây trở ngại cho quá trình sa lắng tự nhiên trong các phản ứng sau này. Rửa hồng cầu ba đợt bằng dung dịch PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm với tốc độ 1.800 vòng/phút trong vòng 5 phút, ở đợt rửa cuối cùng sau khi đã loại bỏ nước trong ở trên thì tiến hành cân và pha loãng hồng cầu với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 50%.
- Xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu (Lasota hóa) Kỹ thuật xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu được mô tả trước đây. Việc xử lý này làm mất thụ thể gây ngưng kết trực tiếp với virus, do trên bề mặt virus Lasota có protein bề mặt có hai chức năng gây ngưng kết hồng cầu và cắt đứt neuraminic acid bề mặt gây mất ngưng kết hồng cầu. Thông thường, phản ứng mất ngưng kết xuất hiện sau khoảng 2 giờ.
Hồng cầu sau khi đã được rửa ba đợt bằng PBS, cân trừ bì để tính khối lượng (ướt) và được pha loãng 1% (khối lượng/thể tích) và được dùng để kiểm tra hiệu giá dung dịch vaccine Lasota sử dụng để cắt thụ thể ngưng kết trên bề mặt hồng cầu. Quy trình kiểm tra hiệu giá bao gồm các bước pha vaccine thành dãy 50 µl pha loãng cấp số hai trong PBS trên khay 96 lỗ, thêm 50 µl huyền dịch hồng cầu 1%, để ở nhiệt độ phòng và xác định hiệu giá vaccine sau 15 - 60 phút khi đối chứng âm gồm hồng cầu và PBS chìm hẳn xuống đáy lỗ khay. Hiệu giá HA của virus Lasota được sử dụng để tính lượng vaccine cần thiết dùng làm
sạch thụ thể bề mặt toàn bộ khối lượng hồng cầu chuẩn bị xử lý thành hồng cầu - kháng nguyên.
Công thức tính lượng tối thiểu virus Lasota để gây ngưng kết và làm sạch thụ thể hồng cầu là V=T * (M/m)
Trong đó
T là hiệu giá (số thập phân có tử số = 1) của virus Lasota cần dùng. V là thể tích (tính bằng ml) dịch Lasota gốc cần dùng.
M là khối lượng hồng cầu cần xử lý (đo bằng gam).
m là khối lượng (gam) hồng cầu phản ứng trong mỗi lỗ khay
(bằng 0,05 x 0,01).
Do đó V=T*M*2*103 là công thức được sử dụng trong trường hợp trắc định cụ thể với 0, 05ml hồng cầu 1% nêu trên. Sử dụng liều gấp đôi lượng tối thiểu đó để xử lý lượng hồng cầu nguyên liệu. Hồng cầu ngan (huyễn dịch 20% trong PBS) được trộn với virus Lasota trong bình tam giác, khuấy từ tính và để ở nhiệt độ phòng 5 - 6 giờ hoặc qua đêm. Rửa hồng cầu bằng cách đổ bớt nước mặt, thêm nước sinh lý, san ra các ống nghiệm và quay ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ nước mặt, thêm nước sinh lý mới, khuấy đều và lặp lại việc rửa hồng cầu 2 - 3 đợt. Lấy một lượng nhỏ hồng cầu pha thành huyễn dịch 1% và thực hiện phản ứng ngưng kết với virus Lasota. Hồng cầu đạt tiêu chuẩn phải không có dấu hiệu dung huyết, chìm tự nhiên trong lỗ khay chứa nước sinh lý và không ngưng kết với virus Lasota.
- Xử lý hồng cầu bằng formalin làm ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% nói trên với một lượng tương đương dung dịch formalin 20 % pH 7,2 (pha formalin 40% vào dung dịch PBS pH 7,2 theo tỷ lệ 1:1) trong bình tam giác, đậy miệng bình và lắc đều thường xuyên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó rửa huyễn dịch hồng cầu 3 đợt trong PBS pH 7,2 hoặc nước sinh lý pH 7,2 rồi cân hồng cầu pha thành huyễn dịch hồng cầu 3% trong PBS pH 7,2.
- Tannin hóa hồng cầu Pha huyễn dịch hồng cầu 3% với một lượng tương đương dung dịch tannin 1:20.000 lắc nhẹ thường xuyên trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi rửa lại bằng dung dịch nước sinh lý pH 7,2 hai đợt, đợt thứ ba rửa bằng dung dịch PBS pH 6,4; cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thành huyễn dịch hồng cầu 50% trong PBS pH 6,4. Chú ý sau khi xử lý tannin cần
tránh cho hồng cầu tiếp xúc với dung dịch protein vì làm như vậy sẽ làm mất khả năng gắn kết hồng cầu với kháng nguyên qua cầu nối tannin.
- Xử lý hồng cầu bằng virus Virus hóa hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% đã được tannin hóa với một lượng tương đương virus Gumboro. Lượng kháng nguyên này nếu quá thấp sẽ không gây ngưng kết chắc chắn với kháng thể, ngược lại nếu quá cao thì một mặt giá thành cao và mặt khác độ nhạy của phản ứng bị giảm do cần lượng kháng thể lớn để có ngưng kết vững chắc. Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi xác định được tỷ lệ 1 gam
hồng cầu cần 3 ml Lasota hiệu giá 4log2 (1500 HA/g, mức che phủ 50%). Đậy
nắp bình và lắc trộn đều trên đá lạnh trong 2 giờ để kháng nguyên kết bám trên bề mặt hồng cầu đã tannin hóa. Sau đó rửa lại bằng PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm 3 đợt, cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thêm dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 1,5%. Như vậy, ta có kháng nguyên hồng cầu gắn virus hay kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên IHA). Kháng nguyên hồng cầu đạt tiêu chuẩn để làm phản ứng là hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết giả (hồng cầu không chìm xuống đáy lỗ khay sau 5 giờ) và có hiệu giá phản ứng từ 4log2 trở lên.
Lưu ý trong quá trình bảo quản kháng nguyên hồng cầu cần thêm một lượng formalin để đạt nồng độ formaldehyde 4/1000 để chống nhiễm khuẩn và nấm.
3.3.2.2 Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA)
Thực hiện với hồng cầu gắn kháng nguyên để phát hiện kháng thể của gà
được giết mổ lò mổ gia cầm ở hai huyện Phú Vang và Hương Thủy. Để phát hiện kháng thể, người ta gắn kháng nguyên lên nền mượn (hồng cầu ngan). Khi kháng nguyên gặp kháng thể đặc hiệu lúc này sẽ xuất hiện hiện tượng ngưng kết.
Các bước thực hiện IHA:
Phản ứng tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ đáy chữ U. Để xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virus Gumboro trong huyết thanh gà mỗi dãy 12 lỗ được sử dụng cho một phản ứng, thí nghiệm được lặp lại 3 đợt.
Đầu tiên cho vào tất cả các lỗ 50 µl dung dịch sinh lý NaCl (pH 7,2), sau đó cho vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh cần kiểm. Trộn đều bằng cách hút nhả 5 - 6 đợt rồi hút qua lỗ thứ hai, lại trộn đều rồi hút 50 µl sang lỗ thứ ba và tiếp tục thao tác cho đến lỗ thứ 10 thì hút bỏ 50 µl (vào dung dịch sát trùng). Thêm vào tất cả các lỗ 50 µl hồng cầu gắn kháng nguyên 1,5%. Huyễn dịch hồng cầu gắn kháng nguyên này được khuấy thường xuyên trên máy khuấy từ tính nhằm
tránh sự sa lắng hồng cầu để có huyễn dịch hồng cầu đồng nhất cho tất cả các lỗ khay thí nghiệm.
Đậy kín khay để tránh bị khô, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 - 4 giờ. Đọc kết quả dựa vào lỗ đối chứng (đối chứng âm và đối chứng dương) ở các lỗ thứ 11, 12.
- Đọc kết quả
+ Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống tâm đáy, hình thành chấm tròn. + Phản ứng dương tính: có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu chìm chậm với thời gian kéo dài thường trải đều trên đáy khay, tạo thành lớp nhăn nheo, tạo thành vòng có đường kính lớn hơn 3/4 đường kính lỗ khay.
3. 3. 2. 3 Phản ứng xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA)
Phản ứng SSIA (xê lệch ngưng kết hồng cầu gián tiếp chuẩn) một phương
pháp chỉ mới được áp dụng để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm gần đây (Phạm H C H C H C H C H C H C H C H C Hồng cầu gắn kháng nguyên Kháng thể (huyết thanh cần kiểm hoặc đối chứng dương) Kháng thể kết hợp kháng nguyên Bước 2: H C Hc C H c C C Hc Hồng cầu gắn kháng nguyên Hồng cầu Hồng cầu đã tanin hóa
Acid tanic Kháng nguyên
Bước 1:
Hồng Sơn, 2009) phản ứng SSIA được sử dụng xác định tỉ lệ và cường độ nhiễm