- Máu ngan nhổ lông vùng cổ và vô trùng vùng da nơi tĩnh mạch cần lấy máu, cắt da và tĩnh mạch bằng dao sắc và cho máu chảy trên thành bình vào bình chứa dung dịch Alserver, đến khi đạt tỷ lệ 1:1, lắc đều. Dung dịch Alsever vừa có tác dụng chống đông vừa có tác dung bảo dưỡng hồng cầu. Vì vậy, có thể bảo quản hồng cầu ở nhiệt độ 4°C trong khoảng 1 tuần. Tuy nhiên nếu có dấu hiệu dung huyết thì không thể sử dụng vì hồng cầu mất tế bào chất (“ghost”) sẽ gây trở ngại cho quá trình sa lắng tự nhiên trong các phản ứng sau này. Rửa hồng cầu ba đợt bằng dung dịch PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm với tốc độ 1.800 vòng/phút trong vòng 5 phút, ở đợt rửa cuối cùng sau khi đã loại bỏ nước trong ở trên thì tiến hành cân và pha loãng hồng cầu với dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 50%.
- Xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu (Lasota hóa) Kỹ thuật xử lý loại bỏ thụ thể bề mặt hồng cầu được mô tả trước đây. Việc xử lý này làm mất thụ thể gây ngưng kết trực tiếp với virus, do trên bề mặt virus Lasota có protein bề mặt có hai chức năng gây ngưng kết hồng cầu và cắt đứt neuraminic acid bề mặt gây mất ngưng kết hồng cầu. Thông thường, phản ứng mất ngưng kết xuất hiện sau khoảng 2 giờ.
Hồng cầu sau khi đã được rửa ba đợt bằng PBS, cân trừ bì để tính khối lượng (ướt) và được pha loãng 1% (khối lượng/thể tích) và được dùng để kiểm tra hiệu giá dung dịch vaccine Lasota sử dụng để cắt thụ thể ngưng kết trên bề mặt hồng cầu. Quy trình kiểm tra hiệu giá bao gồm các bước pha vaccine thành dãy 50 µl pha loãng cấp số hai trong PBS trên khay 96 lỗ, thêm 50 µl huyền dịch hồng cầu 1%, để ở nhiệt độ phòng và xác định hiệu giá vaccine sau 15 - 60 phút khi đối chứng âm gồm hồng cầu và PBS chìm hẳn xuống đáy lỗ khay. Hiệu giá HA của virus Lasota được sử dụng để tính lượng vaccine cần thiết dùng làm
sạch thụ thể bề mặt toàn bộ khối lượng hồng cầu chuẩn bị xử lý thành hồng cầu - kháng nguyên.
Công thức tính lượng tối thiểu virus Lasota để gây ngưng kết và làm sạch thụ thể hồng cầu là V=T * (M/m)
Trong đó
T là hiệu giá (số thập phân có tử số = 1) của virus Lasota cần dùng. V là thể tích (tính bằng ml) dịch Lasota gốc cần dùng.
M là khối lượng hồng cầu cần xử lý (đo bằng gam).
m là khối lượng (gam) hồng cầu phản ứng trong mỗi lỗ khay
(bằng 0,05 x 0,01).
Do đó V=T*M*2*103 là công thức được sử dụng trong trường hợp trắc định cụ thể với 0, 05ml hồng cầu 1% nêu trên. Sử dụng liều gấp đôi lượng tối thiểu đó để xử lý lượng hồng cầu nguyên liệu. Hồng cầu ngan (huyễn dịch 20% trong PBS) được trộn với virus Lasota trong bình tam giác, khuấy từ tính và để ở nhiệt độ phòng 5 - 6 giờ hoặc qua đêm. Rửa hồng cầu bằng cách đổ bớt nước mặt, thêm nước sinh lý, san ra các ống nghiệm và quay ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ nước mặt, thêm nước sinh lý mới, khuấy đều và lặp lại việc rửa hồng cầu 2 - 3 đợt. Lấy một lượng nhỏ hồng cầu pha thành huyễn dịch 1% và thực hiện phản ứng ngưng kết với virus Lasota. Hồng cầu đạt tiêu chuẩn phải không có dấu hiệu dung huyết, chìm tự nhiên trong lỗ khay chứa nước sinh lý và không ngưng kết với virus Lasota.
- Xử lý hồng cầu bằng formalin làm ổn định bề mặt hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% nói trên với một lượng tương đương dung dịch formalin 20 % pH 7,2 (pha formalin 40% vào dung dịch PBS pH 7,2 theo tỷ lệ 1:1) trong bình tam giác, đậy miệng bình và lắc đều thường xuyên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó rửa huyễn dịch hồng cầu 3 đợt trong PBS pH 7,2 hoặc nước sinh lý pH 7,2 rồi cân hồng cầu pha thành huyễn dịch hồng cầu 3% trong PBS pH 7,2.
- Tannin hóa hồng cầu Pha huyễn dịch hồng cầu 3% với một lượng tương đương dung dịch tannin 1:20.000 lắc nhẹ thường xuyên trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi rửa lại bằng dung dịch nước sinh lý pH 7,2 hai đợt, đợt thứ ba rửa bằng dung dịch PBS pH 6,4; cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thành huyễn dịch hồng cầu 50% trong PBS pH 6,4. Chú ý sau khi xử lý tannin cần
tránh cho hồng cầu tiếp xúc với dung dịch protein vì làm như vậy sẽ làm mất khả năng gắn kết hồng cầu với kháng nguyên qua cầu nối tannin.
- Xử lý hồng cầu bằng virus Virus hóa hồng cầu bằng cách trộn huyễn dịch hồng cầu 50% đã được tannin hóa với một lượng tương đương virus Gumboro. Lượng kháng nguyên này nếu quá thấp sẽ không gây ngưng kết chắc chắn với kháng thể, ngược lại nếu quá cao thì một mặt giá thành cao và mặt khác độ nhạy của phản ứng bị giảm do cần lượng kháng thể lớn để có ngưng kết vững chắc. Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi xác định được tỷ lệ 1 gam
hồng cầu cần 3 ml Lasota hiệu giá 4log2 (1500 HA/g, mức che phủ 50%). Đậy
nắp bình và lắc trộn đều trên đá lạnh trong 2 giờ để kháng nguyên kết bám trên bề mặt hồng cầu đã tannin hóa. Sau đó rửa lại bằng PBS pH 7,2 kết hợp quay ly tâm 3 đợt, cân xác định khối lượng hồng cầu rồi pha thêm dung dịch PBS pH 7,2 để có huyễn dịch hồng cầu 1,5%. Như vậy, ta có kháng nguyên hồng cầu gắn virus hay kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián tiếp (kháng nguyên IHA). Kháng nguyên hồng cầu đạt tiêu chuẩn để làm phản ứng là hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết giả (hồng cầu không chìm xuống đáy lỗ khay sau 5 giờ) và có hiệu giá phản ứng từ 4log2 trở lên.
Lưu ý trong quá trình bảo quản kháng nguyên hồng cầu cần thêm một lượng formalin để đạt nồng độ formaldehyde 4/1000 để chống nhiễm khuẩn và nấm.