Phản ứng SSIA (xê lệch ngưng kết hồng cầu gián tiếp chuẩn) một phương
pháp chỉ mới được áp dụng để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm gần đây (Phạm H C H C H C H C H C H C H C H C Hồng cầu gắn kháng nguyên Kháng thể (huyết thanh cần kiểm hoặc đối chứng dương) Kháng thể kết hợp kháng nguyên Bước 2: H C Hc C H c C C Hc Hồng cầu gắn kháng nguyên Hồng cầu Hồng cầu đã tanin hóa
Acid tanic Kháng nguyên
Bước 1:
Hồng Sơn, 2009) phản ứng SSIA được sử dụng xác định tỉ lệ và cường độ nhiễm của gà trong và ngoài lò mổ gia cầm ở hai huyên Phú Vang và huyện Hương Thủy.
Nguyên lý phản ứng nếu có sẵn kháng thể chuẩn (γ-globulin) kháng Gumboro, chúng ta có thể thiết lập phản ứng ngưng kết (gián tiếp) ổn định với kháng nguyên IHA. Khi đó nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus Gumboro rồi sau đó cho tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của kháng thể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với kháng nguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Như vậy, ta có thể sử dụng cặp kháng nguyên IHA và kháng thể chuẩn (γ-globulin kháng Gumboro) để phát hiện kháng nguyên virus Gumboro. Ngược lại, nếu trong bệnh phẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với kháng thể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Bệnh phẩm thích hợp được cho tiếp xúc với kháng thể chuẩn trước khi tiếp xúc với kháng nguyên IHA và phản ứng cho thể bị ngăn trở hoặc được tăng cường nếu trong dịch bệnh phẩm chứa, tương ứng, kháng nguyên hoặc kháng thể, hay có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn.
Các bước thực hiện SSIA:
Để tiến hành phản ứng trước tiên ta phải xác định hiệu giá kháng huyết thanh chuẩn.
Để tiến hành phản ứng SSIA, chúng tôi cần một lượng kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá không đổi để xử lý hết các mẫu. Máu sau khi lấy ở được lấy ở lò mổ về thì dùng pipet để hút phần kháng huyết thanh ở trên bề mặt vào các ống Eppendorf, sau đó cho các ống nghiệm vào trong tủ lạnh để trong vòng 5-7 giờ thì tận thu huyết thanh đợt nữa. Tiến hành dùng phản ứng IHA để kiểm tra hiệu giá của huyết thanh, với những huyết thanh đạt hiệu giá 4log2, 5log2, 6log2, 7log2, 8log2. thì được giữ lại và pha với nước sinh lý để dưa về hiệu giá chuẩn 4log2
Kháng huyết thanh sau khi đã được pha về hiệu giá chuẩn 4log2 sẽ được cho vào các ống Eppendorf và được bảo quản ở -200C.
- Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, đáy chữ U. Ta đặt khay nằm dọc, sẽ được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ sử dụng cho một phản ứng
với mẫu kiểm (bệnh phẩm) hoặc mẫu chuẩn. Trên mỗi khay 11 mẫu kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay.
Dãy lỗ cuối cùng mỗi khay được sử dụng làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp với kháng huyết thanh chuẩn, làm cơ sở xác định phản ứng âm tính của các mẫu kiểm.
Các dãy mẫu kiểm ta tiến hành các bước như sau:
Bước 1. Dùng pipet cho vào lỗ thứ 2 đến số 8 của mỗi dãy, mỗi lỗ 50 µl
nước sinh lý (để trống lỗ thứ nhất).
Bước 2. Cho vào lỗ thứ nhất của các dãy 50 µl dịch chiết mẫu bệnh phẩm
(phân), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy).
Bước 3. Hút 50 µl kháng huyết thanh chuẩn 5log2 cho vào lỗ thứ nhất của
mỗi dãy. Dùng pipet đó trộn và hút 50 µl chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ hai, rồi từ lỗ thứ hai sang lỗ thứ ba, và tiếp tục trộn-chuyển như vậy đến lỗ số 8 thì hút bỏ 50 µl (mỗi lỗ trộn 4 - 5 đợt).
Bước 4. Cho vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch hồng cầu gắn kháng
nguyên Gumboro.
Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) thường được thực hiện ở dãy cuối cùng của mỗi khay, gồm các bước như sau:
+ Cho vào tất cả các lỗ khay của dãy đầu tiên 50 µl nước sinh lý.
+ Nhỏ vào lỗ thứ nhất 50 µl huyết thanh gà chuẩn đã biết hiệu giá 4log2 nêu trên, hút trộn và chuyển 50 µl sang lỗ thứ 2, trộn và chuyển 50 µl sang lỗ thứ 3 và tiếp tục trộn chuyển như vậy cho đến hết dãy thì hút bỏ 50 µl.
+ Nhỏ vào tất cả các lỗ 50 µl huyền dịch 1,5% hồng cầu gắn kháng
nguyên Gumboro.
Đậy nắp khay, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra kết quả khi phản ứng ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ.
Đọc kết quả
+ Phản ứng âm tính không có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng so với
dãy đối chứng (lỗ số 4 là lỗ cuối cùng có ngưng kết) theo thiết kế nhưng có thể có sự thay đổi thành 3log2 hoặc 5log2.
+ Phản ứng dương tính có sự xê lệch cuối lỗ ngưng kết cuối cùng sang trái (ngưng kết cuối cùng ở các lỗ 4, 3, 2 hoặc 1) so với dãy đối chứng.