nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm (chitala chitala)

Tóm tắt Đề tài nhằm tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của ba loại thảo dược Diệp hạ châu, cỏ mực và lá ổi nhằm đánh giá khả năng dùng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM MINH KHÁ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG

BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM MINH KHÁ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG

BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN

Lời cảm tạ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Bộ môn Bệnh Học Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài

Cảm ơn cha mẹ, gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập

Cảm ơn anh Nguyễn Bảo Trung, Chị Trần Thị Mỹ Hân, bạn Nguyễn Minh Thuật lớp NTTS TT- K35 và tập thể lớp Bệnh học thủy sản K36 đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và chia sẻ với tôi trong suốt quá trình học tâp cũng như trong thời gian tôi thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn!

Phạm Minh Khá

Tóm tắt

Đề tài nhằm tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của ba loại thảo dược (Diệp hạ châu, cỏ mực và lá ổi) nhằm đánh giá khả năng dùng thảo dược phòng trị bệnh

do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá

Xác định tính kháng khuẩn của thảo dược với vi khuẩn A hydrophila được

thực hiện với 3 loại dược (Cỏ mực, diệp hạ châu, lá ổi) và pha loãng ở 3 nồng

độ khác nhau 25, 50 và 100% Thí nghiệm được thực hiện bằng hai phương pháp là khuếch tán và đục lỗ trên đĩa thạch, trong đó chỉ có phương pháp đục

lỗ trên đĩa thạch cho được kết quả tốt với diệp hạ châu có vòng kháng khuẩn mạnh nhất là 15mm ở nồng độ 50 và 100%, thấp nhất là lá ổi không có vòng kháng khuẩn

Cá thát lát còm giống khỏe sau khi được thuần trong bể thì tiến hành bố trí thí nghiệm, bao gồm 6 nghiệm thức có bổ sung thảo dược (Cỏ mực 3ml, 6ml; diệp hạ châu 3ml, 6ml; lá ổi 3ml, 6ml) và một nghiệm thức đối chứng (Không thảo dược) Trong thí nghiệm này tiến hành thu mẫu 2 đợt để phân tích các chỉ tiêu huyết học là sau 3 tuần bổ sung thảo dược và sau khi cảm nhiễm Kết quả

ở các nghiệm thức bổ sung thảo dược thì tế bào hồng cầu tăng sau 3 tuần và giảm sau khi cảm nhiễm, tổng tế bào bạch cầu và bạch cầu đơn nhân thì tất cả đều tăng trước và sau khi cảm nhiễm Bên cạnh đó, tỉ lệ chết đối với cá có bổ sung thảo dược có số cá chết thấp hơn nghiệm thức không bổ sung thảo dược, thấp nhất là ở nghiệm thức cỏ mực 15% so với cá không có bổ sung thảo dược

là 65%

Mục lục

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách bảng và hình v

Danh mục từ viết tắt vi

CHƯƠNG I.ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương II.LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm 3

2.1.1 Đặc điểm phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản 3

2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm 4

2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 5

2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng 6

2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) 6

2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba) 7

2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava) 8

2.4.4 Chiết xuất thảo dược 9

2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược 9

2.5 Các chỉ tiêu huyết học 12

2.5.1 Hồng cầu 12

2.5.2 Bạch cầu 13

2.5.3 Các nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học 14

Chương III.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.1.1 Thời gian 16

3.1.2 Địa điểm thực hiện 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 17

3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá 17

3.3.3 Định danh vi khuẩn 17

3.3.4 Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 17

3.3.5 Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm 18

3.3.5 Định lượng và định tính hồng cầu và bạch cầu 20

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương IVKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23

4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu huyết học của cá thát lát còm 24

4.2.1 Hồng cầu 25

4.2.2 Bạch cầu 26

4.3 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila 29

4.4 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu

huyết học của cá thát lát còm cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila 30

4.4.1 Hồng cầu 30

4.4.2 Bạch cầu 31

4.5 Kết quả tái định danh vi khuẩn 32

Chương V.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề xuất 34

Tài liệu tham khảo 35

Phần phụ lục 39

Phụ lục 1 39

Phụ lục 2 43

Phụ lục 3 45

Phụ lục 4 46

Phụ lục 5 47

Phụ lục 6 48

Phụ luc 7 50

Phụ lục 8 52

Phụ luc 9 54

Danh sách bảng và hình

Hình 2.1: Cá thát lát cườm……….………… 3

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila……….… 5

Hình 2.2 Aeromonas hydrophila……….……… 5

Hình 2.3 Diệp hạ châu……… …………6

Hình 2.4 Cỏ mực……… … 7

Hình 2.5 Lá ổi……… …8

Hình 3.1 A Bố trí thí nghiệm cho ăn; B Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm……….… 20

Hình 3.2 Thao tác lấy mẩu máu và trải mẫu……… 21

Hình 3.3 Buồng đếm hồng cầu……… 22

Hình 4.1 (A)Vi khuẩn Aeromonas hydrophila, (B) nhuộm Gram vi khuẩn ……… 23

Hình 4.2 Kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila……… …23

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A) diệp hạ châu, (B) cỏ mực ……… ….24

Hình 4.4 Hồng cầu trên cá thát lát còm (100X)……… 25

Hình 4.5 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược……….……… 26

Hình 4.6 Các loại bạch cầu trên cá thát lát còm (100X)……….27

Hình 4.7 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược……….……… 27

Hình 4.8 Bạch cầu đơn nhân (100X)……… 28

Hình 4.9 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược……….……… …28

Hình 4.10 Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo giờ cảm nhiễm……… 29

Hình 4.11 Sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila .31

Hình 4.12 Sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila……… ………32

Hình 4.13 Sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila……… ……… 32

Hình 4.14 Cá thát lát còm có dấu hiệu xuất huyết……… ………33

Hình 4.15 (A) Nhuộm Gram vi khuẩn A.hydrophila, (B) test chỉ tiêu O/F của vi khuẩn A.hydrophila……… …… 34

BHI-B Brain heart infusion broth

CHƯƠNG I

ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Việt Nam là nước có nền kinh tế nông nghiệp pháp triển lâu đời Bên cạnh

ngành nông nghiệp lúa nước thì thủy sản cũng góp phần đáng kể trong phát

triển kinh tế với kinh ngạch xuất khẩu đạt 6,13 tỷ USD (Vasep, 2012) Trong

đó, nghề nuôi cá thát lát còm cũng đã giúp nhiều cho sự phát triển của ngành

nuôi thủy sản Theo số liệu thống kê diện tích nuôi cá thát lát ở Hậu Giang

hiện đang tăng dần theo từng năm Điển hình là ở huyện Phụng Hiệp (2011)

toàn huyện có khoảng 1,3 ha thì đến năm 2013 toàn huyện đã có khoảng 10

ha

Phong trào nuôi cá thát lát còm phát triển trên nhiều tỉnh thành ở ĐBSCL như:

Hậu Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An,…nhưng khu vực phân bố tự

nhiên cá thát lát còm nhiều hơn có lẽ là vùng thuộc tỉnh Hậu Giang hiện nay

Ngoài giá trị làm thực phẩm, cá thát lát còm còn được nuôi để làm cá cảnh

Tình hình nuôi ngày càng phát triển đòi hỏi chúng ta phải có thêm nhiều

nghiên cứu về sản xuất giống, thức ăn, chăm sóc, quản lý môi trường cũng

như dịch bệnh Tuy nhiên, với tình hình nuôi thâm canh ngày càng phổ biến,

dịch bệnh đang là vấn đề gây khó khăn cho các hộ nuôi Cho đến nay, các

bệnh trên cá thát lát còm chưa được quan tâm và đầu tư nghiên cứu đúng mức

Kết quả nghiên cứu còn rời rạc, các công trình nghiên cứu về bệnh trên đối

tượng này còn hạn chế Mức độ thiệt hại, tình trạng bộc phát bệnh, cũng chưa

được ghi nhận nhiều Hiện nay, trên thực tế khi bệnh xuất hiện thì đa số người

nuôi chủ yếu sử dụng các loại hóa chất và thuốc kháng sinh để điều trị là phổ

biến Nhưng việc sử dụng không đúng cách không mang lại hiêu quả trong

việc điều trị mà ngược lại gây ra hiện tượng kháng thuốc ngày càng nghiêm

trọng Việc điều trị bệnh như vậy, không những ảnh hưởng đến môi trường mà

còn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng do sự tồn lưu thuốc trong sản

phẩm thủy sản

Bên cạnh đó việc nghiên cứu sử dụng cây cỏ, thảo dược thay thế thuốc kháng

sinh, bổ sung vào thức ăn cho động vật thủy sản đang rất được quan tâm Năm

2010, Nguyễn Quang Linh tạo ra được một chế phẩm sinh học từ lá trầu không

với tên gọi Bokashi- trầu có khả năng phòng trị một số bệnh cho ĐVTS, an

toàn sinh học và thân thiện với môi trường Chế phẩm từ thảo dược thường là

hỗn hợp các chất chiết xuất từ nhiều loại thảo dược khác nhau Các hoạt chất

trong thảo dược hoạt động như là một chất kháng khuẩn hay chất chống oxy

hóa Nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong thú y và người vì đây là các sản phẩm tự nhiên, an toàn cho người sử dụng mà còn rất có giá trị Theo

Từ Thanh Dung (1996), đã nghiên cứu cảm nhiễm A hydrophila với các loại

thảo dược đinh hương, cây chó đẻ, xiên tâm liên, cây nhọ nồi và một số cây bản địa tại Thái Lan Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về thảo dược trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu tập trung vào cải thiện sức khỏe và bảo vệ gián tiếp cho tôm chống lại các dịch bệnh và mầm bệnh, còn việc sử dụng thảo dược để phòng và trị bệnh trên cá thì còn khá hạn chế Xuất phát từ những thực tế đó,

đề tài “Nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn Aeromonas

hydrophila trên cá thát lát còm (Chitala chitala)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại thảo dược nhằm đánh giá khả

năng dùng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên

cá

1.3 Nội dung đề tài

Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi khuẩn

Aeromonas hydrophila

Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết trên cá thát lát còm

(Chitala chitala)

Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm

2.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), cá thát lát còm thuộc

hệ thống phân loại như sau: nghành có dây sống Chordata, lớp cá xương

Osteichthyes, bộ Osteoglossiformes, họ Notopteridae, giống Chitala, loài

Chitala chitala

Tên khoa học khác: Notopterus chitala (Hamilton, 1822)

Tên địa phương: Cá thát lát cườm, cá nàng hai, cá còm,…

Hình 2.1 Cá thát lát còm (nguồn: diendancacanh.com)

2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản

Cá thát lát còm hay cá nàng hai có nhiều ưu điểm hơn các loài cá thát lát khác: kích thước lớn, tăng trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn, thịt có chất lượng cao

Cá thát lát còm có dạng: thân dẹp ngang viền lưng cong rất rõ, viền bụng có gai, đầu nhỏ nhưng miệng tương đối rộng, vây bụng bị thoái hóa, vây lưng nhỏ nằm khoảng giữa thân, vi hậu môn dài liền với vây đuôi tạo thành một đường viền mỏng Vẩy tròn nhỏ, đường hoàn toàn

Cá có phần thân giữa to, nhỏ ở phần đầu và đuôi Phần đầu nhỏ, chỉ chiếm khoảng 1/8 cơ thể cá Đầu và lưng cá có màu xanh rêu, hai bên hông và bụng màu trắng, có một đôi râu mũi ngắn, mắt nằm lệch về phía lưng của đầu Cá thát lát còm phân bố ở nhiều nước như Ấn Độ, Thái Lan, Myanma, Campuchia và Nam Bộ của Việt Nam Ở Việt Nam loài cá này không có ở các tỉnh phía Bắc chỉ phân bố ở các tỉnh Nam Bộ Cá thát lát còm còn nhỏ thích ăn các loài sinh vật phù du, sau đó chuyển sang ăn động vật phù du là chính, cá lớn ưa thích ăn động vật

Cá có kích thước khá lớn, có thể đạt tới chiều dài 80-100 cm (Trong khi cá thát lát chỉ đạt tới 40 cm (Raiboth, 1991) Tuổi thọ của cá thát lát còm có thể đạt tới trên 10 năm

2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm

Theo Từ Thanh Dung (2005) cá thát lát nuôi thường gặp một số bệnh:

Bệnh nhiễm khuẩn huyết Aeromonas: cá bệnh thường có hiện tượng cơ thể

xuất hiện từng mảng đỏ với nhiều khối u, bụng có hiện tượng sẩm màu từng vùng , lưng có nhiều vết thương Đuôi và vây bị hoại tử, mắt mờ đục, lồi và sưng phù Hậu môn sưng to, cá bỏ ăn, nổi lờ đờ trên mặt nước và cuối cùng là chết

Bệnh nhiễm khuẩn Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ): Cá bị bệnh cơ thể thường

hay xuất hiện nhiều đốm đỏ, rỉ máu và tiết ra nhiều dịch nhờn Xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhung không xuất huyết vây và hậu môn

Bệnh trắng đuôi: Đuôi có đốm trắng, sau đó lan dần ra toàn thân, làm cho cá bị mất nhớt và làm vẩy bị bong ra Vây và đuôi điều bị xuất huyết Cá bị bệnh ít

ăn, bỏ ăn từ từ Các tia vây bị rách và cụt dần

Bệnh trùng quả dưa (Bệnh đốm trắng): Thân cá có nhiều trùng bám tạo thành hạt lấm tắm nhỏ, có màu trắng đục có thể nhìn thấy bằng mắt thường và cá mắc bệnh này thường hay nổi lờ đờ trên mặt nước, giảm ăn hoặc bỏ ăn, nếu bệnh nặng có thể làm cá chết

Bệnh nấm thủy mi: Da cá xuất hiện vùng trắng xám có những sợi nấm nhỏ mềm, sợi nấm phát triển mạnh đan chéo nhau thành búi như bông gòn có thể nhìn thấy bằng mắt thường

Ngoài ra còn có một số bệnh kí sinh khác: Bệnh trùng bánh xe, bệnh sán lá đơn chủ, bệnh giun sán và bệnh do giáp xác,…Trong những loại bệnh trên thì

bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra là phổ biến nhất

Theo Nguyễn Chung (2006) bệnh xảy ra chủ yếu trên cá thát lát còm là do vi khuẩn và nấm Chúng được xem là nguyên nhân gây bệnh thứ cấp ( tác nhân

gây bệnh cơ hội): Bệnh do vi khuẩn chủ yếu là do vi khuẩn Aeromonas spp

với dấu hiệu bệnh thường gặp là cá bỏ ăn, nổi nghiêng, bơi lội uể oải, bơi lờ

đờ chậm chạp trên mặt nước, xuất huyết ở vây, đuôi, hậu môn Bệnh do nấm

chủ yếu là nấm thủy mi do 2 giống Saprolenia và Achlya thường có trong

nước, nhất là trong nước bẩn và trong bùn ao, dấu hiệu trên da xuất hiện những vùng trắng xám, có những sợi nấm nhỏ như sợi bong bám vào da, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, nhất là khi cá bơi trong nước

2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành

Proteobacteria Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không

di động (A salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi khuẩn di động bao gồm (A hydrophila, A caviae, A.sorbia) Đặc tính chung

của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ vào tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, hai đầu hơi tròn, phản ứng oxidase dương tính, kháng với O/129

Hình 2.2 Vi khuẩn A.hydrophila (nguồn: tepbac.com) Theo Từ Thanh Dung (2008) Aeromonas hydrophila là vi khuẩn Gram âm, di

động, hình que ngắn dài 2- 3µm, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, hai đầu hơi tròn, oxidase dương tính, kháng với

O/129 bao gồm A hydrophila, A.caviae, A.sorbia Nuôi cấy chúng phát triển

tốt nhất ở nhiệt độ 28- 30oC, sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Salicin + Histidine & Arginine +

Năm 1979, Lewis & Plumbcho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống

Aeromonas thì A hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt

quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi

và cá tự nhiên

Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu…Nguyên

nhân của bệnh là do vi khuẩn A hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích

dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005)

Năm 2006, Theo Bùi Quang Tề cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung

là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu

2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng

2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus)

Diệp hạ châu (tên khoa học

Phyllanthus amarus) còn có tên gọi

thông dụng là cây chó đẻ Tên khác: lão nha châu, diệp hòe thái, Prak phú (tiếng Campuchia) Diệp hạ châu là loại cây mọc hàng năm, cao thường 30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, thường có màu đỏ Lá mọc so le, lưỡng bộ trong như lá kép, phiến lá thuôn, dài 5- 15mm, rộng 2- 5mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên thủy nhưng hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu xanh lơ, không cuống Hoa mọc ở kẻ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực, hoa cái cùng gốc, đực ở đầu cành, cái ở dưới Hoa không cuống hoặc có cuống rất ngắn Thành phần hóa học: chúng chứa chất Phyllanthin (C24H34O6), Niranthin (C24H32O7), Nirtetralin (C24H30O7), Phyteralin (C24H34O6), Hypophyllathin (C24H30O7) Đây là những chất có tính kháng vi sinh vật rất cao (luanvan.net.vn)

Sản phẩm chiết xuất từ cây diệp hạ châu đã dược tiến hành sản xuất thử nghiệm và đưa sản phẩm vào ứng dụng trong nuôi tôm sú, góp phần giảm thiểu bệnh do virus đốm trắng gây ra, bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng, sản lượng tôm nuôi phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu (viện nghiên cứu NTTS II) Sử dụng sản phẩm diệp hạ châu cho tôm sú trong suốt chu kỳ nuôi có khả năng phòng được bệnh đốm trắng bằng cách cho tôm

ăn thức ăn có trộn chiết xuất từ diệp hạ châu với liều lượng 8 g/kg thức ăn/ngày là hiệu quả nhất Bởi khi được ăn thức ăn có trộn diệp hạ châu tôm có Hình 2.3 Diệp hạ châu (nguồn:

dantri.com.vn)

Hình 2.4 Cỏ mực (nguồn:

nongnghiep.vn)

thể ức chế được sự nhân lên của virus đốm trắng trong cơ thể chúng Các ao nuôi có sử dụng diệp hạ châu đều có thể nuôi đến khi tôm được trên 4 tháng so với các ao không sử dụng phải thu hoạch sớm hơn hoặc bị thiệt hại hoàn toàn

do bệnh đốm trắng Ngay cả khi ao nuôi đã bị nhiễm bệnh đốm trắng nếu tôm

đã được cho ăn thức ăn có chiết xuất từ diệp hạ châu thì tỷ lệ tôm sống vẫn khá cao và có thể kéo dài đến khi có thể thu hoạch được Sản phẩm này không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, sản lượng tôm nuôi Mặt khác khi sử dụng sản phẩm diệp hạ châu liên tục trong 3 tháng thì chi phí nuôi tôm tăng không đáng kể, trung bình tăng từ 500 đồng đến 1.000 đồng/kg tôm so với không sử dụng Vì vậy người nuôi tôm có thể tìm hiểu, sử dụng các sản phẩm dùng trong nuôi tôm với chiết xuất từ diệp hạ châu để phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi nhằm hạn chế sự xuất hiện, lây lan dịch bệnh này Đồng thời nâng cao năng suất, sản lượng nuôi, đạt hiệu quả kinh tế cao

2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba)

Cỏ mực (Rau mực) có tên khoa học là

Eclipta alba, thuộc họ cúc Asteraceae

Tên đồng nghĩa là Eclipta prostrata

Gọi là cỏ mực vì khi vò nát có nước chảy ra như mực đen Người ta còn gọi

nó là cây nhọ nồi, dể gây nhầm lẫn với

vị thuốc nhọ nồi lấy từ cây nồi chảo Tên chữ hán là hạ liên thảo (Cây có đài quả như sen)

Cỏ mực sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 30–40 cm, có thể cao đến 80 cm Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng Lá mọc đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt lá có lông dài 2-8 cm, rộng 5-12 mm Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân, lá bắc thon dài 5-6 mm cũng có lông, gồm hoa cái ở ngoài và hoa lưỡng tính ở giữa (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Theo Christybapita et al., (2007) Tác dụng kích thích miễn dịch của

cây thuốc chiết xuất từ lá cỏ mực đã được nghiên cứu trong cá rô phi

(Oreochromis mossambicus) Với mục đích này, cá được cho ăn cho 1, 2 hoặc

3 tuần với chế độ ăn có chứa lá chiết xuất lá cỏ mực ở 0, 0,01, 0,1 và 1% Sau mỗi tuần, dịch thể không đặc hiệu (Lysozyme, antiprotease và chất bổ sung)

và hiệu ứng tế bào (Chứa myeloperoxidase, sản xuất oxy và nitơ) và khả năng

kháng bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila đã được xác định Kết quả cho

thấy dung dịch nước chiết xuất từ lá cây cỏ mực có thể dùng làm thức ăn bổ sung giúp tăng cường đáng kể hầu hết các thông số miễn dịch không đặc hiệu Trong số các phản ứng dịch thể không đặc hiệu, hoạt động lysozyme tăng lên đáng kể sau khi ăn với dung dịch chiết xuất trong 1, 2 hoặc 3 tuần Không có

sự thay đổi đáng kể phản ứng của tế bào sau 3 tuần cho ăn Trong khi đó, có

sự tăng cường đáng kể oxy và myeloperoxidase sau 1 tuần cho ăn với dung

dịch chiết xuất Khi gây cảm nhiểm với A hydrophila sau 1, 2 hoặc 3 tuần cho

ăn, tỉ lệ cá chết giảm đáng kể Với liều cao nhất 1% giúp bảo vệ tốt hơn so với các liều khác với tỉ lệ sống tương đối (RPS) khoảng 64, 75 và 32 sau khi thức

ăn cho 1, 2 và 3 tuấn tương ứng Kết quả cho thấy chế độ ăn kết hợp dung dịch chiết xuất lá cỏ mực giúp cá tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và

khả năng kháng bệnh của O mossambicus lại vi khuẩn A hydrophila

2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava)

Vấn đề nghiêm trọng xuất hiện trong nuôi trồng thủy sản là dịch bệnh, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn và virus gây ra chết hàng loạt Nhiều phương pháp trị liệu được áp dụng cho việc trị bệnh do vi khuẩn Tuy nhiên sau khi sử dụng, chúng

ta phải đối mặt với một vấn đề khác là dư luợng thuốc trong sản phẩm Thảo dược được xem là một cách khác cho việc điều trị bệnh do vi khuẩn và vi rút trên động vật thủy sản Đây là sản phẩm tự nhiên và rất an toàn cho người tiêu dung, có nhiều loại thảo dược còn được dùng như một loại thực phẩm, trong đó có lá ổi Theo y học cổ truyền Thái Lan, ổi còn được dùng để điều trị bệnh tiêu chảy và các vết thương trầy xướt

Tên khoa học của ổi là Psidium guajava L., trong dân gian còn gọi là phan

thạch lựu, thu quả, kê thỉ quả, phan nhẫm, bạt tử, lãm bạt, phan quỷ tử,…thuộc

họ Sim Myrtaceae, chi Psidium Cây ổi cao chừng 3-5 m, cành nhỏ thì vuông

cạnh, lá mọc đối xứng, có cuốn ngắn hình bầu dục, nhẵn hay hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, khi soi lên có thấy túi tinh dầu trong Hoa màu trắng mọc đơn độc ở kẽ lá Quả nhiều hạt, hình thận, không đều (Đỗ Tất Lợi,

2006) Quả và lá đều chứa Sitosterol, Quereetin, Guaijaverin, Leucocyanidin

và Avicularin, lá còn có Volatile oil, Eugenol Theo dược học cổ truyền, lá ổi

vị đắng sáp, tính ấm, có công dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết

Trong lá ổi có chứa 7-10% tanin, pyrogalic, axit psiditanic, khoảng 3% nhựa

và khoảng 0,36% tinh dầu chủ yếu là caryophyllene, β-bisabolene

Hình 2.5 Lá ổi (nguồn: eva.vn)

Theo Direkbusarakom et al.,(1997) Chiết xuất ổi (Psidium guajava) đã được

xác định sử dụng MIC của các chiết xuất chống lại 24 chủng vi khuẩn gây

bệnh bao gồm: vi khuẩn Vibrio harveyi (9 chủng), V splendidus (7 chủng), V

parahaemolyticus (2 dòng) và 1 dòng của mỗi V mimicus, V vulnificus, V fluvialis, V chorelae, V alginolyticus và Aeromonas hydrophila

2.4.4 Chiết xuất thảo dược

Thời gian thu hoạch thảo dược là lúc cây vừa ra hoa (Từ 1 - 6 tháng tùy vào cách trồng và loại cây) Thảo dược được chiết tách bằng hệ thống Soxhlet cải tiến (Nguyễn Thanh Tâm, 2011)

Tóm tắt quy trình: (1) cân khối lượng thảo dược cần chiết tách, (2) phối trộn

thảo dược và dung môi cồn 96o với tỉ lệ thảo dược: ethanol là 1:3, (3) cho hỗn hợp vào hệ thống Soxhlet ly trích trong 3h, (4) thu hồi dung môi, loại bỏ cồn

đi bằng cách bay hơi trong 24h ở nhiệt độ 90oC, (5) thảo dược được thu ở dạng cao và đem cân, (6) hòa tan cao thảo dược với nước theo tỉ lệ thảo dược: nước

là 1:3, (7) đóng chai dạng nén khí CO2 để bảo quản

2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược

Nghiên cứu nước ngoài

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng

khuẩn của lá hồ đào với đối tượng Bacillus anthracis

Năm 1944, nhà bác học Chester J Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Thuốc kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 tetracillin có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi và tiêu diệt nhiều loại sâu bọ ký sinh trùng và nấm độc

Ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm với 3 loại

thảo mộc Ocimum sanctum (Os), Withania somniera (Ws) và Myristik

fragrans (Mf) có ảnh hưởng kháng lại loài vi khuẩn Vibrio harvey gây bệnh

trên cá mú (Epinephelus tauvina) Thí nghiệm được tiến hành với cá mú có

trọng lượng 30±0,5g, ba loại thảo mộc nêu trên được tách chiết trộn vào thức

ăn cho cá ăn với các nồng độ tăng dần (100, 200, 400 và 800mg/kg thức ăn) Các lô thí nghiệm đối chứng cho thấy tỷ lệ cá chết lên đến 100%, các lô thí nghiệm cho ăn với nồng độ 100, 200 đã giảm tỷ lệ chết 5% Vậy bước đầu đã

có kết quả tốt trong việc sử dụng Os, Ws, Mf có tính kháng vi khuẩn Vibrio

harvey

Năm 2004, tại Bangladesh, Muniruzzaman và Chowdhury nghiên cứu tác

dụng của chiết xuất 26 loại thảo dược với 3 vi khuẩn Aeromonas hydrophila,

Edwardsiella tarda và Pseudomonas fluoescens gây bệnh trên cá Kết quả có

21 loài thảo dược (80,76%) có tác dụng với A hydrophila, 24 loài thảo dược (92,3%) có tác dụng với P.fluoescens tốt nhất và lá cây Bồng bồng (Calotropis

gigantea) diệt vi khuẩn E tarda tốt nhất

Một nghiên cứu khác cho thấy chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống

lại các loài vi khuẩn Staphilococcus, Shigella, Salmonella, Pacilus, E Coli,

Cloestridium và Pseudomonas Năm 2004, Hasnabana đã nghiên cứu sử dụng Azadirachta indik, Allium sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo mộc

dùng để kháng khuẩn

Theo Zheng el al., (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm oreogano (Origanium heracleoticum) khi bổ sung vào thức ăn cho cá nheo bị nhiễm

A.hydrophila thì cá vẩn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng

(p<0,005), chức năng gan và cơ quan nội tạng cũng được cải thiện, hoạt động chống oxy hóa của cá cũng tăng cường

Trung Quốc, người ta đã nghiên cứu hiệu quả của 2 loại thảo mộc (Astragalus

radix và Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch không đặc hiệu của cá rô phi

Kết quả cho thấy Astragalus radix cho ăn với nồng độ 0,1 và 0,5% trong thời gian 3 tuần là nồng độ và thời điểm có hiệu quả tối ưu nhất Riêng Scutellavia

radiis cần có thêm thí nghiệm để tìm ra nồng độ và thời gian cho ăn thích hợp

Năm 2007 cũng tại Trung Quốc thêm một nghiên cứu khác về tính miễn dịch

của cá Chép, trộn lẫn một số loại thảo mộc với nhau như Astragalus

mempranaceus (phần rễ và thân), Poligonum multiflorum (phần rễ), Isatis tinctoria (phần rễ), Glycyrrhida grabra (phần thân) cho cá Chép ăn 0,5% và

1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy thảo dược giúp tính miễn dịch của cá tăng lên đáng kể (2007)

Nghiên cứu trong nước

Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam – nguồn tài nguyên sinh học quý giá – có trên 12.000 loài, trong số đó có tới hơn 3.200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong y học dân gian Đây là một lợi thế to lớn đối với ngành công nghiệp hóa dược nước ta Tuy nhiên, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc nghiên cứu và sử dụng cây thuốc nam và các hợp chất chiết xuất từ thảo dược còn rất mới Do đó việc nghiên cứu có hệ thống việc sử dụng cây thuốc, vị thuốc trong phòng trị bệnh cho ĐVTS là rất cần thiết

Ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu sử dụng chiết xuất thảo dược để

phòng bệnh nhiễm khuẩn ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực

hiện Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và ctv đã nghiên cứu thành công hai loại thảo dược VTS1-C và VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết tách từ tỏi

(Allium sativum) và sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho tôm cá kết quả cho thấy chúng đều có tác dụng với 6 loại vi khuẩn: Vibrio

parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước lợ, ngọt, mặn

Ở miền Bắc, Hà Ký (1995) đã nghiên cứu một số loại thảo dược điều trị bệnh

cho cá Bước đầu đã chọn được 9 loại cây khác nhau: Rau nghề (Polygonum

hydropiper), rau sam (Portulaca oleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta),

cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendulacea), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium

indicum), cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong

phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản

Theo Đỗ Tất Lợi (1968), dịch chiết xuất từ cây bạch hoa xà có thể ngăn chặn

sự tăng trưởng của chủng E coli và vi khuẩn Shigella với MIC: 0,64-10,24 ppm Ngoài ra, khi chiết xuất cây bạch hoa xà bằng ethyl acetate, dịch chiết thu được có tác dụng ức chế vi khuẩn Helicobacterpylori trong ống nghiệm

(Abdul và Rachender, 1995)

Theo Nguyễn Quang Linh (2010), lá trầu không được chiết xuất, tạo ra chế phẩm sinh học với tên gọi Bokashi- trầu, có khả năng phòng trị một số bệnh cho động vật thủy sản, an toàn sinh học và thân thiện với môi trường nhằm thay thế nhiều loại kháng sinh, chế phẩm lần đầu tiên được sản xuất trong nước này được kết hợp từ các vi sinh vật hữu ích Em (Effective

microorganisms) với chất chiết xuất từ lá trầu ( có tên khoa học là Piper betle)

để phòng ngừa và trị bệnh cho một số loài động vật thủy sản Chế phẩm này

có khả năng ức chế và tiêu diệt 2 loài vi khuẩn Vibrio Parahaemoliticus và

Aeromonas hydrophila, đây là 2 loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật

thủy sản nước ngọt và nước lợ

Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2010) đã sử dụng 30 loại thảo dược thường

được dùng trong dân gian như: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), Bàng (Terminalia catappa), Ổi (Psidium guajava), Từ bi (Pluchea indica),…để thử hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn E ictaluri, E tarda và Aeromonas

hydrophila cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn

(MIC=16-2048 µg/ml) Hoạt phổ mạnh trên cả 3 loại vi khuẩn là Bàng, Ổi,

Trầu không, Tràm (MIC=64-512 µg/ml) Tác động mạnh nhất trên E ictaluri

là Sâm đại hành (MIC=16 µg/ml), E tarda là Rau mương (MIC=32 µg/ml),

Aeromonas hydrophila là Bàng (MIC=128 µg/ml) Năm 2011, Huỳnh Kim

Diệu sử dụng bột lá xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum) bổ sung vào

thức ăn của cá tra với liều 15g/kg thức ăn và cho cá ăn trong 1 tháng thì cá tăng trọng hơn nghiệm thức đối chứng là 27% Ở nghiệm thức cho ăn bổ sung bột lá xuân hoa liều 20g/kg thức ăn thì tỉ lệ sống là 98,3% cao hơn so với lô

đối chứng (88,3%) Khi gây cảm nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan thì tỉ

lệ chết (11,67% và 15%) ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sung bột lá xuân hoa (Liều 20g/kg thức ăn) thấp hơn cá ở lô đối chứng (28,33% và 33,33%)

Chất chiết xuất từ cây Hoàng kỳ cũng được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn cho cá tra (20- 30g/con) để tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch của cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Yến Nhi, 2011) Cá tra khỏe (20-30g/con) được cho thức ăn bổ sung 0,5% chiết chất Hoàng kỳ trong 5 tuần thì số lượng hồng cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu tăng so với cá ăn thức ăn không bổ sung chiết chất Hoàng kỳ Sau khi gây cảm

nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây bệnh mũ gan thì số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu,

tế bào lympho, tiểu cầu ở các nghiệm thức đều giảm trong khi bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá cảm nhiễm cao hơn cá khỏe, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh của cá ăn thức ăn

bổ sung Hoàng kỳ cao hơn so với cá ăn thức ăn không bổ sung Hoàng kỳ

2.5 Các chỉ tiêu huyết học

Máu là thành phần quan trọng trong hệ thống tuần hoàn của tất cả các cơ thể sống, chịu trách nhiệm cung cấp oxy, thức ăn cho các mô khác của cơ thể và loại bỏ dioxit carbon cũng như chất thải ra khỏi các mô (Trịnh Hồng Thái, 2002) Ở cá chiễm 5% trong lượng cơ thể (Robert, 1989) Thành phần các tế bào máu của hệ tuần hoàn bao gồm tế bào hồng cầu, tế bào lympho, tế bào tiểu cầu, các tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt

2.5.1 Hồng cầu

Tế bào hồng cầu trưởng thành của cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm và kích thước từ 10 x 13µm – 12 x 13µm Đường kính nhân 4- 5µm Hồng cầu chưa trưởng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn Tế bào chất bắt màu

xanh nhạt hoặc xam bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut el

al.,1991)

2.5.2 Bạch cầu

Tế bào bạch cầu được phân chia thành 2 nhóm: có hạt và không hạt, số lượng giao động trong khoảng 103-104 tế bào/mm3 (Đoàn Nhật Phương, 2006) Bạch cầu không giử chức năng trong sự tuần hoàn máu nhưng thông qua đó để di chuyển đến các cơ quan của cơ thể Bạch cầu là hàng rào sinh học giúp bảo vệ

cơ thể chống lại những yếu tố bên ngoài (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008)

Bạch cầu không hạt

Tế bào lympho (Lymphocyte)

Tế bào lympho nhỏ hơn tế bào hồng cầu, tế bào hình tròn với đường kính 10µm, chiếm số lượng lớn nhất trong các loại bạch cầu Có 2 loại là lympho bào T và lympho bào B Tế bào T có thể tồn tại khoảng vài năm nhưng tế bào

8-B chỉ trong vài tháng Tế bào lympho có vai trò quan trọng trong miễn dịch đặc hiệu sau khi lien kết với các mô của cơ quan đích Tế bào lympho bắt màu tím đậm khi nhuộm Giemsa, tế bào chất nhỏ đôi khi không rỏ ràng và thường

bắt màu xanh (Chinabut el al., 1991)

Tiểu cầu (Thrombocyte)

Hình dạng tế bào tiểu cầu có thể là hình tròn, dài hoặc hình thoi, có một đường viền mỏng của tế bào chất bao quanh nhân Nhân lớn hơn nhân của tế bào hồng cầu tế bào chất bắt màu xanh nhạt khi nhuộm dung dịch Wright & Giemsa Tiểu cầu tham gia vao quá trình đông máu khi bị tổn thương

(Chinabut el al., 1991)

Bạch cầu đơn nhân (Monocyte)

Đây là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10- 14µm, hình dạng không đều, tâm lệch, trong tế bào chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau Tế bào bạch cầu đơn nhân tồn tại vài ngày trong vòng tuần hoàn máu, sau đó chuyển xuyên qua màng trong của mao mạch để liên kết với các mô và thực hiện chức năng thực bào Chúng thực bào, hủy diệt những vật thể lạ (Vi khuẩn), những tế bào chết hay tế bào già cỗi (Hồng cầu)

và tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên (Chinabut el al., 1991)

Bạch cầu đa nhân có hạt

Bạch cầu trung tính ( Neutrophil)

Hình tròn hoặc oval, lớn hơn hồng cầu, đường kính 9-13µm Trong tế chất có hạt, nhân lệch, bạch cầu trung tính thành thục có từ 2- 3 nhân Sự bắt màu của các hạt trong tế bào chất tùy vào giai đoạn phát triển của tế bào Bạch cầu

trung tính có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên còn được gọi là tiểu thực bào Khi thực hiện chức năng thực bào xong thì nó cũng chết, lúc này nó trở thành đối tượng thực bào của các đại thực bào, kết quả là xuất hiện mủ tại chổ viêm Chúng chỉ tồn tại trong máu khoảng 10 giờ rồi đi ống mạch tới mô (Hibiya, 1982)

Bạch cầu toan tính

Chiếm khoảng 4% tổng bạch cầu, hình tròn, đường kính 10- 14µm, có nhiều trong mô Chứa protein có tính chất kiềm và protein tải điện âm nên có thể bắt màu acid như eosin Chức năng là tiêu diệt ký sinh trùng, đời sống tương đối ngắn (Thấp hơn 2 tuần) (Gartner và Hiatt, 1997)

Bạch cầu kiềm tính (basophil và tế bào mast)

Chiếm khoảng 1% tổng tế bào bạch cầu, hình tròn và có thể thay đổi hình dạng khi di chuyển đến mô liên kết Các hạt của bạch cầu kiềm tính bắt màu xanh thẩm đến đen khi nhuộm với dung dịch Wright & Giemsa Chúng có chức năng tương tự tế bào mast là đáp ứng nhanh tại vị trí viêm (Gartner và Hiatt, 1997)

2.5.3 Các nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học

Trên cá tra bị bệnh trắng gan thì tỷ lệ tế bào lympho giảm ở cá bệnh còn các tế bào bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng lên Các tế bào bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính thì sai khác không đáng kể giữa cá bệnh trắng gan

và cá khoẻ (Trần Hồng Ửng, 2003) Cũng trên cá tra bị bệnh vàng da thì số lượng tế bào hồng cầu của cá bệnh giảm đi một nửa so với cá khoẻ: 930±63x106 (tb/mm3) ở cá khỏe và 347±120x106 (tb/mm3) ở cá bệnh (Phan Thị Hừng, 2004)

Ở cá rô phi có trọng lượng trung bình 21,432±2,38(g), khi cá bị nhiễm vi

khuẩn Edwardsiella tarda thì lượng hồng cầu giảm: 2,24±2,38x106 (tb/mm3)

ở cá khoẻ và 1,74±1,78x106 (tb/mm3) ở cá bệnh Trong khi đó, tổng bạch cầu thì tăng lên: 12±0,82x103

(tb/mm3) ở cá khoẻ và 21,75±2,82x103

(tb/mm3) ở

cá bệnh còn tiểu cầu là 4,28±0,60x103

(tb/mm3) (Benli và Yildiz, 2004) Trên

cá rô phi lai với trọng lượng trung bình 240g thì có một số chỉ tiêu huyết học như sau: hồng cầu từ 1,91x106– 2,83x106

(tb/mm3), tổng bạch cầu từ 2,16x104– 1,55x105

(tb/mm3), tế bào lympho từ 9,63x103– 1,68x105

(tb/mm3), bạch cầu trung tính từ 5,57x102

-9,87x103(tb/mm3), bạch cầu đơn nhân từ 4,00x102

– 4,29x103 (tb/mm3) và tiểu cầu từ 2,51x104 – 8,52x104 (tb/mm3) (Hrubec et.al,

2004)

Trên cá trê lai (Heterobranchus longifillix x Clarias gariepinus) ở giai đoạn

nhỏ thì có lượng hồng cầu là 1,43x106

(tb/mm3) và có tổng bạch cầu là 20,42x103 (tb/mm3) (Osuigue et.al, 2005) Trên cá trê (Clarias gariepenius)

nhỏ, có mật độ hồng cầu là 3,8±0,18x106 (tb/mm3) và tổng bạch cầu là 9,2±0,2x103 (tb/mm3) (Omitoyin, 2006) Ở cá trê phi (Clarias gariepenius) có

trọng lượng trung bình 75,33±3g có mật độ hồng cầu là 299,5±2,50x106(tb/mm3) và tổng bạch cầu là 39,0±1,00x103(tb/mm3) (Sunmonu và Oloyede, 2008)

Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Đề tài được tiến hành thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013

3.1.2 Địa điểm thực hiện

Phòng thí nghiệm và trại thực nghiệm của Bộ môn Bệnh Học Thủy Sản- Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Chất chiết xuất: Đề tài được thực hiện trên ba loại thảo được (Diệp hạ châu,

cỏ mực và lá ổi) được trồng tại Vườn thuốc Nam - Khoa Dược Điều Dưỡng - Đại học Tây Đô

Chủng vi khuẩn: Chủng Aeromonas hydrophila có LD50 là 103CFU/ml từ đề

tài cấp Tỉnh Hậu Giang về bệnh trên cá thát lát còm (Chitala chitala) và giải

pháp phòng trị bệnh

Cá thí nghiệm: Cá thát lát còm được thu mua từ các trại sản xuất giống ở Hậu

Giang với kích cỡ cá giống từ 10-12 cm

Dụng cụ: Lọ thủy tinh 100ml, 250ml và 500ml, đĩa petri thủy tinh, ống

nghiệm, pipet, đầu col 1ml và 5ml, que tán vi khuẩn, bộ dụng cụ giải phẩu, vợt, giấy lọc Whatman dày

Thiết bị: Máy quang phổ đo mật độ vi khuẩn, kính hiển vi, buồng đếm hồng

cầu, tủ ấm 28oC, tủ lạnh 4oC, nồi Autoclave, tủ cấy vô trùng, máy lắc vi khuẩn, máy ly tâm, máy trộn mẩu (Vortex), bể composite 500 lít, 250 lít và xô nhựa, máy sục khí, ống sủi khí, đá bọt và các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu

Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Cồn 96o

, Methanol, dung dịch Giemsa, dung dịch Wright, dung dịch Natt-Herrick, Chlorine, TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), BHI-B (Brain heart infusion broth)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

Phục hồi vi khuẩn: Vi khuẩn được lấy ra từ tủ âm 80o

C, và được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C Sau 24 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Sau khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt

trùng lấy khoảng 1-2 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30 mL BHI-B đã

tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ

3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá

Quan sát bên ngoài: Đặt cá lên khay nhựa và quan sát các dấu hiệu bên ngoài

như: màu sắc, vây, mang, hậu môn, vẩy, Ghi nhận các dấu hiệu của cá trước khi mổ

Quan sát bên trong: Trước khi mổ cá phải xịt cồn 70o để xát trùng cá, quan sát

kĩ mặt ngoài của gan, thận, tỳ tạng để sát định dấu hiệu bệnh của cá

3.3.3 Định danh vi khuẩn

Vi khuẩn được định danh dựa theo tài liệu của Buller (2004) và cẩm nang Cowan and Steel’s (1993) Các chủng vi khuẩn sau khi được tách ròng, kiểm tra các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng cách test các chỉ tiêu cơ bản (Primary test) như: nhuộm Gram, phản ứng Catalase, Oxidase, phản ứng O/F (Phụ lục 1)

3.3.4 Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên

vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Kiểm tra tính nhạy của thảo dược thực hiện bằng hai phương pháp như sau:

Phương pháp1: Khuếch tán trên đĩa thạch

Chuẩn bị thí nghiệm

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở nhiệt độ

28oC Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 109 CFU/mL Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến nồng độ là

105CFU/ml

Chuẩn bị đĩa giấy: Đĩa giấy có đường kính 6mm được sấy ở nhiệt độ 180o

C Sau đó được tẩm với nước muối sinh lý và các loại thảo dược (Diệp hạ châu,

cỏ mực, lá ổi) ở các nồng độ 25, 50 và 100% khoảng 30 phút Lấy để ra đĩa Petri phơi vừa khô ở nhiệt độ phòng Tất cả các thao tác được làm trong điều kiện vô trùng

Tiến hành thí nghiệm

Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch Lấy pel tiệt trùng lấy đĩa giấy đã được tẩm thảo dược dán vào đĩa Petri (Mỗi nồng độ lặp lại 5 lần) Sau khi hoàn tất việc dán đĩa giấy đã được tẩm thảo dược, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 28o

Phương pháp 2: Đục lỗ trên đĩa thạch

Sau khi chuẩn bị 90 ml môi trường thạch TSA, đã được tiệt trùng ở 121oC, để môi trường nguội dần còn khoảng 40-50oC Cho 10ml dung dịch vi khuẩn

Aeromonas hydrophila ở mật độ 105 CFU/ml vào môi trường thạch.`Tiến hành

đỗ môi trường có chứa dung dịch vi khuẩn ra đĩa Petri Sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ trên đĩa thạch Ở mỗi đĩa đục 4 lỗ, đường kính khoảng 5 mm/lỗ, trong đó 3 lỗ để chứa dịch chiết thảo dược ở các nồng độ 25,

50 và 100%, Lỗ còn lại để nước muối sinh lý Cho vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch chiết (Lỗ đối chứng sử dụng nước muối sinh lý)

Tiến hành để đĩa thạch vào tủ lạnh khoảng 10 phút rồi đem ủ ở nhiệt độ 28oC (Mỗi nồng độ lặp lại 5 lần) Sau 24 giờ tiến hành xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn

3.3.5 Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết do vi

khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm

Chuẩn bị hệ thống bể: Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và

Chlorin 200 ppm, phơi khô, cấp nước vào khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày trước khi thí nghiệm, bể được che kín, nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy, các dụng cụ thí nghiêm khác như: xô, ống sục khí, đá bọt….cũng được

vệ sinh kỹ

Cá thí nghiệm: Cá thát lát còm có kích cở từ 10- 12 cm, cá khỏe, phản ứng

linh hoạt với tiếng động Cá được mua từ các trại giống ở Hậu Giang, được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá

Cho ăn thảo dược

Cho cá ăn 3 tuần với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được bố trí 40 con/bể, ngày cho ăn 2 lần

NT 1: Đối chứng (Không thảo dược)

NT 2: Bổ sung thảo dược 1 (Lá ổi) với liều lượng 3ml/kg thức ăn

NT 3: Bổ sung thảo dược 1 (Lá ổi) với liều lượng 6ml/kg thức ăn

NT 4: Bổ sung thảo dược 2 (Cỏ mực) với nồng độ 3ml/kg thức ăn

NT 5: Bổ sung thảo dược 2 (Cỏ mực) với nồng độ 6ml/kg thức ăn

NT 6: Bổ sung thảo dược 3 (Diệp hạ châu) với nồng độ 3ml/kg thức ăn

NT 7: Bổ sung thảo dược 3 (diệp hạ châu) với nồng độ 6ml/kg thức ăn

Các liều lượng được pha với 100ml, cho vào bình phun sương, phun đều lên viên thức ăn, để khô tự nhiên và tiến hành cho cá ăn

Thí nghiệm cảm nhiễm

Chuẩn bị vi khuẩn cảm nhiễm: Vi khuẩn gây cảm nhiễm được lấy từ đề tài cấp

Tỉnh Hậu Giang về bệnh trên cá thát lát còm (Chitala chitala) và giải pháp

phòng trị bệnh Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C Sau 24 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn Khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng

1-2 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30 mL BHI-B đã tiệt trùng, đặt lên

máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50 mL tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để rửa vi khuẩn (Lặp lại 2-3 lần) Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên cho vào khoảng 25mL dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn mẫu bằng máy vortex Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn

là 109 CFU/mL Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ thí nghiệm cần thiết Mật độ vi khuẩn của từng nghiệm thức được tái khẳng định bằng phương pháp trải dung dịch trên đĩa agar

Bố trí thí nghiệm: Cá thí nghiệm được lấy từ 7 nghiệm thức có và không bổ

sung thảo dược, cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức tiêm

vi khuẩn với mật độ 103

CFU/ml, một nghiệm thức tiêm nước muối sinh lý đã tiệt trùng và một nghiệm thức không tiêm Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ 10 con/bể Cá được tiêm với nồng độ 0,1ml vi khuẩn cho mỗi con và tiêm ở gốc vi ngực của cá Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi: Số lượng cá chết, thời điểm cá chết ở các mốc thời gian

6h, 9h, 12h, 15h, 18h và 21h và các dấu hiệu lâm sàng được ghi nhận trong suốt quá trình thí nghiệm Nước được thay định kỳ 3 ngày/lần khoảng 30% Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết, ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể cá

Tái phân lập và định danh vi khuẩn

Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ, ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong

cơ thể Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng Sau 24 giờ ủ ở 28o

C quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TSA, nhuộm gram, khả năng di động của vi khuẩn Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn (Phụ lục 1)

3.3.5 Định lượng và định tính hồng cầu và bạch cầu

Phương pháp phân tích mẩu máu cá

Cá từ các bể thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm được thu ngẫu nhiên 3 con/bể Cá được dùng cồn (70%) sát trùng quanh khu vực lấy máu Dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (Houston, 1990), lượng máu tối thiểu là 0,3ml Nhỏ máu xuống lame, dùng pipet hút 10µl máu cho vào ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick để đếm hồng

Hình 3.1 A Bố trí thí nghiệm cho ăn; B Bố trí thí nghiệm

cảm nhiễm

cầu Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác cho thao tác phết mẫu

để đếm bạch cầu

Phết mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước (Hình 3.2) Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008)

Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh

Hình 3.2 Thao tác lấy mẩu máu và trải mẫu (Đoàn Nhật Phương, 2006)

Phương pháp điếm hồng cầu

Cho 10µl máu vào ống nghiệm chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm Thao tác phải nhanh từ 5- 15 giây để tránh hiện tượng máu bị đong lại Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sư quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 buồng đếm, đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X Đếm 4 ô lớn (1 ô lớn có 25 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm

Công thức tính mật độ hồng cầu: R = C x 10 x 5 x 200

Trong đó: R: Mật độ hồng cầu (tb/mm3

) C: tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm 14 10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm 5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2

200: độ pha loãng hồng cầu

Hình 3.3 Buồng đếm hồng cầu (C: 1 vùng đếm hồng cầu được phóng to)

Các bước nhuộm mẫu: (1) nhuộm với dung dịch Wright trong 3 – 5 phút, (2) ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 – 6 phút, (3) nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút, (4) ngâm trong dung dịch pH 6.2 trong 15 – 30 phút, (5) rửa qua nước cất, để khô và đọc mẫu

Quan sát dưới kinh hiển vi ở vật kính 100X và các loại tế bào bạch cầu sẽ

được xác định theo Supranee et al (1991) Phương pháp định lượng các tế bào bạch cầu: (Supranee et al., 1991)

Tổng bạch cầu (TBC): Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu là 1500 tế bào trên

mẫu nhuộm:

Số bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm TBC(tb/mm3) =

Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm

Xác định từng loại bạch cầu: Đếm từng loại tế bào bạch cầu trong 200 tế bào

Mật độ từng loại(tb/mm3) = (số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC)/ 200

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2003, phần mền SPSS 16.0 và luận văn được trình bài Microsoft word 2003

Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn Aeromonas

hydrophila

Thí nghiệm được thực hiện trên 3 loại thảo dược (Diệp hạ châu, cỏ mực, lá ổi) được pha loãng ở 3 nồng độ khác nhau (25, 50 và 100%), một chủng vi khuẩn

Aeromonas hydrophila được phục hồi và nuôi cấy trên môi trường thạch TSA

Sau 24h xác định tính thuần của vi khuẩn thông qua kết quả nhuộm Gram

Hình 4.1 (A)Vi khuẩn A hydrophila, (B) Nhuộm Gram vi khuẩn A.hydrophila

4.1.1 Kết quả Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch không cho kết quả như mong muốn, tất

cả 3 loại thảo dược đều không có vòng tròn kháng khuẩn Có thể lượng thảo dược trên đĩa giấy là qua ít và bay hơi nhanh nên không có khả năng kháng khuẩn

4.1.2 Kết quả Phương pháp đục lổ trên đĩa thạch

Hình 4.2 Kiểm tra thảo dược (Cỏ mực, diệp ahk châu, lá ổi) với vi khuẩn

A.hydrophila

0 2 4 6 8 10 12 14 16