Nghiên cứu một số dặc tính sinh học của vi khuẩn salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo vaxin phòng bệnh

Bộ giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiƯp hµ néi VĂN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP ðƯỢC TỪ LỢN SAU CAI SỮA BỊ TIÊU CHẢY VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH LuËn văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành : THú Y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa ñược cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn ñều ñã ñược rõ nguồn gốc Hà Nội, Ngày tháng năm 2009 Tác giả Văn Thị Hường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, với nỗ lực cố gắng thân, tơi xin ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy: TS Nguyễn Hữu Nam, thầy cô mơn Bệnh lý tồn thể thầy giáo Khoa Thú y; Viện sau ðại học – Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới chuyên gia: GS Koichi Takeshi, GS Makino Sou-ichi, Khoa Thú y ứng dụng sức khỏe cộng ñồngTrường ðại học Nông nghiệp Thú y Obihiro, Nhật Bản giúp tơi q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Thú y, anh, chị, em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, Lãnh đạo cơng ty giống chăn ni Hà Nơi, Hưng n, Bắc Ninh, Hải Phịng, Thái Bình bạn đồng nghiệp đặc biệt gia đình tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Hà nội, ngày tháng 09 năm 2009 Văn Thi Hường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết ñề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella bệnh chúng gây 2.2 Một số ñặc ñiểm vi khuẩn Salmonella 2.3 Bệnh vi khuẩn Salmonella gây lợn 22 2.4 Biện pháp phòng trị bệnh Salmonella gây lợn 28 2.5 Một số hiểu biết vacxin vacxin phịng bệnh Phó thương hàn 29 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Nội dung nghiên cứu 32 3.2 ðối tượng, ñịa ñiểm thời gian nghiên cứu 33 3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 34 3.5 Phương pháp sử lý số liệu 44 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella 46 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm 46 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii 4.1.2 Kết xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella số quan phủ tạng lợn bệnh 4.2 Kết giám ñịnh số đặc tính ni cấy sinh hóa chủng Salmonella phân lập ñược 4.3 64 Kết xác ñịnh ñộc lực số chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược chuột nhắt trắng 4.7 61 Kết xác ñịnh số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.6 57 Kết kiểm tra mức ñộ mẫn cảm chủng Salmonella phân lập ñược với số loại kháng sinh 4.5 53 Kết xác ñịnh serotyp chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.4 48 69 Kết gây bệnh thực nghiệm lợn chủng Salmonella phân lập ñược 72 4.8 Kết chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn 76 4.8.1 Chế vacxin vơ hoạt có bổ trợ keo phèn phịng bệnh Salmonella cho lợn 76 4.8.2 Kết kiểm tra an tồn hiệu lực vacxin chuột thí nghiệm 79 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 81 5.1 Kết luận 81 5.2 ðề nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 83 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine DiPhosphate ATP Adenosine TriPhosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA DeoxyriboNucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor DT104 Definitive phage Type 104 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC EnteroToxigenic E coli GDP Guanin DiPhosphate GTP Guanin TriPhosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS LipoPolySaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide RPF Rapid Permebility Factor ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron PCR Polymerase Chain Reaction RV Rappaports Vassiliadis Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghip v DANH MC BNG STT 3.1 Tên bảng Trang Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh 3.2 41 Trình tự cặp mồi kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh số yếu tố gây bệnh chủng Salmonella phân lập ñược 42 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu phân phủ tạng 47 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella số quan phủ tạng lợn bệnh 4.3 49 Kết kiểm tra số ñặc tính ni cấy chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.4 Kết giám ñịnh số ñặc tính sinh hố 53 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.5 Kết xác ñịnh serotyp chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.6 60 Kết kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với số loại kháng sinh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 4.7 55 63 Kết kiểm tra số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 66 4.8 Kết kiểm tra ñộc lực số chủng Salmonella phân lập ñược 71 4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh 72 4.10 Kết gây bệnh thực nghiệm Salmonella lợn 35 ngày tuổi 73 4.11 Bệnh tích đại thể lợn gây bệnh thực nghiệm 75 4.12 Kết kiểm tra số tiêu lô vacxin 78 4.13 Kết thử hiệu lực vacxin chuột nhắt trắng 79 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC HÌNH STT 3.1 Tên hình Trang Quy trình phân lập giám định vi khuẩn Salmonella từ mẫu phân phủ tạng 36 3.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 45 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Sallmonella từ mẫu phân phủ tạng 47 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Salmonella số quan phủ tạng lợn bệnh 49 4.3 Ruột lợn bi viêm vi khuẩn Salmonella gây 52 4.4 Lách sưng to lợn mắc bệnh Salmonella gây 52 4.5 Khuẩn lạc Salmonella môi trường CHROM 56 4.6 Khuẩn lạc Salmonella môi trường DHL 56 4.7 Phản ứng lên men ñường vi khuẩn Salmonella 57 4.8 Vi khuẩn Salmonella môi trường TSI 57 Kết xác ñịnh serotyp chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 60 4.10 Kết kiểm tra số yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 67 4.11 Kết phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh 4.12 chủng vi khuẩn Salmonella 67 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần ñây, kinh tế nước ta có bước phát triển vượt bậc mặt, ñời sống kinh tế xã hội ngày cải thiện ðóng góp phần khơng nhỏ cho thành cơng phải kể đến thành tựu ngành nơng nghiệp, có ngành chăn ni thú y mà đặc biệt ngành chăn ni lợn Ngành chăn ni lợn góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm nước phần dành cho xuất thu ngoại tệ Theo CIRAD (2006)[43], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng loại thịt tiêu dùng hàng ngày thị trường Việt Nam Tuy nhiên, thách thức khơng nhỏ việc phát triển chăn nuôi lợn dịch bệnh thường xuyên xảy ñàn lợn lứa tuổi, làm giảm suất, giảm chất lượng giống nhiễm vào sản phẩm thịt lợn gây nguy an toàn vệ sinh thực phẩm Một bệnh thường gặp phải kể ñến bệnh tiêu chảy vi khuẩn Salmonella gây lợn sau cai sữa, gọi bệnh Phó thương hàn khơng nổ thành dịch lớn, với ñặc ñiểm dịch tễ phức tạp, ñã ñang gây nên thiệt hại đáng kể cho người chăn ni Có thể nói sở chăn nuôi dù quy mơ lớn hay nhỏ xuất bệnh Khi ñời sống nhân dân ngày ñược nâng cao, vấn đề an tồn thực phẩm có lợn thịt lợn bệnh, khơng bị nhiễm Salmonella yêu cầu cấp thiết Có nhiều tác giả cơng bố nhiễm Salmonella vào thân thịt lợn trình giết mổ chủ yếu liên quan ñến nhiễm trùng Salmonella ruột (Borch cs, 1996[38]; Berends cs, 1997[35]) Do đó, việc giảm tỷ lệ trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella làm an toàn thịt lợn tăng lên Mục tiêu nhà khoa học, nhà sản xuất Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 xây dựng ñàn gia súc Salmonella Nhìn chung vi khuẩn Salmonella bệnh chúng gây lợn ñã ñược nhiều nhà vi sinh vật toàn giới quan tâm Ở Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu Salmonella bệnh chúng gây lợn như: Nguyễn Thị Nội cs (1989)[20]; Lê Văn Tạo cs (1993)[26]; Trần Xuân Hạnh (1995)[11]; Cù Hữu Phú cs (2000)[21]; ðỗ Trung Cứ (2004)[6] Theo Bryan (1988)[40]; Nielsen Wegener (1997)[62]; Berends cs 1998[36]; Schwartz (1999)[71]: Các ñàn lợn bị nhiễm Salmonella gây thiệt hại kinh tế cho người chăn ni mà cịn nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại ñối với người Bởi mà biện pháp ngăn chặn có hiệu gia súc ñều cần thiết ñiều kiện tiên góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Vì mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định serotyp đặc tính gây bệnh chúng lợn, nhằm mục đích phát sớm tìm hướng phịng trị bệnh có hiệu ln việc làm cấp thiết Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu yêu cầu sản xuất, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh" 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, xác định hình thái, tính chất ni cấy, đặc tính sinh vật hóa học, serotyp yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa số tỉnh phía Bắc - Chế tạo thử nghiệm vacxin đa giá có chứa số serotyp thường gặp từ trường hợp nhiễm bệnh Salmonella lợn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 Chúng tơi chế tạo vacxin dạng vơ hoạt có bổ trợ keo phèn theo quy trình thường quy Bộ môn Vi trùng - Viện thú y Các chủng vi khuẩn S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis ni cấy riêng rẽ theo lơ khác phương pháp lên men, sục khí Sau - 10 lên men, sục khí, lấy mẫu kiểm tra khiết nhuộm Gram kiểm tra ñậm ñộ vi khuẩn ml canh trùng phương pháp ñếm số khuẩn lạc mọc ñĩa thạch, sau tiến hành vơ hoạt vi khuẩn Formol với nồng độ 0,5% Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết kiểm tra số tiêu lô vacxin Chỉ tiêu kiểm tra Lô vacxin ðậm độ (109 vk/ml) Thuần khiết Vơ trùng S choleraesuis 19 ðạt ðạt S typhimurium 22 ðạt ðạt S enteritidis 16 ðạt ðạt Kết cho thấy: - ðậm ñộ vi khuẩn lơ S choleraesuis đạt khoảng 19x109 vi khuẩn/ml canh trùng, lô S typhimurium 22x109 vi khuẩn/ml canh trùng, cịn lơ canh trùng S enteritidis 16x109 vi khuẩn/ml Với số lượng vi khuẩn yêu cầu ml canh trùng ñể chế tạo vacxin phải ñạt tối thiểu 1,5x109 vi khuẩn lơ canh trùng ni cấy đủ tiêu chuẩn chế vacxin - Cả lơ canh trùng đạt tiêu khiết canh trùng sau diệt Formol 0,5% ñều ñạt tiêu vô trùng kiểm tra loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, nước thịt thường, nước thịt yếm khí,… Từ kết kiểm tra cho thấy, lơ canh trùng đạt tiêu cần thiết để sử dụng làm vacxin 78 4.8.2 Kết kiểm tra an toàn hiệu lực vacxin chuột thí nghiệm Sau kiểm tra canh trùng chủng vi khuẩn S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis ñều ñạt tiêu chuẩn dùng làm vacxin, tiến hành trộn lẫn lô canh trùng với theo tỷ lệ 1:1:1 ñể ñạt ñược loại canh trùng ñồng nhất, ñiều chỉnh nồng ñộ canh trùng, rôi bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 để đảm bảo 1ml vacxin có chứa – 5x109 vi khuẩn Vacxin ñược chai (20 ml/chai), ñóng nút, gắn paraffin, dán nhãn, sau ñó tiến hành lấy mẫu để kiểm tra an tồn hiệu lực động vật thí nghiệm - Kiểm tra an tồn chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào phúc xoang chuột tiêm 0,2 ml/con nước phía lọ vacxin vào tĩnh mạch Theo dõi sau ngày cho thấy tất chuột ñược tiêm vacxin ñều sống khỏe mạnh, khơng có biểu phản ứng sau tiêm ðiều khẳng ñịnh vacxin ñã ñạt yêu cầu ñộ an toàn ñộng vật thí nghiệm tiến hành kiểm tra hiệu lực vacxin động vật thí nghiệm - Kiểm tra hiệu lực bảo hộ vacxin chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào da chuột ñối chứng không tiêm vacxin Sau 21 ngày, tiến hành thử thách với hỗn hợp canh trùng S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis với liều 10LD50 tương ứng với liều 0,5ml/con cho tất chuột thí nghiệm chuột đối chứng Kết thu trình bày bảng 4.13 Bảng 4.13 Kết thử hiệu lực vacxin chuột nhắt trắng Lô vacxin Số chuột tiêm (con) Liều tiêm vacxin (ml) Liều công (ml) Thời gian theo dõi TN 10 0,2 0,5 ngày 10 100 ð/C 0,5 24-48 0 79 Số Số Tỷ lệ chuột chuột bảo hộ chết sống (%) (con) Kết cho thấy: Ở lơ thí nghiệm, chuột ñược tiêm vacxin với liều 0,2 ml/con, sau 21 ngày, chuột có miễn dịch nên sống khỏe mạnh thử thách cường ñộc với hỗn hợp canh trùng S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis tương ứng với chủng sản xuất vacxin ñược ñánh giá 100% số chuột bảo hộ Trong đó, chuột lơ đối chứng khơng tiêm vacxin, sau cơng cường độc với liều tương tự bị chết vịng 24 (tỷ lệ chết 100%) phân lập lại ñược vi khuẩn Salmonella từ máu tim Tổng hợp kết kiểm tra an toàn hiệu lực bảo hộ vacxin chuột bạch lô vacxin chế thử, so sánh với tiêu chuẩn Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương I kiểm nghiệm vacxin chết có bổ trợ keo phèn, cho phép đánh giá: Lơ vacxin đạt tiêu an tồn 100% có hiệu lực bảo hộ cao chuột bạch (100%), ñủ tiêu chuẩn ñể tiến hành kiểm tra bước ñể ñánh giá hiệu sử dụng vacxin ñộng vật 80 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỷ lệ trung bình phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu phân phủ tạng thu thập từ ñịa phương khác 54,73% Tỷ lệ phân lập ñược Salmonella cao hạch màng treo ruột (52,94%), chất chứa ruột non (50,00%) sau lách (41,18%), gan (32,35%), thấp máu tim (23,53%) Các chủng Salmonella phân lập ñược mang ñầy ñủ đặc tính sinh học vi khuẩn Salmonella tài liệu ngồi nước mơ tả Kết xác ñịnh serotyp cho thấy: 12,31% S choleraesuis, 38,46% S typhimurium, 24,62% S enteritidis, 9,23% S derby, 6,15% S rissen, 1,54% S anatum, 7,69% S stanley Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược mẫn cảm với Ofloxacin Norfloxacin (100%), tiếp ñến Ciprofloxacin (90%) Neomycin (80%) Kháng hoàn toàn với Trimethoprim + Sulfamethoxazole (100%) kháng cao với số kháng sinh như: Cefazolin (80%) Spectinomycin (75%) 100% chủng S choleraesuis ñược kiểm tra có mang gen Stn InvA; 100% chủng S typhimurium có mang gen Stn 96,0% chủng có mang gen InvA; 93,7% chủng S enteritidis có mang gen Stn 87,50% chủng gen InvA Không có chủng vi khuẩn mang gen DT104 Tất chủng vi khuẩn đem thử có độc lực cao, gây chết 100% chuột thí nghiệm vịng - 36 sau tiêm Cả chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh cho lợn ñều có độc lực cao, giết chết hết lợn thí nghiệm vịng 28 - 96 Cả lơ canh trùng S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis dùng chế tạo vacxin ñều ñạt tiêu về: ðậm ñộ, khiết, vô trùng, ñủ tiêu chuẩn dùng làm vacxin 81 10 Lơ vacxin chế từ chủng S choleraesuis, S typhimurium S enteritidis ñạt tiêu an tồn 100% có hiệu lực bảo hộ 100% chuột nhắt trắng 5.2 ðề nghị Tiếp tục xác ñịnh hiệu lực ñộ dài miễn dịch vacxin, nhằm đánh giá hiệu phịng bệnh vacxin lợn nghiên cứu thử nghiệm diện rộng ñể áp dụng vào sản xuất 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella phân thân thịt (bò, heo, gà) số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr 37-42 Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella lợn vùng Tây Nguyên khả phòng trị Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I Hà Nội Phùng Quốc Chướng (2005), “Kết kiểm tra tính mẫn cảm số thuốc kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi ðăkLăk” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr 53 ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “Kết phân lập xác ñịnh số yếu tố gây bệnh vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh Phó thương hàn lợn số tỉnh miền núi phía Bắc” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr 10-17 ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, ðỗ Thị Lan Phương (2003), “Xác ñịnh số yếu tố gây bệnh Salmonella Typhimurium phân lập từ lợn bị tiêu chảy số tỉnh miền núi phía Bắc” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr 33-37 ðỗ Trung Cứ (2004), Phân lập xác ñịnh yếu tố gây bệnh Salmonella lợn số tỉnh miền núi phía Bắc biện pháp phịng trị Luận án Tiến sỹ nơng nghiệp, Viện Thú y Quốc gia ðỗ ðức Diên (1999), Vai trò E coli Salmonella hội chứng tiêu chảy lợn Kim Bảng (Hà Nam) thử nghiệm số giải pháp phòng trị Luận án Thạc sỹ Nông nghiệp Trần Quang Diên (2002), Nghiên cứu tình hình nhiễm, đặc tính gây bệnh Salmonella gallinarum pullorum gà công nghiệp chế kháng 83 nguyên chẩn đốn Luận án Tiến sỹ nơng nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002), Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam Viện Thú y Quốc gia Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản 10 ðào Trọng ðạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa lợn NXB Nơng nghiệp, tr 63- 96 11 Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập giám ñịnh vi khuẩn Salmonella lợn tuổi giết thịt” Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr 89-93 12 Trần Thị Hạnh (2009), “Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp sở giết mổ lợn cơng nghiêp thủ cơng nghiệp” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr 51-56 13 Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn ñường ruột thường gặp biến ñộng chúng gia súc khỏe mạnh bị tiêu chảy nuôi vùng ngoại thành Hà Nội Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội 14 Archie Hunter (2002), Sổ tay dịch bệnh động vật Cơng ty in Thống nhất, Hà Nội 15 Nguyễn Văn Lãm (1968), “Chế vacxin Phó thương hàn lợn con” Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1968- 1978, NXB Nông nghiệp, tr 250- 289 16 Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis” Báo cáo hội thảo bệnh lợn Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch Trần Thị Hạnh – Viện Thú y 17 Phạm Sỹ Lăng, Phan ðịch Lân, Trương Văn Dung (2004), Bệnh phổ biến lợn biện pháp phòng trị NXB Nông nghiệp 18 Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu ðức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), “Tình hình nhiễm 84 Salmonella vai trò Salmonella bệnh viêm ruột ỉa chảy lợn” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr 39-45 19 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở (1989), “Kết ñiều tra tình hình nhiễm vi khuẩn ñường ruột số sở chăn nuôi lợn” Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y (19851989) Viện Thú y, NXB nông nghiệp, Hà nội 1989, tr 50-53 20 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig” Kết 20 năm nghiên cứu Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr 43 21 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli Salmonella lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác ñịnh số đặc tính sinh vật hố học chủng vi khuẩn phân lập biện pháp phịng trị” Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 171-176 22 Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y NXB ðại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội 23 Phan Thanh Phượng (1988), Phịng chống bệnh Phó thương hàn lợn NXB Nơng thơn, Hà Nội 24 Hồng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2004), “Ảnh hưởng thức ăn gây nhiễm E.coli Salmonella ñến biến ñổi bệnh lý số tiêu sinh lý, sinh hóa máu lợn sau cai sữa” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr 36-41 25 Lê Minh Sơn (2003), Nghiên cứu số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp 26 Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, ñịnh danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn” Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 27 Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập ñịnh typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn” Tạp chí Nơng nghiệp công nghiệp thực phẩm, 85 số 11, tr 430- 431 28 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương 2001 Vi sinh vật Thú y NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 29 Tơ liên Thu (2004), “Tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella E.coli phân lập ñược từ thịt lợn thịt gà vùng đồng Bắc bộ” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr 29 – 35 30 Tơ Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng nhiễm số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ Hà Nội số phương pháp làm giảm nhiễm khuẩn thịt Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội 31 Tạ Thị Vịnh, ðặng Khánh Vân (1996), “Bước ñầu thăm dị xác định E.coli Salmonella lợn bình thường lợn mắc hội chứng tiêu chảy Hà Tây Hà Nội” Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr 41- 44 II TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 32 Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig” J Vet Med Sci 64, 2, p 159- 160 33 Barners D.M, Sorensen K.D (1975), ”Salmonellosis” Diseases of Swine, 4th Edition Iowa State University press, p 12-18 34 Benjamin W.H, Turnbough C.N, Posey B.S and Briles D.E (1985), “The ability of Salmonella typhimurium to produce siderophore enterobactin, avirulence factors” Infect Immun, 50, p 392-397 35 Berends B.R, Van Kanpen F, Snijders J.M.A and Mossel D.A.A (1997), “Identification and quantification of risk factors regarding Salmonella spp on fork carcasses” Int J Food Microbiol, 36, p 199-206 36 Berends B.R, Van Knapen F, Mossel D.A.A, Burt S.A and Snij J.M.A (1998), “Impact on human health of Salmonella spp on pork in the 86 Netherlands and the anticipated effects of some currently proposed control strategies” Int J Food Mcrobiol, 44, p 219-229 37 Bergey’s (1994), Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company 38 Borch E, Nesbakken T and Christensen H (1996), “Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne” Bacteria Int J Food Microbiol, 30, p 9-25 39 Bradley S.G (1979), “Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins” Ann Rev Microbiol, 33, p 67-94 40 Bryan F (1988), “Risks associated with vehicles of foodborne pathogens and toxins” J Food Prot, 51, p 498-508 41 Chiu C.H and Ou J.T (1996), “Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of the virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture – multiplex PCR combination assay” J Clin Microbiol, 34, p 2619-2622 42 Chiu C.H, Su L.H and Chu C (2004), “Samonella enterica serotype Choleraesuis: Epidemiology, Pathogenesis, Clinical Disease and Treatment” Clinical Microbiology Reviews 2, p 311-322 43 CIRAD “Training Course Salmonella”, 23 – 37 October 2006 44 Clarke G.J, Wallis T.S, Starkey W.J, Collins J, Spencer A.J, Daddon G.J, Osborne M.P, Candy D.C and Stephen I (1988), “Expression of an antigen in strains of Salmonella typhimurium with antibodies tocholeratoxin” Med Microbiol, 25, p 139-146 45 Cleckner N, Roth J.R, Bostein D (1977), “Genetic engineering invivo using translocatable drug – resistance elements new methods in bacterial genetics” Hol Sen Gonet , 116, p 125 – 159 46 Cloeckaert A, Praud K, Doublet B, Demartin M and Weill F.X (2006), “Variant Salmonella genomic island J – L antibiotic resistance gene 87 cluster in Salmonella enterica serovar Newport” Antimicrob Agents Chemother, 50, p 3944-3946 47 Cortez A.L.L, Carvalho A.C.F.B, Ikuno A.A, Bürger K.P and Vidal – Martins A.M.C (2006), “Identification of Salmonella spp isolates from chicken abattoirs by multiplex – PCR” Res Vet Sci, 81, p 340-344 48 Crosa J.H, Brenner D.J, Ewing W.H and Falkow S (1973), “Molecular relationship among Salmonella” J Bacteriol, 115, p 307-315 49 Ewing, Edward (1970), Indentification of Enterobacteriaceae Edicion Revolucionnalria, Instituto Cubano Del libro 19 No 1002, Vedado Habana 50 Euzéby J.P (1999), “Revised Salmonella nomenclature”: designation of Salmonella enterica (ex Kauffmann and Edwards 1952) Le Minor and Propoff 1987 sp nov., nom rev as the neotype species of the genus Salmonella Lignieres 1900 (Approved Lists 1980), rejection of the name Salmonella choleraesuis (Smith 1894) Weldin 1927 (Approved Lists 1980), and conservation of the name Salmonella typhi (Schroeter 1886) Warren and Scott 1930 (Approvied Lists 1980), Request for an opinion Int J Sist Bacteriol, 49, p 927-930 51 Farmer J.J (1995), “Enterobacteriaceae: Introduction and identification” p 438-449 In Murray P.R, Baron E.J and Pfaller M.A (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C 52 Finlay B.B and Falkow (1988), “Virulence factors associated with Salmonella species” Microbiological Sciences Vol 5, No.11 53 Frost A.J, Bland A.P, Wallis T.S (1997), “The early dynamic respose of the calf ileal ephithelium to Salmonella typhimurium” Vet – Pathol, 34, p 369-386 54 Gray J.T, Fedorka-Gray P.J and Stabel T.S (1995), “Influence of 88 inoculation route on the carrier state of Salmonella choleraesuis in swine” Vet Microbiol, 47, p 43 – 49 55 Griggs D.J, Hall M.C, Jin Y.F, and Piddock I.J.V (1994), “Quinolon resistantce in Veterinary Isolates of Salmonella” J Antimicrobiological Chemotherapy, p 1173-1189 56 Jones J.W, Richardson A.L (1981), “The attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose – sensitive haemaglutinate activities” J Gen Microbiol, V127, p 361-370 57 Khakhria R and Johnson W (1995), “Prevalence of Salmonella serotypes and phage types in Canada” Southeast Asian J Trop Med Public Health 26 (Suppl 2) p 42-44 58 Kishima M, Uchida i, Namimatsu T, Osumi T, Takahashi S, Tanaka K, Aoki H, Matsuura K and Yamamoto K (2008), “Nationwide Surveillance of Salmonella in the Faeces of Pigs in Japan” 59 Krause M, Fang F.C, Gedaily A.E, Libby S and Guiney D.G (1995), “Mutational Ananysis of SpvR Binding to DNA in the Regulation of the Salmonella Plasmid Virulence Operon” Academic Press Inc Plasmid, 34, p 37-47 60 Morris I.A, Wray C, Sojka W.J (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a get E mutant of Salmonella typhymurium” Bristh J of Exp, Path 57 61 NCCLS (2000), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests Approved standard, seventh edition edn Pennsylvania, USA: The National Committe for Clinical Laboratory Standards, p 5-10 62 Nielsen B and Wegener H.C (1997), “Public health and pork and fork products: regional perspectives of Denmark” Rev Sci Tech, 16, p 89 513-524 63 Nusera D.M, Maddox C.W, Hoien-Dalen P and Weigel R.M (2006), “Comparison of API 20E and invA PCR for identification of Salmonella enterica isolates from swine production units” J Clin Microbiol, 44, p 3388-3390 64 Peteron J.W (1980), “Salmonella toxin” Pharm Ather, VII, p 719-724 65 Plonait H, Bickhardt (1997), Salmonella infectionand Salmonella lehrbuchder Schweine Krankheiten Parey Buchverlag, Berlin, p 334 – 338 66 Popoff M.Y (2001), Antigenic formulas of the Salmonella serovas , 8th edition WHO Collaborating Centre for reference and Research on Salmonella Institus Pasteur, Paris, France, p 156 67 Pritchett L.C, Konkel M.E, Gay J.M and Besser T.E (2000), “Identification of DT 104 and U 302 phage types among Salmonella enterica serotype Typhimurium isolates by PCR” J Clin Microbiol, 38, p 3484-3488 68 Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England, p 209236 69 Rahman K, De Grandis S.A, Clarke R.C, McEwen S.A, Galán J.E, Ginocchio C, Curtiss III R and Gyles C.L (1992), “Amplification of a invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of Salmonella” Mol Cell Probes, 6, p 271-279 70 Saitoh M, Tanaka K, Nishimori K, Makino S, Kanno T, Ishihara R, Hatama S, Kitano R, Kishima M, Sameshima T, Akiba M, Nakazawa M, Yokomizo Y and Uchida I (2005), “The artAB genes encode a putative ADP- ribosyltransferase toxin homologue associated with Salmonella enterica serova Typhimurium DT104” Microbiology , 151, p 3089-3096 90 71 Schwartz K.J (1999), “Salmonellosis” In: Straw, B E., S D Allaire, W L Mengeling, and D J Taylo (eds), Disease of Swine, p 535-551 Iowa State University Press, Ames 72 Selbitz H.J (1995), Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren Berl Much Tieruzl Wschr, 144, p 428-423 73 Skyberg J.A, Logue C.M and Nolan L.K (2006),“Virulence genotyping of Salmonella spp with multiplex PCR“ Avian Dis, 50, p 77-81 74 Su L.H, Chiu C.H, Kuo A.J, Chia J.H, Sun C.F, Leu H.S and Wu T.L (2001), “Secular trends in incidence and antimicrobial resistance among clinical isolates of Salmonella at a university hospital in Taiwan, 19831999” Epidemiol Infect, 127, p 207-213 75 Suzuki S, Komase K, Matsui H, Abe A, Kawahara K, Tamura Y, Kijima M, Danbara H, Nakamura M and Sato S (1994), “Virulence region of plasmid pNL2001 of Salmonella enteritidis” Microbiology, 140, p 1307-1318 76 Timoney J.F, Gillespie J.H, Baelough J.E, Hagan and Bruner’s (1988), “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press, p 209-230 77 Tsolis R.M, Adams L.G, Fitcht T.A and Baumler A.J (1999), “Contribution of Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence factors to diarrheal disease in calves Infect” Immun, 67, p 1879-1885 78 Valtonen M.V (1977), “Role of phagocytosis in mouse virulence of Salmonella typhimurium recombinmant with O- antigen 6, or 4, 12.” Infect Immun, 18, p 574 79 Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R, Osrien A.D (1984), “Flagella help Samonella typhimurium survive within murine macrophages” Infection 91 and Immuniti, 46 p 819-825 80 Wilcock B.P, Schwartz K.J (1992), “Salmonella” Disease of Swine, 7th Edition, p 570-583 81 Wilcock B.P (1995), “Salmonellosis” Disease of Swine, Sixth Edition, Iowa state University Press, U.S.A, p 508-518 92 ... Phân lập vi khuẩn Salmonella từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi số tỉnh phía Bắc xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella quan phủ tạng lợn bệnh 3.1.2 Xác định số đặc tính sinh vật hóa học, ... bệnh có hiệu ln vi? ??c làm cấp thiết Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu yêu cầu sản xuất, tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Salmonella phân lập ñược từ lợn sau. .. sau cai sữa bị tiêu chảy chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh" 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, xác định hình thái, tính chất ni cấy, đặc tính sinh vật hóa học, serotyp yếu tố gây bệnh vi khuẩn