Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ

... tài: Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi sinh vật có khả phân hủy cellulose rơm rạ Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học số chủng vi sinh vật có khả phân hủy cellulose rơm rạ Nội... dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu số tính chất chất (rơm, rạ) kiểm tra khả sinh enzyme phân giải cellulose chủng vsv nghiên cứu 3.2 .Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả phân hủy cellulose. .. dụng 10 chủng vsv tuyển chọn cho nghiên cứu Hình 3.1 Hoạt tính cellulase số chủng vsv nghiên cứu 3.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả phân hủy cellulose rơm rạ 3.2.1 Đặc điểm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG RƠM RẠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô, chuyên viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật,

tổ Thưc vật – Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận trong thời gian qua

Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn nghiên cứu tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè luôn sát cánh, động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đề tài “ Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của

chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy Cellulose trong rơm rạ” là do em

thực hiện Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống

kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào đã công bố Trong đề tài em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 2

4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

5 Điểm mới của đề tài 3

CHƯỚNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 4

1.1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose 4

1.1.2 Vi sinh vật phân hủy hemicellulose 6

1.1.3 Vi sinh vật phân hủy lignin 6

1.2 Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam 7

1.3 Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 8

1.3.1 Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên 8

1.3.2 Cellulose 8

1.3.3 Hemicellulose 10

1.3.4 Lignin 10

1.3.5 Cơ chế chuyển hóa lignocellulose 11

1.4 Thành phần chính của rơm rạ 14

1.5 Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 14

1.5.1 Trên thế giới 14

1.5.2 Ở Việt Nam 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Hóa chất, thiết bị 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Thiết bị 16

2.3 Các loại môi trường nuôi cấy 16

2.3.1 Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA 16

2.3.2 Môi trường giữ giống xạ khuẩn Gauze I 17

2.3.4 Môi trường giữ giống nấm mốc Crapeckdox 17

2.3.5 Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp vi sinh học 17

2.4.2 Phương pháp hóa sinh 19

2.4.3 Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu 23

2.6 Địa điểm thực hiện đề tài 23

2.7 Thời gian thực hiện đề tài 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu 24

3.1.1 Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu 24

3.1.2 Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các

chủng vsv nghiên cứu 25

3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 26

3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 26

3.1.2 Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn 28

3.2.3 Đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc 29

3.3 Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu 30

3.3.1 Đồ thị đường chuẩn 30

3.3.2 Hoạt độ enzyme của các chủng vsv nghiên cứu 32

3.4 Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng vi sinh vật nghiên cứu 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

1 Kết luận 37

2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ 14

Bảng 1.2 Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ 14

Bảng 2.1 Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose 17

Bảng 3.1 Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu 25

Bảng 3.2 Hoạt độ enzyme của tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu 32

Bảng 3.3 Vi sinh vật bổ sung vào mỗi khối ủ thí nghiệm 34

Bảng 3.4 Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ 35

Bảng 3.5 Độ giảm khối lượng của các khối ủ sau 32 ngày 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử cellulose 9

Hình 3.1 Hoạt tính của một số chủng tuyển chọn 26

Hình 3.2 Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường MPA 27 Hình 3.3 Hình thái tế bào các chủng vi sinh vật nghiên cứu (x1000) 27

Hình 3.4 Khuẩn lạc xạ khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi soi nổi 28

Hình 3.5 Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn (x 1000) 29

Hình 3.6 Khuẩn lạc các chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa 29

Hình 3.7 Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC 31

Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất bột giấy 31

Hình 3.9 Khối ủ thí nghiệm và đối chứng sau khi phối trộn nguyên liệu 33

và bổ sung giống vi sinh vật 33

Hình 3.10 Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ lớn 35

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lúa gạo cung cấp nguồn lương thực chính cho nhu cầu tiêu dùng của người dân và xuất khẩu Tuy nhiên ngoài sản phẩm chính là thóc, rơm rạ còn chiếm đến 50% trọng lượng của cây lúa do vậy sản xuất lúa còn tạo ra lượng rơm rạ khổng lồ Những năm gần đây cơ giới hóa khâu làm đất phát triển, số lượng trâu, bò nuôi giảm mạnh, việc sử dụng rơm làm thức ăn cho trâu, bò cũng giảm theo, rơm, rạ cũng không còn được sử dụng làm chất đốt Mặt khác, rơm

rạ sau khi thu hoạch không thể vùi trực tiếp vào trong đất vì tỉ số C/N của chúng rất cao, trong điều kiện ngập nước sẽ sản sinh ra khí độc gây ra hiện tượng vàng

lá nghẹt rễ, cây trồng sẽ không phát triển được hoặc chết và đất đai ngày càng suy giảm độ phì nhiêu Nguồn rơm, rạ dư thừa sau mỗi vụ thu hoạch không tìm được cách sử dụng hợp lý nên đã được nông dân tự xử lý bằng biện pháp đốt cháy ngay tại đồng ruộng Hậu quả là phá vỡ sự cân bằng tự nhiên, ô nhiễm không khí

Phân hữu cơ chủ yếu được sử dụng hiện nay là phân chuồng, loại phân này nếu ủ theo phương pháp truyền thống mất thời gian từ 55 - 60 ngày, quá trình ủ gây ra mùi hôi thối khó chịu Nhiều lúc người dân bón phân tươi, chưa được xử lý các vi sinh vật có hại Thông qua con đường này đã đưa các các chủng nấm, vi sinh có hại vào đất, gây nên một số bệnh hại cho cây trồng và ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất, tiêu dùng Theo thống kê của các nhà khoa học lượng rơm, rạ thu được từ 1ha lúa là 5 đến 7 tấn/năm Bình quân lượng rơm rạ thu được từ 1ha lúa có: 51,5 kg N; 25,4 kg P2O5; 137,4 kg K2O và các nguyên tố vi lượng Trước thực trạng đó, một giải pháp để xử lý các phụ phẩm nông nghiệp này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ Rơm rạ có thành phần chính là cellulose, bên cạnh đó còn có lignin và hemicellulose Trong tự nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có

khả năng phân giải cellulose, lignin và hemicellulose nhờ có hệ enzyme ngoại

bào Do đó tôi chọn đề tài:“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi

sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu

3.2.Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ

3.3 Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu

3.4 Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng

vi sinh vật nghiên cứu

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài nhằm nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu

về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam

4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Việc nghiên cứu này nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để xử lý nhanh rơm rạ, rút ngắn quá trình ủ, nhằm hạn chế nguồn sâu bệnh, tạo nguồn phân bón hữu cơ từ rơm rạ, bón trở lại cho ruộng đồng, góp phần nâng cao dinh dưỡng đất, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

5 Điểm mới của đề tài

Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát có hoạt độ enzyme cellulase của một số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase được phân lập, tuyển chọn trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện

Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose

1.1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose

Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô

cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn

a) Nấm sợi

Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh

ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn [9]

Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài

loại enzyme Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis, Aspergillus

wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger [8]

Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính cellulase của dịch lọc lại thấp Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9]

b) Vi khuẩn

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose Những năm đầu thế kỷ XX (1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng

này Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một

vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế

bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga,

Sporocytophaga và Sorangium Niêm vi khuẩn nhận năng lượng khi oxy hoá

các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [9]

Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân

huỷ cellulose Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống

Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose Chúng phát triển yếu trên

môi trường chứa đường đơn Khi phân giải cellulose thành glucose và xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O

Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt Chúng

có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm Các vi sinh vật đó thường

là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens,

Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium [9]

c) Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí Dựa vào đặc điểm về nhiệt

độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:

Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300

Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân

cellulose Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường Bào tử

của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi

và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9]

Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose

và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl Mandels và cộng tác viên

nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng Streptomyces

antibioticus và Streptomyces sp với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C

và pH tối thích là 5,9 [9]

1.1.2 Vi sinh vật phân hủy hemicellulose

Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan

là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên Các tác giả cho rằng nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả hemicellulase

Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes,

Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium

Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp

xylanase Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus

oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium [11]

1.1.3 Vi sinh vật phân hủy lignin

Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm Các vi sinh vật phân giải lignin thường

là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis,

Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như: Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus [12]

1.2 Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam

Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn rơm Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến

bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt Vì thế, rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân đốt thành tro Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh đường hô hấp

Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc

ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ dàng Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác Máy ép rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố

Hồ Chí Minh Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được

áp dụng rất ít ở nước ta

Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ lá xanh, mượt,

cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh cho cây trồng Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo

vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội

1.3 Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên

1.3.1 Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên

Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012

tấn Trong đó cellulose chiếm khoảng 4.1010

tấn Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác

Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ nhà bếp, đường phố Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng [6], [7], [9]

1.3.2 Cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật Thông thường, cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất của chúng ta Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất khác như hemicellulose, lignin, pectin các chất này liên kết với nhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose Trong đó, cellulose

và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất Hai chất này được bao bọc bởi một lượng lignin Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật

Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose Các gốc này nối với nhau nhờ liên

kết β-1,4-glucozit Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000 Các đơn phân glucoza trong cellulose thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1) Trong công thức phối cảnh, biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc 180o

so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11]

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử cellulose

Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được rằng phân tử cellulose có dạng sợi Các sợi này của cellulose lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài Vùng vô định hình

có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn

Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi [7]

Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất

có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ phân cellulose [9]

1.3.3 Hemicellulose

Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với cellulose Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường Các gốc đường được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit Chúng tạo thành mạch ngắn

và phân nhánh

Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng Đôi khi hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzyme hemicellulase

Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng (20

- 30%) ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11]

1.3.4 Lignin

Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và C-

C Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7]

Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác

từ bên ngoài Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần Lignin rất bền đối với tác dụng của các

enzyme Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất

Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose Thành phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và thành phần hoá học Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11]

1.3.5 Cơ chế chuyển hóa lignocellulose

Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme Các cấu phần hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ

Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên để

có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzyme tương ứng Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy Muốn chuyển hoá được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau

1.3.5.1 Enzyme và cơ chế thủy phân lignocellulose

a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase

Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một

số tác giả tổng kết khá chi tiết Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân cellulose tạo

ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât Nhiều tác giả cho rằng phức

hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:

Exo-β(1,4)-glucanasehay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt chuỗi

cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza Enzyme này không thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl cellulose) nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch Có lẽ vai trò chính của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên được cellulose kết tinh

Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 β-D-glucano-hydrolaza): Enzyme

này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử cellulose một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và glucose Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose Chính nhờ sự phân cắt trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzyme xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose kết tinh

Enzyme β-1,4-glucozidasehay xenlobiase: Đây là những enzyme rất đặc

hiệu β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucose Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase Tuy nhiên theo một số tác giả

cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra theo một trật tự khác nhau

b) Cơ chế thuỷ phân cellulose

Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động trương nở

có mạch ngắn hơn Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9]

Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đó exoglucanose sẽ cắt

ra tạo thành những đoạn xenlobiose Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch ngắn, xelobiose, glucose Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucose

Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzyme C1 và Cx Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính Sau đó enzyme endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose Ông cho rằng sự thuỷ

phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase, enxoglucanase và xenlobiase

Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân cellulose nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn toàn thống nhất

1.3.5.2 Enzyme và cơ chế thủy phân hemicellulose

Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế tác động Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm khác biệt:Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với cellulose Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose do đó hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song song với quá trình phân giải cellulose [7]

1.3.5.3 Enzyme và cơ chế thủy phân lignin

Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninase Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là một quá trình trao đổi chất thứ cấp Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ Nếu thêm nitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin Ligninase không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ Mặt khác ligninase lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin

1.4 Thành phần chính của rơm rạ

Tại thời điểm thu hoạch, hàm lượng ẩm của rơm rạ thường cao tới 60%, tuy nhiên trong điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ có thể trở nên khô nhanh đạt đến trạng thái độ ẩm cân bằng vào khoảng 10 - 12% Rơm rạ, có hàm lượng tro cao và lượng protein thấp [13] Trong rơm rạ chứa lượng lớn các chất hóa học

và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2 và 1.3 [14]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ

Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là Nitragin Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ ( 1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914)

Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do

Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp họ Đậu Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh

cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích

khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp , Azotobacter

spp , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hoặc một số chủng vi

sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan, cây trồng có thể hấp thụ được

1.5.2 Ở Việt Nam

Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân

đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân [5]

Nhiều loại phân HCVS đã được nghiên cứu sản xuất và được ộ N ng

nghiệp và hát triển n ng th n công nhận là tiến bộ kỹ thuật Theo ước tính của Cục Tr ng trọt, lượng phân HCVS sản xuất trong năm 2008 có trên 100 loại với

khoảng 1,2 triệu tấn, bước đầu tham gia vào sản xuất nông nghiệp theo hướng hữu cơ Thị trường cho các sản phẩm dạng này đang dần được mở rộng, trong

đó ứng dụng nhiều nhất là các vùng đất cơ giới nhẹ, các vùng trồng rau tập trung như Lâm Đồng, vùng ven Hà Nội và những vùng trồng các loại cây có giá trị kinh tế cao như cà phê, hồ tiêu, thanh long