5. Điểm mới của đề tài
2.4.2. Phương pháp hóa sinh
2.4.2.1. hương pháp định lượng hoạt độ enzyme cellulose theo phương pháp DNS (Miller, 1959)
* Xác định hoạt độ Endoglucanase:
a. Lập đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC
Nguyên lý: CMC-ase phân cắt CMC thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
Tiến hành thí nghiệm:
Pha dung dịch cơ chất: Dung dịch 0,5% CMC trong đệm 50mM Na-acetat. Dung dịch thuốc thử DNS: Hòa tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H20, 10g DNS, khuấy đều cho các hóa chất tan hoàn toàn. Bổ sung nước cất để đạt 1000ml
Pha dung dịch mẹ 10µmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loãng thành các nồng độ: 0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml).
Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450µl dịch 0,5% CMC + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước
20
sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel.
b. Xác định hoạt tính Endoglucanase:
Mẫu thí nghiệm: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút, sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút.
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540mm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định.
Quy ước: Một đơn vị hoạt tính CMC-ase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
* Thí nghiệm xác định hoạt tính Exoglucanase:
a. Lập đồ thị đường chuẩn đối với cơ chất giấy lọc:
Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên (0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml)) + 450µl dịch 0,5% giấy lọc + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình
Microsoft Excel.
b. Xác định hoạt tính exoglucanase:
Mẫu thí nghiệm: 450ml dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500C trong 1 giờ. Sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 +750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500
C trong 1 giờ.
21
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm trong 5 phút, làm nguội bằng nước lạnh. Li tâm 4000v/phút trong 5 phút. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540mm. Từ giá trị OD tính được lượng đường khử nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định.
2.4.2.2. hương pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm, được biểu thị bằng tỷ số phần trăm giữa khối lượng nước có trong mẫu bay hơi sau khi sấy đến khô tuyệt đối với khối lượng mẫu trước khi sấy (ký hiệu A%).Mẫu sấy khô tuyệt đối, được biểu thị bằng tỷ số giữa mẫu trước khi sấy và sau sấy đến khối lượng không đổi.
Tiến hành
Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị chén cân: Sấy chén cân trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 C trong 1
h, sau đó đặt chén vào bình hút ẩm, đậy nắp lại, để nguội về nhiệt độ phòng.
Cân chén trên cân , ghi lại kết quả khối lượng chén cân (mc).
Cân mẫu trước khi sấy: Cân khoảng 5 g đến 10 g mẫu phân bón (mt) bằng cân vào chén cân đã biết khối lượng, ghi lại kết quả khối lượng của chén cân có mẫu (mc + mt). Đậy nắp chén.
Sấy mẫu: Đặt chén cân đã có mẫu vào tủ sấy , mở nắp chén, sấy khô mẫu ở nhiệt độ thích hợp theo trong thời gian 3 h đến 4 h. Sau đó đậy nắp chén lại, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội về nhiệt độ phòng.
Cân mẫu sau khi sấy: Cân lần thứ nhất sau khi tiến hành sấy mẫu , ghi kết quả (mc + ms). Cân lần thứ hai, tiếp tục sấy mẫu như trong thời gian 2 h đến 3 h, cân mẫu sau sấy khi kết quả (mc + ms).
Tính kết quả: Độ ẩm của mẫu phân bón tính theo phần trăm khối lượng được tính theo công thức sau:
100 m ) m m ( % A t s t
22
Trong đó: mc khối lượng chén sau khi đã sấy ở nhiệt độ 105 C (g); mt khối lượng của mẫu trước khi sấy (g);
ms khối lượng của mẫu sau khi sấy), tính bằng (g).
2.4.2.3. hương pháp xác định hoạt tính sinh enzyme phân hủy Cellulose của các chủng nghiên cứu
Trang chủng vi sinh vật trên môi trường thích hợp: môi trường MPA dùng cho vi khuẩn, Gauze – I dùng cho xạ khuẩn, Czapekdox dùng cho nấm mốc các môi trường này được đổ với độ dày đồng đều 3mm (25ml/1 đĩa petri). Các môi trường thử hoạt tính cũng được đổ với độ dày đồng đều 3mm.
Tiến hành:
Nhỏ 100µl nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa thạch chứa môi trường thích hợp nuôi cấy vi sinh vật. Dùng que cấy lấy một đầu que cấy sinh khối chủng vi sinh vật cần tuyển chọn hòa đều vào giọt nước muối sinh lý, sau đó trang đều và để tủ ấm ở 300C cho đến khi vi sinh vật mọc kín đĩa thạch (24 – 36h đối với vi khuẩn, 48 – 72h đối với nấm mốc, 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn).
Dùng khoan nút chai (có đường kính d = 5mm hoặc d = 10mm), khoan các khối thạch trên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi sinh vật. Đặt úp các khối thạch này lên mặt thạch của các môi trường thử hoạt tính (có chứa cơ chất CMC, bột giấy), sao cho bề mặt có sinh khối vi sinh vật của khối thạch nằm tiếp giáp với mặt thạch của môi trường thử hoạt tính. Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần đối với mỗi chủng vi sinh vật nghiên cứu và với mỗi loại cơ chất khác nhau.
Các đĩa petri thử hoạt tính được ủ trong tủ lạnh 40C trong 12h, rồi nuôi trong tủ ấm 300
C trong 12 - 24h.
Kiểm tra hoạt tính enzyme trên đĩa thạch chứa cơ chất:
Môi trường CMC và bột giấy: Thử hoạt tính enzyme cellulase bằng dung dịch côngô đỏ 1% : Ngâm đĩa petri thử hoạt tính trong dung dịch côngô đỏ trong 30 phút, sau đó đổ bỏ côngô đỏ đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối
23
NaCl 1M trong 15 phút rồi đổ bỏ dung dịch muối đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối như vậy trong 15 phút. Vùng không bị phân giải sẽ có màu đỏ của côngô đỏ, vùng bị phân giải có màu vàng, tiến hành đo đường kính vòng phân giải.
