5. Điểm mới của đề tài
2.3.5. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng
Môi trường CMC Môi trường bột giấy
CMC : 5g Thạch agar : 20g Nước : 1000ml; Bột giấy : 5g Thạch agar : 20g Nước : 1000ml
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp vi sinh học
2.4.1.1. hương pháp cấy truyền và bảo quản giống
Giữ giống và cấy truyền định kỳ hàng tháng trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30ºC 1 ngày đối với vi khuẩn, từ 7 - 12 ngày nuôi cấy mẫu xạ khuẩn và nấm mốc, chuyển sang để ở tủ lạnh nhiệt độ 2 - 40C. Cấy truyền định kì 2 tháng 1 lần trên môi trường phù hợp với từng nhóm VSV. Trước khi sử dụng giống cần hoạt hóa giống [1].
2.4.1.2. hương pháp m tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn
Cấy vi khuẩn theo hình dích dắc trên môi trường MPA, ủ ở 30 ºC trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc
18
riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc.Làm tiêu bản nhuộm đơn, tiêu bản nhuộm Gram, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên kính hiển vi quang học.
2.4.1.2. hương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn Quan sát hình thái của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh…
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen nghiêng 45ºC trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira). [12]
2.4.1.3. hương pháp quan sát hình thái nấm mốc
* hương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên m i trường Crapek-Dox để nghiên cứu đặc điểm vĩ m .
Để hạn chế hiện tượng bào tử nấm phát tán và mọc lan trên bề mặt đĩa thạch, úp ngược, đánh dấu lại và không lật đĩa thạch lên, cứ thế đem nuôi ở 300C trong 7 ngày. Sau đó tiến hành quan sát và chụp hình, mô tả các đặc điểm của nấm bằng mắt thường hoặc kính hiển vi soi nổi.
19
Màu sắc bào tử: chính là màu sắc của bông nấm đây là đặc điểm quan trọng để phân loại nấm.
Màu sắc hệ sợi: Thường có màu trắng nhưng một số loài có màu khác. Màu của mặt sau khuẩn lạc: là màu sắc quan sát được phía dưới khuẩn lạc bằng cách nhìn phía dưới đĩa thạch.
* hương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi m (Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad àn Filtenborg, 1996)
Đổ môi trường định loại nghiên cứu vào các hộp lồng sao cho có độ dầy đạt gần 1mm, dùng khoan nút chai khoan lấy các khối thạch. Đặt hai khối thạch ở 2 điểm cách đều nhau trên một lam kính, cấy bào tử lên khối thạch. Đậy lamen lên từng khối thạch, sau đó quan sát theo dõi sự phát triển của hệ sợi, các hạch nấm bằng kính hiển vi.
2.4.2. Phương pháp hóa sinh
2.4.2.1. hương pháp định lượng hoạt độ enzyme cellulose theo phương pháp DNS (Miller, 1959)
* Xác định hoạt độ Endoglucanase:
a. Lập đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC
Nguyên lý: CMC-ase phân cắt CMC thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
Tiến hành thí nghiệm:
Pha dung dịch cơ chất: Dung dịch 0,5% CMC trong đệm 50mM Na-acetat. Dung dịch thuốc thử DNS: Hòa tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H20, 10g DNS, khuấy đều cho các hóa chất tan hoàn toàn. Bổ sung nước cất để đạt 1000ml
Pha dung dịch mẹ 10µmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loãng thành các nồng độ: 0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml).
Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450µl dịch 0,5% CMC + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước
20
sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel.
b. Xác định hoạt tính Endoglucanase:
Mẫu thí nghiệm: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút, sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút.
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540mm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định.
Quy ước: Một đơn vị hoạt tính CMC-ase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
* Thí nghiệm xác định hoạt tính Exoglucanase:
a. Lập đồ thị đường chuẩn đối với cơ chất giấy lọc:
Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên (0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml)) + 450µl dịch 0,5% giấy lọc + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình
Microsoft Excel.
b. Xác định hoạt tính exoglucanase:
Mẫu thí nghiệm: 450ml dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500C trong 1 giờ. Sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 +750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500
C trong 1 giờ.
21
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm trong 5 phút, làm nguội bằng nước lạnh. Li tâm 4000v/phút trong 5 phút. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540mm. Từ giá trị OD tính được lượng đường khử nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định.
2.4.2.2. hương pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm, được biểu thị bằng tỷ số phần trăm giữa khối lượng nước có trong mẫu bay hơi sau khi sấy đến khô tuyệt đối với khối lượng mẫu trước khi sấy (ký hiệu A%).Mẫu sấy khô tuyệt đối, được biểu thị bằng tỷ số giữa mẫu trước khi sấy và sau sấy đến khối lượng không đổi.
Tiến hành
Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị chén cân: Sấy chén cân trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 C trong 1 h, sau đó đặt chén vào bình hút ẩm, đậy nắp lại, để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chén trên cân , ghi lại kết quả khối lượng chén cân (mc).
Cân mẫu trước khi sấy: Cân khoảng 5 g đến 10 g mẫu phân bón (mt) bằng cân vào chén cân đã biết khối lượng, ghi lại kết quả khối lượng của chén cân có mẫu (mc + mt). Đậy nắp chén.
Sấy mẫu: Đặt chén cân đã có mẫu vào tủ sấy , mở nắp chén, sấy khô mẫu ở nhiệt độ thích hợp theo trong thời gian 3 h đến 4 h. Sau đó đậy nắp chén lại, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội về nhiệt độ phòng.
Cân mẫu sau khi sấy: Cân lần thứ nhất sau khi tiến hành sấy mẫu , ghi kết quả (mc + ms). Cân lần thứ hai, tiếp tục sấy mẫu như trong thời gian 2 h đến 3 h, cân mẫu sau sấy khi kết quả (mc + ms).
Tính kết quả: Độ ẩm của mẫu phân bón tính theo phần trăm khối lượng được tính theo công thức sau:
100 m ) m m ( % A t s t
22
Trong đó: mc khối lượng chén sau khi đã sấy ở nhiệt độ 105 C (g); mt khối lượng của mẫu trước khi sấy (g);
ms khối lượng của mẫu sau khi sấy), tính bằng (g).
2.4.2.3. hương pháp xác định hoạt tính sinh enzyme phân hủy Cellulose của các chủng nghiên cứu
Trang chủng vi sinh vật trên môi trường thích hợp: môi trường MPA dùng cho vi khuẩn, Gauze – I dùng cho xạ khuẩn, Czapekdox dùng cho nấm mốc các môi trường này được đổ với độ dày đồng đều 3mm (25ml/1 đĩa petri). Các môi trường thử hoạt tính cũng được đổ với độ dày đồng đều 3mm.
Tiến hành:
Nhỏ 100µl nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa thạch chứa môi trường thích hợp nuôi cấy vi sinh vật. Dùng que cấy lấy một đầu que cấy sinh khối chủng vi sinh vật cần tuyển chọn hòa đều vào giọt nước muối sinh lý, sau đó trang đều và để tủ ấm ở 300C cho đến khi vi sinh vật mọc kín đĩa thạch (24 – 36h đối với vi khuẩn, 48 – 72h đối với nấm mốc, 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn).
Dùng khoan nút chai (có đường kính d = 5mm hoặc d = 10mm), khoan các khối thạch trên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi sinh vật. Đặt úp các khối thạch này lên mặt thạch của các môi trường thử hoạt tính (có chứa cơ chất CMC, bột giấy), sao cho bề mặt có sinh khối vi sinh vật của khối thạch nằm tiếp giáp với mặt thạch của môi trường thử hoạt tính. Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần đối với mỗi chủng vi sinh vật nghiên cứu và với mỗi loại cơ chất khác nhau.
Các đĩa petri thử hoạt tính được ủ trong tủ lạnh 40C trong 12h, rồi nuôi trong tủ ấm 300
C trong 12 - 24h.
Kiểm tra hoạt tính enzyme trên đĩa thạch chứa cơ chất:
Môi trường CMC và bột giấy: Thử hoạt tính enzyme cellulase bằng dung dịch côngô đỏ 1% : Ngâm đĩa petri thử hoạt tính trong dung dịch côngô đỏ trong 30 phút, sau đó đổ bỏ côngô đỏ đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối
23
NaCl 1M trong 15 phút rồi đổ bỏ dung dịch muối đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối như vậy trong 15 phút. Vùng không bị phân giải sẽ có màu đỏ của côngô đỏ, vùng bị phân giải có màu vàng, tiến hành đo đường kính vòng phân giải.
2.4.3. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu.
Tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp: Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại TN.
1 1 n i i X X n
Sai số đại diện của trung bình cộng: M = S n Hệ số biến thiên: Cv = S X x 100% Trong đó: n: Số lần nhắc lại Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.7. Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 05 năm 2015 tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
24
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu
3.1.1. Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu
Rơm rạ của mỗi loài lúa có các đặc tính khác nhau, cùng một loài lúa thì rơm rạ thu được ở mỗi vùng miền cũng có những đặc tính khác nhau, chúng tôi tiến hành xác định độ ẩm của cơ chất rơm rạ tươi và khô thu được trước khi sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Xác định độ ẩm của rơm tươi:Cân 20,012g rơm tươi cho vào đĩa petri, sấy ở 1050C trong 16h, đem cân lại, tiếp tục sấy 1h rồi bỏ ra cân lại, cứ làm như vậy cho tới khi cân thấy trọng lượng không đổi thu được rơm sấy có trọng lượng 4,577g
Hàm lượng nước trong nguyên liệu rơm tươi là:
% H20 –
x 100 = 69,92 %
Xác định độ ẩm của rơm khô (rơm phơi tự nhiên): Cân 2 phần bằng nhau 6,25g rơm cho vào đĩa petri, sấy ở 1050C trong 12h, đem cân lại, tiếp tục sấy 1h rồi bỏ ra cân lại, cứ làm như vậy cho tới khi cân thấy trọng lượng không đổi được 2 phần như sau:
Phần 1: 6,85g Phần 2: 5,85g
Hàm lượng nước trong nguyên liệu rơm phơi khô là: % H20 –
x 100 = 11,96 %
Như vậy xác định được độ ẩm trong cơ chất rơm tươi là 69,92%, độ ẩm của cơ chất rơm kh là 11,96%, việc này thuận lợi cho việc tính toán bổ sung hàm lượng nước trong các khối ủ rơm rạ thành phân hữu cơ.
25
3.1.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu
Rơm rạ có thành phần chính là cellulose do vậy để tuyển chọn được tổ hợp các chủng VSV hữu hiệu có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào các chủng VSV.Đối tượng là tập hợp 10 chủng vi sinh vật, trong đó có 3 chủng vi khuẩn là: V6, Uv2.23, Uv2.8; 3 chủng xạ khuẩn là: X4, X9, X10; 3 chủng nấm mốc là: M4, M16, M17, M21 đã được phân lập và tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) thông qua đề tài “ Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1:
Bảng 3.1. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu
STT Tên chủng Cellulose Phân loại Mẫu
CMC Bột giấy 1 V6 - 21.12 ± 0.4 VK (Ba Vì) 2 Uv2.8 - 17.89 ± 0.4 VK (Mê Linh) 3 Uv2.23 14 22.0 ± 0.4 VK (Mê Linh) 4 X4 - 8.67 ± 0.4 XK (Ba Vì) 5 X9 - 18.21 ± 0.4 XK (Tam Đảo) 6 X10 - 12.14 ± 0.4 XK (Tam Đảo) 7 M4 + 11.67 ± 0.4 NM (Tam Đảo) 8 M16 + 13.45 ± 0.4 NM (Mê Linh) 9 M17 22.03 ± 0.81 - NM (Tam Đảo) 10 M21 19.07 ± 0.81 9,33 ± 0.4 NM (Tam Đảo)
+ : Có hoạt tính rất yếu- : Không có hoạt tính
Kết quả kiểm tra xác định hoạt tính của các chủng vsv nghiên cứu cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose của các chủng VSV được
26
phân lập, tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) cao so với các nghiên cứu khác ở trong nước của các tác giả Kiều Ngọc Bích (2012), Trần Thị Xuân Hương (2013)và khá ổn định ở thời điểm kiểm tra hoạt tính chênh lệch không nhiều so với kết quả thử hoạt tính của nghiên cứu trước đó[14], phù hợp với mục đích nghiên cứu của đề tài. Trong đó, có 2 chủng vừa có hoạt tính với cơ chất CMC và bột giấy là chủng vi khuẩn Uv2.23 và chủng nấm mốc M21. Có 3 chủng có hoạt tính CMC là chủng vi khuẩn Uv2.23, nấm mốc M17, nấm mốc M21, và chủng có hoạt tính CMC cao nhất là nấm mốc M17(22.03 ± 0.81). Hầu hết các chủng có hoạt tính đối với cơ chất bột giấy, trong đó chủng vi khuẩn V6 có hoạt tính mạnh nhất (21.12 ± 0.4 mm). Dựa trên kết quả phân tích kiểm tra tính đối kháng trong 10 chủng không có chủng vsv nàođối kháng nhau có thể nuôi cấy trên cùng một môi tường cơ chất [14]; tôi quyết định lựa chọn 10 chủng vsv trên để thử nghiệm chuyển hóa cơ chất rơm rạ.
Khả năng sinh enzyme cellulose của 10 chủng vsv cao và ổn định, do vậy t i quyết định sử dụng 10 chủng vsv tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng vsv nghiên cứu
3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ phân hủy cellulose trong rơm rạ
3.2.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA, sau 24h quan sát hình thái khuẩn lạc mọc trên đĩa petri và tiến hành quan sát bằng mắt thường và