Phương pháp phân tích mẩu máu cá
Cá từ các bể thí nghiệm trước và sau khi cảm nhiễm được thu ngẫu nhiên 3 con/bể. Cá được dùng cồn (70%) sát trùng quanh khu vực lấy máu. Dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (Houston, 1990), lượng máu tối thiểu là 0,3ml. Nhỏ máu xuống lame, dùng pipet hút 10µl máu cho vào ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick để đếm hồng
A B
Hình 3.1 A. Bố trí thí nghiệm cho ăn; B. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm
cầu. Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác cho thao tác phết mẫu để đếm bạch cầu.
Phết mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước (Hình 3.2). Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008). Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh.
Hình 3.2 Thao tác lấy mẩu máu và trải mẫu (Đoàn Nhật Phương, 2006)
Phương pháp điếm hồng cầu
Cho 10µl máu vào ống nghiệm chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick. Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm. Thao tác phải nhanh từ 5- 15 giây để tránh hiện tượng máu bị đong lại. Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sư quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X. Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 buồng đếm, đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 4 ô lớn (1 ô lớn có 25 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm.
Công thức tính mật độ hồng cầu: R = C x 10 x 5 x 200 Trong đó: R: Mật độ hồng cầu (tb/mm3
)
C: tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm 14
10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm 5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2
Hình 3.3 Buồng đếm hồng cầu (C: 1 vùng đếm hồng cầu được phóng to)
Định tính và định lượng bạch cầu
Phương pháp nhuộm mẫu: Mẫu được nhuộm theo phương pháp Wright’s & Giemsa (Humason, 1979).
Máu sau khi lấy cho 1 giọt lên 1 đầu của lame và dùng lamelle đôi trải đều mẫu máu. Để khô mẫu và ngâm lame mẫu trong dung dịch methanol từ 1 – 2 phút để cố định mẫu. Sau đó để khô mẫu ở nhiệt độ phòng.
Các bước nhuộm mẫu: (1) nhuộm với dung dịch Wright trong 3 – 5 phút, (2) ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 – 6 phút, (3) nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút, (4) ngâm trong dung dịch pH 6.2 trong 15 – 30 phút, (5) rửa qua nước cất, để khô và đọc mẫu.
Quan sát dưới kinh hiển vi ở vật kính 100X và các loại tế bào bạch cầu sẽ được xác định theo Supranee et al (1991). Phương pháp định lượng các tế bào bạch cầu: (Supranee et al., 1991).
Tổng bạch cầu (TBC): Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu là 1500 tế bào trên mẫu nhuộm:
Số bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm
TBC(tb/mm3) =
Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm
Xác định từng loại bạch cầu: Đếm từng loại tế bào bạch cầu trong 200 tế bào. Mật độ từng loại(tb/mm3) = (số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC)/ 200