khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm
Chuẩn bị hệ thống bể: Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và Chlorin 200 ppm, phơi khô, cấp nước vào khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày trước khi thí nghiệm, bể được che kín, nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy, các dụng cụ thí nghiêm khác như: xô, ống sục khí, đá bọt….cũng được vệ sinh kỹ.
Cá thí nghiệm: Cá thát lát còm có kích cở từ 10- 12 cm, cá khỏe, phản ứng linh hoạt với tiếng động. Cá được mua từ các trại giống ở Hậu Giang, được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá.
Cho ăn thảo dược
Cho cá ăn 3 tuần với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được bố trí 40 con/bể, ngày cho ăn 2 lần.
NT 1: Đối chứng (Không thảo dược).
NT 2: Bổ sung thảo dược 1 (Lá ổi) với liều lượng 3ml/kg thức ăn.
NT 3: Bổ sung thảo dược 1 (Lá ổi) với liều lượng 6ml/kg thức ăn.
NT 4: Bổ sung thảo dược 2 (Cỏ mực) với nồng độ 3ml/kg thức ăn.
NT 5: Bổ sung thảo dược 2 (Cỏ mực) với nồng độ 6ml/kg thức ăn.
NT 6: Bổ sung thảo dược 3 (Diệp hạ châu) với nồng độ 3ml/kg thức ăn.
NT 7: Bổ sung thảo dược 3 (diệp hạ châu) với nồng độ 6ml/kg thức ăn.
Các liều lượng được pha với 100ml, cho vào bình phun sương, phun đều lên viên thức ăn, để khô tự nhiên và tiến hành cho cá ăn.
Thí nghiệm cảm nhiễm
Chuẩn bị vi khuẩn cảm nhiễm: Vi khuẩn gây cảm nhiễm được lấy từ đề tài cấp Tỉnh Hậu Giang về bệnh trên cá thát lát còm (Chitala chitala) và giải pháp phòng trị bệnh...Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C. Sau 24 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Khi có được vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 1-2 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30 mL BHI-B đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50 mL tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để rửa vi khuẩn (Lặp lại 2-3 lần). Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên cho vào khoảng 25mL dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn mẫu bằng máy vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn. OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 109 CFU/mL. Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ thí nghiệm cần thiết. Mật độ vi khuẩn của từng nghiệm thức được tái khẳng định bằng phương pháp trải dung dịch trên đĩa agar.
Bố trí thí nghiệm: Cá thí nghiệm được lấy từ 7 nghiệm thức có và không bổ sung thảo dược, cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức tiêm vi khuẩn với mật độ 103
CFU/ml, một nghiệm thức tiêm nước muối sinh lý đã tiệt trùng và một nghiệm thức không tiêm. Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ 10 con/bể. Cá được tiêm với nồng độ 0,1ml vi khuẩn cho mỗi con và tiêm ở gốc vi ngực của cá. Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi: Số lượng cá chết, thời điểm cá chết ở các mốc thời gian 6h, 9h, 12h, 15h, 18h và 21h và các dấu hiệu lâm sàng được ghi nhận trong suốt quá trình thí nghiệm. Nước được thay định kỳ 3 ngày/lần khoảng 30%. Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết, ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể cá.
Tái phân lập và định danh vi khuẩn
Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ, ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể. Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Sau 24 giờ ủ ở 28o
C quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TSA, nhuộm gram, khả năng di động của vi khuẩn. Kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn (Phụ lục 1).