Trong quá trình cảm nhiễm, khi cá bắt đầu chết tiến hành thu mẫu vi sinh những mẫu cá lờ đờ có dấu hiệu bệnh lý ở 7 nghiệm thức tiêm vi khuẩn
Aeromonas hydrophila (Không bổ sung thảo dược, cỏ mực 3ml, cỏ mực 6ml, diệp hạ châu 3ml, diệp hạ châu 6ml, lá ổi 3ml, lá ổi 6ml)
Khi hoàn tất lấy mẫu vi sinh của các nghiệm thức, ủ ở nhiệt độ 28-30oC, sau 24h tiến hành đọc kết quả, chọn ngẫu nhiên 2 nghiệm thức trong 7 nghiệm thức tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila để kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn như sau: Oxidase (+) , Catalase (+), vi khuẩn có khả năng di động, Gram (-) và có khả năng sử dụng đường glucose trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Kết quả phân lập và test các chỉ tiêu cơ bản 2 chủng vi khuẩn gây bệnh trên đàn cá cảm nhiễm có các chỉ tiêu tương đồng với kết quả test cơ bản vi khuẩn trước đó của Từ Thanh Dung (2008) ở bảng 2.1, Trần Thanh Phú (2009), Nguyễn Trọng Tín (2011). Có thể kết luận chủng vi khuẩn gây bệnh trên đàn cá cảm nhiễm là loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
A B
Hình 4.15 (A) Nhuộm Gram vi khuẩn A.hydrophila
Chương V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
Kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn A. hydrophila bằng hai phương pháp là (1) khuếch tán (2) đục lỗ trên đĩa thạch, trong đó chỉ có phương pháp (2) là có kết quả. Tính kháng khuẩn mạnh nhất là diệp hạ châu (15mm) ở nồng độ 50 và 100%.
Qua 3 tuần bổ sung thảo và cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila đã đạt được một số kết quả nhất định. Mật độ hồng cầu của cá tăng ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung thảo dược và giảm khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn
A.hydrophila, cao nhất là ở nghiệm thức có bổ sung cỏ mực 6ml. Tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân cũng có sự tăng nhanh ở tất cả các nghiệm thức bổ sung thảo dược trước và sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn A. hydrophila, tổng bạch cầu ở nghiệm thức cỏ mực 3ml và bạch cầu đơn nhân ở nghiệm thức diệp hạ châu 6ml là cao nhất. Đối với vi khuẩn A. hydrophila thì lá ổi không có tác dụng kháng khuẩn trực tiếp nhưng khi bổ sung vào thức ăn cho cá ăn thì có tác dụng kích hoạt được hệ miễn dịch và tăng khả năng đề kháng của cá.
Tỉ lệ chết của cá được tối ưu nhất là ở nghiệm thức có bổ sung cỏ mực 3ml và 6ml là 15% so với nghiệm thức không bổ sung thảo dược là 65%.
5.2 Đề xuất
Tìm hiểu một phương pháp chiết xuất mới nhằm tìm ra chính xác chất kháng khuẩn của một số loại thảo dược và không có lẫn tạp chất.
Tiếp tục bố trí thí nghiệm bổ sung thảo dược lâu hơn 3 tuần để biết được các chỉ tiêu huyết học này có tiếp tục tăng nửa hay không? và thu mẫu huyết học định kỳ hàng tuần để đánh giá được mức độ tăng của các chỉ tiêu huyết học.
Tài liệu tham khảo
Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên, 2006. Kết quả nghiên cứu chế phẩm ( VTS1-C) ( VTS1 – T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú và cá tra.
Chương trình “100 nghề cho nông dân”, Phạm Văn Khánh, Nghề nuôi cá thát lát còm và cá nàng hai, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2012.
Christybapita M. Divyagnaneswari R. Dinakaran Michael, 2007. Oral administration of Eclipta alba leaf aqueous extract enhances the non- specific immune responses and disease resistance of Oreochromis mossambicus. Fish and Shellfish Immunology. 840-852.
Direkbusarakom, S.; Herunsalee, A.; Yoshimizu, M.; Ezura,Y.; Kimura, T, 1997. Efficacy of Guava Extract Against Some Fish and Shrimp Pathogenic Agents.
Dương Nhựt Long, 2004. Giáo trình kỹ thuật nuôi cá nước ngọt. Khoa thủy sản. Trường ĐHCT.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương (2008) Giáo trình miễn dịch học động vật thủy sản. Khoa Thủy Sản, ĐHCT.
Đặng thị Hoàng Oanh và Trần Thị Yến Nhi, 2011. Ảnh hưởng của chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (Astragalus radix) lên một số chỉ tiêu miển dịch không đặc hiệu của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sabr lần 4. Trường Đại Học Cần Thơ. 278-288. Đặng Thị Hoàng Oanh. Sử dụng chất chiết xuất thảo dược để phòng bệnh nhiễm khuẩn ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ.
Đoàn Nhật Phương, 2006. Một số vấn đề huyết học trên cá. Bộ môn sinh học & bệnh thủy sản. Khoa thủy sản- Đại học Cần thơ.
Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr 282-283.
Đỗ Tất Lợi, 2006. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội.
Hà Ký và ctv, 1995. Phòng và trị bệnh cho tôm cá, Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN - 04 - 12, Hà Nội.
Huỳnh Thị Ngọc Thanh, 2012. Xác định đặc điểm bệnh học của bệnh đen thân trên cá rô đồng (Anabas testudineus). Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản, Khoa thủy sản - Đại học Cần Thơ.
Kannabiran Krishnan*, Venkatesan Gopiesh Khanna and Sahul Hameed, Published February 26, 2010. Antiviral Activity of Dasyscyphin C Extracted from Eclipta Prostrata Against Fish Nodavirus.
Nguyễn Chung, 2006. Quy trình kỹ thuật sản xuất giống và nuôi cá thát lát. NXB Đồng Nai.
Nguyễn Hoàng Nam, 2011. Ảnh hưởng chiết xuất từ cây Yucca và Quillaja đến chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
luận văn tốt nghiệp đại học ngành bệnh học thủy sản. Khoa thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thành Tâm, Nguyễn Gia Hoàng Diễm và Nguyễn Văn Bá, 2012. Tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của dịch chiết một số loại thảo dược. Khoa sinh học ứng dụng – Đại học Tây Đô. Thương mại thủy sản- số 152.
Nguyễn Thị Vân Thái và cộng tác viên, 2006. Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thủy sản.
Nguyễn Trọng Tín, 2011. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết. Luận văn tốt nghiệp ngành bệnh học thủy sản. Khoa thủy sản- Đai học Cần Thơ.
Phạm Minh Thành, Phạm Phú Hùng và Nguyễn Thanh Hiệu, 2008. Nghiên cứu sự thành thục trong ao và kích thích cá còm (Chitala chitala) sinh sản. Tạp chí khoa học quyển 2, Đại học Cần Thơ, 59-66.
Phạm Phú Hùng, 2007. Nghiên cứu biện pháp sản xuất giống cá thát lát còm (Chilata chitala), Luận văn cao học ngành Nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Phan Thị Hừng, 2004. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh vàng da. Luận văn đại học. Khoa thủy sản- Đại học Cần thơ.
Phan Vĩnh Thịnh, 2011. Ảnh hưởng chiết xuất của cây Yucca và cây Quillaja lên việc phòng bệnh ký sinh trùng và vi khuẩn trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm. luận văn tốt nghiệp đại học ngành bệnh học thủy sản. Khoa thủy sản -Đại học Cần Thơ. Robert, R.J., 1989. Fish pathology. 467pp
Supranee Chinabut, chalor Lisumwann, Praveena Kitsawat, 1991. Histology of the walking catfish Clarias batrachus. 96pp.
Từ Thanh Dung, 1996. The effect of selected herb extracts on Aeromonas hydrophila isolated from hydrid catfish (Clarias macrocephalus x C.gariepenus).
Trần Hồng Thủy, Nguyễn Trung Tính, Trần Ngọc Thiên Kim, Nguyễn Thành Nhân, 2013. Bước đầu nghiên cứu tác dụng dệt khuẩn của tỏi (Allium sativum L.) trong điều trị do Aeromonas hydrophila trên ếch thái lan (Rana tigerina). Tuyển tập hội nghị khoa học trẻ ngành thủy sản toàn quốc lần thứ 4, 482-488.
Trần Hồng Ửng, 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và moo tỳ tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bệnh trắng gan. Luận văn đại học. Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ.
Trần Thanh Phú, 2009. Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila
gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) nuôi ở ĐBSCL. Luận văn ngành bệnh học thủy sản. Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Yến Nhi, 2010. Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Trương Thị Mỹ Duyên, 2009. Nghiên cứu kiểu Plasmid và tính kháng thuốc
của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypopthalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại học, khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ.
Trương Thủ khoa và Trần Thị Thu Hương,1993. Định loài cá nước ngọt vùng ĐBSCL. khoa thủy sản - Đại học Cần Thơ.
Võ Thị An Hạ, 2010. Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây hoàng kỳ lên một số chỉ tiêu huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn A.hydrophila.
Yin. G, Xu. P, Váradi. L, Szigeti. G, Jeney. Z, Jenny. G, 2008. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica) and boron enhance the non- specific immune response of Nile tilapian
(Oreochromis noloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila Aquaculture 275; 26-33. http://idoc.vn/tai-lieu/co-so-khoa-hoc-cua-viec-su-dung-cay-thuoc-va-hop- chat-chiet-xuat-tu-thao-duoc.html http://tepbac.com/news/cat/n/7_Ky-thuat/14 http://www.rovetco.com/?act=news&detail=detail&news_id=534&cat_id=35 &cat_item_id=248&lang=vn
luanvan.net.vn/.../de-tai-nghien-cuu-thu-nghiem-mot-so-loai-thao-duoc-co- tac-dung-khang-khuan-tren-mot-so-loai-vi-khuan-phan-lap-duoc-t...
Phần phụ lục Phụ lục 1
CÁC CHỈ TIÊU VỀ SINH LÝ SINH HÓA CỦA VI KHUẨN 1. Chỉ tiêu về hình thái
Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc
Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc điểm sau:
- Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng sợi, dang rể cây, không có dạng cố định.
- Rìa khuẩn lạc: nguyên dạng, dạng thùy, dạng sợi. - Bề mặt khuẩn lạc: dạng đều, hơi lồi, lồi hình vòm. - Kích cở khuẩn lạc: chấm li ti, nhỏ, trung bình, lớn.
- Màu sắc khuẩn lạc: kem, trắng ( đục hay trong suốt), đen, cam,… - Tạo sắc tố (đổi màu môi trường) có hay không, sắc tố màu gì?
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram để quan sát hình dạng, kích thước và xác định vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm hay Gram dương.
Phương pháp:
- Sử dụng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý lên lame.
- Cho một ít vi khuẩn lên giọt nước muối trên lame và trải đều. để lame khô tự nhiên.
- Hơ lướt lame qua ngọn đèn cồn để cố định vi khuẩn. - Để lame nguội và tiến hành nhuộm.
- Nhuộm Crystal violet khoảng 1phút.
- Rửa lame bằng nước, nhuộm Iodine khoảng 1 phút.
- Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone khoảng 10 giây. - Rửa lại bằng nước và để khô.
- Nhuộm Safranine khoảng 2 phút, rửa lại bằng nước sạch và để khô. - Quan sat trên kính hiên vi quang học ở vật kính 40X và 100X có giọt
dầu.
Kết quả:
- Gram dương: màu xanh/tím. - Gram âm: đỏ/hồng.
2. Tính di động
Phương pháp
- Cho vasiline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. - Dùng nước muối tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle. - Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa tan vào nước
muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lên lamelle.
- Đặt lame lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 40X để kiểm tra tính di động của vi khuẩn.
3. Phản ứng Oxidase
Phương pháp
- Chạm nhẹ que thử vào một khuẩn lạc trên đỉa agar.
- Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc.
Kết quả: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng Oxydase dương tính (+) và không chuyển màu âm tính (-).
4. Phản ứng Catalase
Phương pháp
- Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame.
- Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2.
Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng Catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2 và ngược lại không sủi bọt thì phản ứng Catalase âm tính (-).
5. Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test)
Phương pháp
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F đã tiệt trùng. - Tiệt trùng que cấy thẳng và để nguội.
- Dùng đầu que cấy lấy vi khuẩn trên đỉa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm.
- Phủ lên 1 trong 2 nghiệm 0,5- 1ml dầu paraffin và đển vào tủ ấm ở nhiệt độ 28- 30oC.
- Kiểm tra hằng ngày đến 7 ngày. So sánh màu của 2 ống nghiệm và ghi nhận kết quả theo bang dưới đây.
Kết quả
Ống tiếp xúc không khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả
Xanh lá cây Xanh lá cây Không phản ứng với
glucose
Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính
Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hóa
Vàng Vàng Phản ứng lên men
6. Phản ứng Vogas-proskauer (VP)
Môi trường: MR-VP broth.
Thuốc thử: A: hòa tan 5g alpha naphthol trong 100ml ethyl alcohol B: hòa tan 40g KOH trong 100ml nước cất.
Phương pháp
- Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC.
- Sau 48 giờ nhỏ 0,6 ml thuốc thử A và 0,2 ml thuốc thử B vào trong ống nghiệm.
- Lắc điều và để nghiên ống nghiệm 30 phút.
Kết quả: môi trường chuyển màu hồng cho phản ứng (+) và ngược lại cho phản ứng (-).
7. Phản ứng tạo nitrite từ nitrate
Môi trường: Nitrate broth
Thuốc thử: A: hòa tan 0,8% sulphanilic acid trong 5-N acid acetic. B: hòa tan 0,5% alpha- napthylmin trong 5-N acid acetic.
Phương pháp
- Cho 3 ml môi trường NB vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C.
- Sau 48 giờ nhỏ 1 ml thuốc thử A và 1 ml thuốc thử B vào ống nghiệm.
Kết quả: môi trường chuyển màu đỏ trong vòng 1- 2 phút cho phản ứng (+) và ngược lại cho phản ứng (-).
8. Khả năng sử dụng Citrate
Môi trường: Simmon’s Citrate agar. Đun sôi và khuấy cho tan.
Phương pháp
- Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Để nghiên để tạo mặt phẳng nghiên trong ống nghiệm và để nguội. - Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiên của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 28oC.
Đọc kết quả sau 2- 7 ngày.
Kết quả
Vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường cho kết quả (+) và ngược lại cho phản ứng (-).
Phụ lục 2 Công thức pha một số hóa chất sử dụng
1. Dung dịch Natt & Herrick
NaCl: 3,88g Na2SO4: 2,5g Na2KHPO4.12H2O: 2,91g KH2PO4: 0,25g Forrmaline (37%): 7,5 ml Methyl violet 2B: 0,1g Nước cất: 1000 ml
Sau khi để yên trong bóng tối qua đêm thì tiến hành lọc qua mắc lưới 125µm
2. Dung dịch Wright
Hòa tan 1g Wright trong 600 ml methanol, khuấy liên tục qua đêm. Sau đó lọc qua mắc lưới 125µm
3. Dung dịch Giemsa
Hòa tan 3,8g Giemsa trong 25ml Glycerol và ủ ở 60oC trong 2 giờ. Sau đó cho thêm vào 75ml methanol. Dung dịch nhuộm sẽ được pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1 dung dịch gốc : 10 nước cất.
4. Dung dịch ph 6,2 – 6,8
Hòa tan 27,6g NaH2PO4 trong 1000 ml nước cất (1).
Hòa tan 53,6g Na2HPO4.7H2O trong 1000 ml nước cất (2).
Trộn (1) và (2) với tỉ lệ theo bảng sau để có dung dịch pH cần pha pH Dung dịch NaH2PO4 (ml) Dung dịch Na2HPO4.7H2O (ml)
5,9 90 10 6,1 85 15 6,3 77 23 6,5 68 32 6,7 57 43 6,9 45 55 7,1 33 67 7,3 23 77 7,4 19 81 7,5 16 54 7,7 10 90
5. Dung dịch ph 6,2
Hòa tan 19,212g acid citric ( C6H8O7) 0,1M trong 1000 ml nước cất (1). Hòa tan 28,396g Na2HPO4 trong 1000 ml nước cất (2).
Trộn 6,78 ml dung dịch (1) và 13,22 dung dịch (2). Chuẩn độ cho đến khi được dung dịch pH 6,2.
Phụ lục 3
Thông số huyết học của cá thát lát còm trong 3 tuần có và không bổ sung thảo dược
Nghiệm thức lặp lại (x10Hồng cầu 6 tb/mm3)
Tổng bạch cầu (x104tb/mm3) Bạch cầu đơn nhân