vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
Kiểm tra tính nhạy của thảo dược thực hiện bằng hai phương pháp như sau:
Phương pháp1: Khuếch tán trên đĩa thạch Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở nhiệt độ 28oC. Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ vi khuẩn là 109 CFU/mL. Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến nồng độ là 105CFU/ml.
Chuẩn bị đĩa giấy: Đĩa giấy có đường kính 6mm được sấy ở nhiệt độ 180oC. Sau đó được tẩm với nước muối sinh lý và các loại thảo dược (Diệp hạ châu, cỏ mực, lá ổi) ở các nồng độ 25, 50 và 100% khoảng 30 phút. Lấy để ra đĩa Petri phơi vừa khô ở nhiệt độ phòng. Tất cả các thao tác được làm trong điều kiện vô trùng.
Tiến hành thí nghiệm
Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch. Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch. Lấy pel tiệt trùng lấy đĩa giấy đã được tẩm thảo dược dán vào đĩa Petri (Mỗi nồng độ lặp lại 5 lần). Sau khi hoàn tất việc dán đĩa giấy đã được tẩm thảo dược, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 28o
C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) để xác định loại thảo dược nhạy, trung bình nhạy và kháng.
Phương pháp 2: Đục lỗ trên đĩa thạch
Sau khi chuẩn bị 90 ml môi trường thạch TSA, đã được tiệt trùng ở 121oC, để môi trường nguội dần còn khoảng 40-50oC. Cho 10ml dung dịch vi khuẩn
Aeromonas hydrophila ở mật độ 105 CFU/ml vào môi trường thạch.`Tiến hành đỗ môi trường có chứa dung dịch vi khuẩn ra đĩa Petri. Sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ trên đĩa thạch. Ở mỗi đĩa đục 4 lỗ, đường kính khoảng 5 mm/lỗ, trong đó 3 lỗ để chứa dịch chiết thảo dược ở các nồng độ 25, 50 và 100%, Lỗ còn lại để nước muối sinh lý. Cho vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch chiết (Lỗ đối chứng sử dụng nước muối sinh lý).
Tiến hành để đĩa thạch vào tủ lạnh khoảng 10 phút rồi đem ủ ở nhiệt độ 28oC (Mỗi nồng độ lặp lại 5 lần). Sau 24 giờ tiến hành xác định đường kính vòng tròn kháng khuẩn.