Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược đối với vi khuẩn streptococcus sp gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi vằn ( oreochromis niloticus) luận văn thạc sĩ sinh học

1 MỞ ĐẦU Cá Rô phi đối tượng nuôi thủy sản có nguồn gốc từ Châu Phi Nhưng ngày cá Rô phi nuôi Châu Phi mà phát tán nuôi nhiều nước giới, đặc biệt nước nhiệt đới cận nhiệt đới Trong vài chục năm trở lại chúng thực trở thành loài cá ni cơng nghiệp, có sản lượng lớn giá trị kinh tế cao Trong lồi ni phổ biến cá Rơ phi vằn (Oreochromis niloticus), có đặc điểm thịt trắng, chất lượng thơm ngon, suất cao, dễ ni, dịch bệnh, ni nhiều điều kiện mơi trường với nhiều hình thức ni khác Ở nước ta nghề nuôi cá Rô phi phát triển mạnh mẽ nhiều địa phương tương lai Việt Nam trở thành quốc gia xuất cá Rô phi chủ lực, hướng tới thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản số nước Châu Âu Dự kiến đến năm 2015, sản lượng cá rô phi đạt 150.000 tấn, tăng trưởng trung bình 7,9%/năm [46], [54] Cá rơ phi có sức đề kháng tốt ni với hình thức thâm canh bán thâm canh, với mật độ ao ni cao với tình trạng nước ao bị ô nhiễm thiếu ôxi nên cá thường mắc bệnh xuất huyết vi khuẩn Streptococcus sp gây Năm 2009, địa bàn tỉnh Hải Dương, Quảng Ninh, Hải Phòng, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hà Nội xuất hiện tượng cá chết hàng loạt Tại tỉnh Hải Dương tiến hành xét nghiệm mẫu bệnh phẩm cá thấy 7/7 mẫu bệnh phẩm nhiễm vi khuẩn Streptococcus sp Tuy loại bệnh thông thường, tâm lí chủ quan người dân nên gây thiệt hại lớn [32], [51] Sử dụng kháng sinh, hoá chất xem phương pháp truyền thống để điều trị bệnh xuất huyết vi khuẩn Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm người ni thuỷ sản khơng tính lượng thuốc hợp lí cần cho cá nên thường cho nhiều quá, dẫn đến vi khuẩn bị nhờn thuốc Mặt khác có nhiều cảnh báo việc sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh thuỷ sản, tác hại lâu dài sức khoẻ người, vật nuôi môi trường xung quanh Trước tình hình địi hỏi phải có giải pháp phòng trị bệnh động vật thuỷ sản nói chung, cá rơ phi vằn nói riêng nhằm thay loại hố chất, kháng sinh sử dụng Trong hướng nghiên cứu sử dụng thảo dược nhiều người quan tâm Việc sử dụng thảo dược để phòng trị bệnh cho thuỷ sản có nhiều ưu điểm như: giá thành rẻ, dễ sử dụng, an toàn thuỷ sản, người môi trường xung quanh Trên giới, số nước như: Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh, Thái lan, Thổ Nhĩ Kỳ có nghiên cứu thử nghiệm tác dụng số loại thảo dược số tác nhân gây bệnh số loại thủy sản Ở nước ta, năm gần nhà khoa học có số nghiên cứu thử nghiệm mức độ khác tác dụng số loại thảo dược như: trầu không, hẹ, tỏi, xoan, húng, … phòng trị bệnh cá chép, tôm sú, cá trắm cỏ, cá rô phi vằn,… Tuy nhiên có nhiều loại thảo dược chưa nghiên cứu nhiều tác nhân gây bệnh nhiều đối tượng khác Trong có cá rơ phi vằn với loại bệnh thường gặp bệnh xuất huyết vi khuẩn Streptococcus sp gây nên Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Đánh giá khả kháng khuẩn dịch ép số loại thảo dược vi khuẩn Streptococcus sp gây bệnh xuất huyết cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) ” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá, so sánh khả kháng vi khuẩn Streptococcus sp dịch ép số loại thảo dược thông dụng thảo dược với loại thuốc kháng sinh thường dùng Từ góp phần đẩy mạnh việc sử dụng thảo dược hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho thuỷ sản CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Chủng vi khuẩn Streptococcus sp Theo hệ thống phân loại Bergey (1974) [3], chủng vi khuẩn Streptococcus sp thuộc nhóm phân loại sau: Giới Sinh vật nhân nguyên thủy (Procaryota) Ngành Vi khuẩn (Bacteria) Nhóm Mycoplasma (tế bào khơng có dạng xoắn, khơng có thành tế bào) Lớp Mollieutes Bộ Chlamydiales Họ Streptococcaceae Giống Streptococcus - Đặc điểm sinh học: Streptococcus sp tên gọi chung cho loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus chưa định danh, có dạng hình cầu hình trứng, đường kính khoảng m , tạo thành dạng chuỗi ngắn dạng song cầu khuẩn Là vi khuẩn Gram dương, phần lớn Streptococcus yếm khí khơng bắt buộc Trong thạch sâu vi khuẩn mọc tất chiều cao ống môi trường [4], [38] - Đặc tính gây bệnh: Giống Streptococcus gồm nhiều nhóm khác nhau, có khả gây bệnh người, động vật số loài cá Ở người, 90% bệnh nhiễm khuẩn Streptococcus, như: bệnh tinh hồng nhiệt, viêm họng, viêm thận, bệnh viêm màng não trẻ sơ sinh,…v.v Ở động vật, Streptococcus gây bệnh viêm vú bò, nhiễm liên cầu khuẩn,…v.v [4] Vi khuẩn Streptococcus sp tác nhân chủ yếu gây bệnh xuất huyết cho nhiều loại cá khác (cá Diêu hồng, cá Rơ phi,…) Chúng có khả xâm nhập làm tổn thương não cá, theo máu đến làm tổn thương thận tỳ tạng Khi quan sát tiêu tươi mô gan, thận, tỳ tạng cá bệnh thấy chúng nằm rải rác tập trung thành đám vùng mơ phết kính bên cạnh tế bào biến dạng, cấu trúc rời rạc Mô thận tỳ tạng cá bệnh có dấu hiệu xung huyết, xuất huyết hoại tử [27] 1.1.2 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) - Vị trí phân loại sau: Lớp cá Xương (Actinopterygii) Bộ cá Vược (Perciformes) Họ cá Rơ phi vằn (Cichlidae) Lồi Rơ phi vằn (Oreochromis niloticus) - Đặc điểm: Cá rô phi vằn nuôi nhiều nước giới đặc biệt nước nhiệt đới cận nhiệt đới Chúng sống nhiều môi trường nước khác như: nước mặn, nước nước lợ; có biên độ nhiệt rộng; sống mơi trường có biên độ pH rộng từ 5-11, thích hợp từ 6,5-8,5; sống mơi trường thiếu ơxi có hàm lượng amoniac cao,… [50], [52] Thức ăn cá rô phi vằn đa dạng phong phú, từ loại thức ăn tự nhiên như: phù du, mùn bã hữu cơ, tảo, côn trùng,… loại thức ăn công nghiệp chế biến chưa chế biến như: loại cám, phụ phẩm công nghiệp,… [39], [51], [35] - Dịch bệnh cá rô phi vằn: Cá rô phi vằn lồi sống khoẻ, bị dịch bệnh Tuy nhiên thực tế nuôi thâm canh với mật độ cao, mơi trường bị nhiễm thiếu ơxi cá rơ phi vằn bị mắc bệnh Bệnh cá rơ phi vằn vi khuẩn, vi rút, nấm kí sinh trùng gây Đặc biệt bệnh vi khuẩn Streptococcus nguyên nhân gây nên thiệt hại lớn cá rô phi vằn nói riêng cá nước nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu nghành nuôi trồng thuỷ sản giới (Stoffregen et al, 1996; Shoemaker and Klesius, 1997) Ở nước ta số dịch bệnh lớn cá rô phi vằn gây thiệt hại đáng kể cho hộ nuôi thuỷ sản ghi nhận Năm 2009 xảy dịch bệnh làm cá chết hàng loạt tỉnh phía bắc Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Ninh, Hà Nội, Quảng Ninh Theo kết luận Trung tâm nghiên cứu, quan trắc, cảnh báo mơi trường phịng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền bắc 51 mẫu cá rơ phi vằn bị bệnh lấy tỉnh xét nghiệm thấy có mặt tác nhân gây bệnh vi khuẩn Streptococcus sp Đây vi khuẩn đặc trưng gây bệnh cho cá rơ phi vằn, vi khuẩn có mặt gan, thận chí não cá rơ phi vằn nên chết cá thường có biểu quay mặt nước chìm xuống đáy ao Năm 2010 lại xuất dịch bệnh lan rộng nhiều huyện tỉnh Hải Dương làm cá rô phi vằn chết hàng loạt Theo kết luận Trung tâm nghiên cứu, quan trắc, cảnh báo môi trường phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền bắc cá chết vi khuẩn Streptococcus agalactae [32], [51] Như thấy rằng, nghành công nghiệp nuôi cá rô phi vằn giới nói chung nước ta nói riêng đối mặt với loại bệnh nguy hiểm vi khuẩn Streptococcus gây thường gọi bệnh xuất huyết Bệnh thường gây chết cá với số lượng lớn, cá bị bệnh thường có kích thước lớn, từ 100g trở lên nên thường gây hậu nặng nề cho người nuôi Triệu chứng bệnh thường gặp cá bị xuất huyết da quanh miệng cá gốc vây; vết áp xe lớn vây ngực đi, có mủ; cá có hành vi bất thường bơi vòng quanh, bỏ ăn, giải phẫu thấy có tượng tích dịch xoang bụng, số trường hợp cịn có dấu hiệu mắt cá lồi to Ngoài cá bị nhiễm bệnh nặng, cá cịn bị vi khuẩn hội khác cơng Aeromonas sp nước hay Vibrio sp nước lợ làm cho dịch bệnh trở nên nghiêm trọng Bệnh chủ yếu lan truyền ngang từ cá bị bệnh sang cá khỏe từ môi trường đến cá Dịch bệnh thường xảy cá nuôi bị căng thẳng (stress) kéo dài, mật độ cao, hàm lượng ôxi nước thấp nhiệt độ nước tăng cao [50] 1.2 NHỮNG HẠN CHẾ CỦA VIỆC SỬ DỤNG THUỐC KHÁNG SINH TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CHO THỦY SẢN Thuốc kháng sinh tất chất hóa học khơng kể nguồn gốc (chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả kìm hãm phát triển vi khuẩn tiêu diệt vi khuẩn cách tác động chuyên biệt giai đoạn chuyển hóa cần thiết vi sinh vật [58] Trong nghề nuôi thuỷ sản, nguy mà người ni thường xun phải đối mặt gặp phải dịch bệnh vật ni Để giải tình hình biện pháp chủ yếu thường xuyên áp dụng sử dụng thuốc kháng sinh Hiện nước ta việc nuôi thuỷ hải sản đa phần mang tính chất nhỏ lẻ, manh mún hộ gia đình tự ni Thuốc kháng sinh hóa chất độc hại xâm nhiễm thơng qua đường như: môi trường (ao, hồ,…), giống, thức ăn,… Ở vùng có doanh nghiệp kinh doanh chế biến công ty, doanh nghiệp thu mua lại, sơ chế chế biến, đóng gói tiêu thụ Ngồi số nơi tiểu thương thu mua người ta sử dụng hóa chất cấm để bảo quản sản phẩm (phân urê) Với quy trình sản xuất bao tiêu sản phẩm nên việc sản phẩm thuỷ sản có dư lượng kháng sinh hố chất độc hại điều khó tránh khỏi Đối với vật ni nói chung thủy sản nói riêng, sử dụng loại kháng sinh lặp lại thời gian dài gây ảnh hưởng xấu như: gây tác dụng phụ; giảm sức đề kháng; làm cân hệ vi sinh vật đường ruột, tiêu diệt vi sinh vật có ích tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại phát triển gây bệnh khác cho vật nuôi; làm cho vi khuẩn kháng thuốc như: tượng kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra cảnh báo nhiều năm qua [32] Việc sử dụng thủy sản có dư lượng thuốc kháng sinh hóa chất độc hại có nhiều nguy tiềm ẩn Trong có việc ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Qua thực tế người tiêu dùng bị ngộ độc cấp tính sử dụng sản phẩm với biểu thường thấy người bị ngộ độc thực phẩm như: buồn nôn, chóng mặt, nhức đầu, tiêu chảy,… Ngồi người tiêu dùng cịn bị ngộ độc mãn tính, phải trải qua thời gian tích lũy lâu dài biểu triệu chứng bệnh Cụ thể như: - Chloramphenicol gây triệu chứng rối loạn đường ruột, làm rối loạn trình giảm phân tế bào máu gây nên bệnh thiếu máu, chất làm suy thoái nghiêm trọng chức tủy xương, làm suy yếu hệ xương trẻ sơ sinh - Oxytetracyline dư lượng kháng sinh phép không 100ppb thực phẩm Nó hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc, ảnh hưởng đến hệ miễn dịch thể - Dẫn xuất Nitrofuran (Furaltadone, Furanzolidone, Nitrofurazone) gây ung thư - Kháng sinh nhóm Quinolon gây ung thư da tích lũy lâu dài [6], [33], [35] Mặt khác dư lượng thuốc kháng sinh hóa chất độc hại sản phẩm thủy sản cịn gây nên hậu nữa, ảnh hưởng đến uy tín việc xuất sản phẩm sang nước khác Ở nước như: Mỹ, Nhật Bản, Nga, nước EU có quy định nghiêm ngặt việc nhập sản phẩm thủy sản Ngoài quy định cụ thể dư lượng chất cho phép sản phẩm, quy định chất cấm sử dụng quy trình kiểm tra lô hàng nhập diễn chặt chẽ Ở thời điểm, lô hàng nhập tiến hành kiểm tra ngẫu nhiên mẫu sản phẩm, phát mẫu sản phẩm kiểm tra có dư lượng chất độc hại vượt mức cho phép họ cảnh báo nâng mức kiểm sốt lên cao dần Nếu lơ hàng tiếp tục vi phạm ngưng nhập buộc công ty nhập tiến hành hủy tồn lơ hàng Cụ thể: ngày 10/6/2011, Nhật Bản nâng mức cảnh báo mặt hàng tôm xuất Việt Nam lên 100%; tháng 7/2011, ba nhà bán lẻ Anh Tesco, Asda, Morrisson định ngừng bán cá tra Việt Nam phát tạp chất tăng trọng Điều ảnh hưởng đến uy tín mặt hàng thủy sản xuất nước ta mà gây nhiều thiệt hại kinh tế cho ngành xuất thủy hải sản nhiều hệ lụy kéo theo Và thách thức không nhỏ doanh nghiệp Việt Nam nhà nước chưa có chế tài đủ mạnh biện pháp mạnh tay để kiểm sốt từ đầu Bởi có nghịch lý doanh nghiệp xuất Việt Nam lao đao hàng xuất bị trả khơng đạt chuẩn hóa chất độc hại nhập cách tràn lan, khơng kiểm sốt ngăn ngừa hạn chế Điều dẫn đến hậu doanh nghiệp xuất sau có hàng bị trả khơng đạt chuẩn thay phải hủy, họ lại bán phế phẩm cho người tiêu dùng nước để hạn chế thiệt hại Việc làm chẳng khác đầu độc người dân Do để tránh điều nghịch lý hoàn cảnh nay, nhà nước nhà khoa học cần phải tìm biện pháp đồng để bước khắc phục Một biện có tính khả thi, mang tính chất bền vững lâu dài nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh sử dụng loại thảo dược [35] 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG THẢO DƯỢC 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược giới Việc sử dụng thảo dược để phòng trị bệnh cho người nghiên cứu áp dụng từ lâu Trên giới, nước có ngành y học cổ truyền phát triển có truyền thống lâu đời trải qua hàng nghìn năm như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,… Tại nước ngành y học cổ truyền nghiên cứu lâu đời với nguồn kinh nghiệm tích lũy, chắt lọc qua nhiều hệ tạo nên vốn kiến thức đồ sộ phong phú Trong có nhiều phương thuốc trị nhiều bệnh (từ bệnh đơn giản đến bệnh nan y) người có sử dụng loại thảo dược Trong đơng y, phương thuốc sử dụng kết hợp nhiều vị thuốc khác Chính kết hợp tài tình tạo nên hiệu lớn việc sử dụng thuốc đông y để phịng trị bệnh cứu người Vậy người xem lồi động vật tiến hóa cao Nếu thảo dược chữa bệnh cứu người, lại khơng phịng chữa bệnh cho động vật khác? Trong vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh hóa chất độc hại làm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người, vật nuôi, môi trường xung quanh, mặt khác cịn làm ảnh hưởng đến ngành xuất thủy sản nước Hơn việc sử dụng kháng sinh từ thảo dược có lợi ích thiết thực như: chi phí thấp, dễ kiếm, dễ sử dụng, an tồn với vật ni, khơng gây hại cho người thân thiện với môi trường Chính lợi ích vậy, có nhiều nước giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo mộc vào lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Trong phải kể đến nước có ngành ni trồng thủy sản tương đối phát triển nước thuộc châu Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Banglades, Thổ Nhĩ Kỳ, Malaysia,… Một số tác giả T Rahman, MMR Akanda, MM Rahman, MBR Chowdhury nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng thuốc kháng sinh loại thảo dược số loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến cá Thí nghiệm tiến hành với loại thuốc kháng sinh là: CFCIN (Cipro floxacin), Renamycin (Oxytetracycline), Dt – 10 (Doxycycline) Sulfatrim (Sufadiazin + Trimethoprim) với liều lượng 100, 75, 50 25 ppm; loại thảo dược là: Tỏi, Nghệ, Akand (C.gigentia) hỗn hợp Akand + Neem (A indica) với nồng độ 2, 4, 6, mg/ml Thí nghiệm tiến hành cá bị nhiễm chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến là: Aeromonas hydrophyla, Pseudomonas fluorescens Edwardsiella tarda cảm nhiễm cá Thái bạc (Barbonymus gonionotus) Biện pháp chữa trị tắm, kháng sinh tắm 3-4h/lần lần/ngày; thảo dược tắm với nồng độ 8mg/1ml lần/ ngày Kết nhận sau: kháng sinh hiệu cao (100% khỏi bệnh) CFCIN với liều lượng 75ppm Đối 10 với thảo dược hiệu cao (90%  2,89) tỏi với liều lượng 8mg/ml Và kết ngang cao với kết loại kháng sinh lại Còn kết thấp sử dụng Akand (50% 2,89) Như bước đầu thí nghiệm cho kết tốt việc sử dụng thảo dược để chữa bệnh cá [31] Ở Thổ Nhĩ Kỳ, tác giả Hakar Turker, Arzu Birinci Yildirim Fatma Pehlivan Karakas tiến hành thử nghiệm khả kháng khuẩn 22 loại thảo dược có địa phương số chủng vi khuẩn phổ biến gây bệnh cá như: Aeromonas hydrophyla, Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae, Streptococcus agalactiae Enterococcus faecalis Các loại thảo dược chiết xuất với loại dung môi cồn nước Kết dịch chiết loại thảo dược cho khả kháng khuẩn cao bao gồm: Nuphar lutea, Nymphaea alba, Stachys annua, kim tước Lydia, Vinca nhỏ, Fragaria Kết cho thấy tiếp tục nghiên cứu loại thảo dược sản phẩm thay dần thuốc kháng sinh [27] Ở Ấn Độ, số tác giả Subramanian Velmurugan, Thavassimuthu Citarasu nghiên cứu ảnh hưởng chiết xuất từ số thảo dược Murraya koenigii, Psoralea corylifolia Quercus infectoria số chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus vi khuẩn Vibrio harveyi phân lập từ tôm trắng Ấn Độ (Fenneropenaeus indicus) bị bệnh Biện pháp áp dụng nghiên cứu nồng độ ức chế tổi thiểu chiết xuất từ thảo dược đĩa thạch nghiêng có cấy vi khuẩn sau 24h Sau thử nghiệm cách trộn chiết xuất từ thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn liên tục 30 ngày 10 ngày lần cho tơm tắm dung dịch có pha vi khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi để theo dõi tỉ lệ mắc bệnh tỷ lệ sống sót nhóm kiểm sốt nhóm đối chứng Ngồi thực nghiệm tiến hành kiểm tra hệ vi sinh vật đường ruột tơm sau cho ăn thức ăn có trộn thảo dược so sánh với nhóm đối chứng Bởi vi sinh vật đường ruột tác nhân hội gây bệnh sức đề kháng ... bệnh xuất huyết vi khuẩn Streptococcus sp gây nên Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Đánh giá khả kháng khuẩn dịch ép số loại thảo dược vi khuẩn Streptococcus sp gây bệnh xuất huyết cá rô. .. huyết cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) ” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá, so sánh khả kháng vi khuẩn Streptococcus sp dịch ép số loại thảo dược thông dụng thảo dược với loại thuốc kháng sinh thường... thảo dược chế phẩm từ thảo dược để phòng trị bệnh thường gặp cá Rơ phi vằn chưa có Vì đề tài muốn thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn dịch ép số loại thảo dược vi khuẩn Streptococcus sp gây bệnh xuất