nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học của bệnh vi khuẩn trên cá thát lát còm (chitala chitala hamilton, 1822)

Keywords: Clown knifefish, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, histopathology Title: Histopathology of Clown knifefish Chitala chitala Hamilton, 1822 effected of bacterial diseas

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH

VI KHUẨN TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala

Hamilton, 1822)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH

VI KHUẨN TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala

Hamilton, 1822)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

PGS.TS TỪ THANH DUNG ThS ĐẶNG THỤY MAI THY

2014

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH VI KHUẨN TRÊN

CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala Hamilton, 1822)

Phạm Thị Kim Phượng * , Đặng Thụy Mai Thy và Từ Thanh Dung

Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

*Email: phuong108236@student.ctu.edu.vn

ABSTRACT

A study on histopathology in Clown Knifefish (Chitala chitala) effected of red spots

and hemorrhage diseases (Anus-fin area) A total of 22 fish samples were collected for exam bacteria and histology In all of the diseased fish, pure cultures were

identified Ewardsiella tarda on rod, round, grey colonie, wounds when were pressed

on the gas will emit a foul odor and Aeromonas hydrophila on small rod, shiny,

cream were isolated from liver and kidney on TSA agar plates Basing on characteristic of morphological, physiological and biochemical and testing by API 20E kit As Clown Knifefish was infected by these two type of bacteriums, the histopathology of gills, liver, kidney and spleen lesions indicate hyperaemic, haemorrhage and necrosis in tissues The renal tubules were observed degeneration and necrosis followed by tubular destruction Hemorrhaged sometimes occurred among damaged muscle fibers Histological structure of gills was characterised by the oedematous secondary lamellae with a bacterial invasion into the primary lamellae and gill congestion Giemsa stain method showed that markedly bacterial cells that rod shape in these tissues Tissue necrosis in many samples were stained with H&E and appear many bacteria with Giemsa stained only pattern evident in

infected of A hydrophila, besides that E tarda was not clearly

Keywords: Clown knifefish, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, histopathology

Title: Histopathology of Clown knifefish (Chitala chitala Hamilton, 1822) effected

of bacterial disease

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm hiểu biến đổi mô bệnh học ở cá thát lát còm

(Chitala chitala) khi nhiễm bệnh đốm đỏ và xuất huyết (đỏ lườn) Tổng số 22 mẫu cá

bệnh được thu, phân tích vi khuẩn và mô học Kết quả phân lập được hai loại vi

khuẩn Edwardsiella tarda với khuẩn lạc hình que, tròn, màu xám, có những vết thương khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi và Aeromonas hydrophila với khuẩn lạc

hình que nhỏ, trơn láng, màu kem được phân lập trên môi trường TSA từ gan và thận

dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và bộ kit API 20E Mô bệnh học ở

mang, gan, thận, tỳ tạng và cơ của cá nhiễm hai loại vi khuẩn này cho thấy có sự xung huyết, xuất huyết ở nhiều vùng mô Mất cấu trúc và hoại tử ở các ống thận Nhiều cụm vi khuẩn được tìm thấy trong mô mang, gan, thận và tỳ tạng Mô da cơ bị

xuất huyết và cấu trúc giữa các sợi cơ rời rạc Mô mang có hiện tượng trương phồng dính lại của các sợi mang thứ cấp, vi khuẩn trong sợi mang sơ cấp và có hiện tượng xung huyết Phương pháp nhuộm Giemsa cho thấy tế bào vi khuẩn rõ ràng trong các cấu trúc mô Hoại tử ở nhiều vùng mô với mẫu nhuộm H&E và vi khuẩn xuất hiện

nhiều với mẫu nhuộm Giemsa chỉ thấy rõ ở cá nhiễm vi khuẩn A hydrophila, mặt khác cá nhiễm vi khuẩn E tarda thì biểu hiện không rõ ràng

Từ khóa: Cá thát lát (Chitala chitala), Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda,

mô học

1 GIỚI THIỆU

Cá thát lát còm (Chitala chitala) đã và đang trở thành đối tượng nuôi phổ biến ở

Đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây Cá có chất lượng thịt thơm ngon, giá trị kinh tế cao và có triển vọng phát triển đa dạng sản phẩm trong xuất khẩu Vì là đối tượng nuôi mới nên các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu vào nhu cầu dinh dưỡng ở các giai đoạn phát triển của cá và sản xuất giống nhân tạo nhằm tăng năng suất và hiệu quả kinh tế cho người nuôi (Trần Thị Thanh Hiền và Nguyễn Hương Thùy, 2008) Cho nên hiện nay có nhiều nông hộ chuyển sang nuôi

cá thát lát còm với nhiều mô hình nuôi khác nhau như ao đất hay vèo lưới nên bệnh

đã xuất hiện gây khó khăn và thiệt hại lớn (Lê Ngọc Diện và ctv, 2006) Tuy nhiên

các công trình nghiên cứu về bệnh trên cá thát lát còm còn hạn chế vì vậy nghiên cứu

đặc điểm mô bệnh học trên cá thát lát còm (Chitala chitala) nhiễm vi khuẩn được

thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của bệnh vi khuẩn đến cấu trúc mô ở một số cơ quan của cá góp phần cung cấp thông tin cho quá trình chẩn đoán và điều trị bệnh đạt hiệu quả, giúp cho người dân có mô hình nuôi bền vững và đạt năng suất cao

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn ở cá

Tổng số 35 mẫu cá còm ở giai đoạn cá hương có chiều dài từ 2,5 – 6 cm, được thu ở Cần Thơ và Đồng Tháp trong đó 22 mẫu cá bệnh và 13 mẫu cá khỏe Cá được tiến hành phân tích tại điểm thu mẫu hoặc vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp và mẫu được tiến hành phân tích trong ngày

Quan sát cá bằng mắt thường và ghi nhận tất cả các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong nội quan Tiến hành phân tích mẫu vi sinh bằng cách khử trùng bên ngoài bằng cồn 70° sau đó dùng dao kéo đã tiệt trùng để giải phẫu cá Dùng que cấy tiệt trùng lấy mẫu vi sinh ở gan và thận cấy trên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) Ủ đĩa phân lập trong tủ ấm 28°C trong 24-48 giờ Ghi nhận màu sắc, hình dạng khuẩn lạc và tách ròng để có được đĩa vi khuẩn thuần Vi khuẩn được trữ trong môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB) và glycerol trong tủ -80°C để tiến hành các nghiên cứu kế tiếp

2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn

Các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn được xác định bằng cách kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: Gram, hình dạng, tính di động, catalase, oxidase, O/F,

và bộ kit API 20E (MicrobankTM, PRO-LAB Diagnostics, UK) Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Cowal and Steel’s (Barrow and Feltham, 1999)

2.3 Phương pháp mô học

Các cơ quan mang, gan, thận, tỳ tạng và cơ được thu và cố định trong dung dịch 10% Neutral Buffer Formalin (NBF) Mẫu được xử lý qua các giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin Sau đó mẫu được đúc khối, cắt với độ dày từ 4-6m và nhuộm Haematoxylin & Eosin (H&E), Giemsa Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở độ phóng đại 20x, 40x và 100x và chụp hình tiêu bản đặc trưng Đọc kết quả dựa vào những đặc điểm của tế bào chết được đưa ra bởi Robert (1978)

và hình dạng các tế bào trên mô cá trê không bị bệnh (Suprance Chinabut, 1991)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh được thu có các dấu hiệu bên ngoài như: lờ đờ, nổi đầu, hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, xuất huyết ở vây Quan sát bên trong nội quan: tỳ tạng và thận mềm và xuất huyết, gan sẫm màu (Hình 1) và đã xác định được 2 nhóm bệnh đó là bệnh đốm đỏ còn được gọi là bệnh đen thân, rớt đáy ở cá ương và bệnh xuất huyết còn được gọi là bệnh đỏ lườn hay bệnh trướng bụng

Hình 1 Dấu hiệu bên ngoài của cá bệnh

A Cá bị bệnh đỏ lườn (xuất huyết); B Cá bị bệnh đốm đỏ Dấu hiệu bệnh lý ở cá bệnh đỏ lườn như xuất huyết ở vây hậu môn và cơ quan nội tạng gan, thận, tỳ tạng đỏ bầm, nhũn, có dịch trong xoang bụng lồi và xuất huyết

vùng mắt và miệng của cá chép, cá rô phi, cá da trơn, cá chình, cá vàng và cá Sparus

aurata, cá tra, cá rô và lươn (Austin and Austin, 1987; Noga, 2010; Rahman et al.,

2001; Sarkar and Rashid, 2012; Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Đức Hiền, 2012;

Đặng Thụy Mai Thy và ctv, 2012) Bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp được nghiên

cứu đầu tiên bởi Scaperclous (1930) Cá bị nhiễm loài vi khuẩn này thường có biểu hiện xuất huyết trên da của vây và thân, thường được gọi là bệnh đỏ vây (Hoshina,

1962) Cá tra bị nhiễm vi khuẩn A hydrophila thường có biểu hiện xuất huyết da,

vây, cơ, phù đầu mắt lồi, gan thận tùy tạng xuất huyết, xoang bụng có dịch hồng

hoặc vàng, một số trường hợp bị bệnh nặng có thể gây nhũn cơ (Dung et al., 2005)

Mặt khác, dấu hiệu bệnh lý ở cá bệnh đốm đỏ như thân đen, mắt bị lồi và xuất huyết,

có nhiều đốm đỏ xuất huyết quanh miệng và trên thân, trên vây hậu môn, vây đuôi Ngoài ra, cá bệnh sẽ có những vết thương bên dưới biểu bì và cơ, khi ấn vào sẽ phát

ra khí có mùi hôi, các vết thương này sẽ làm hoại tử các vùng cơ xung quanh (Trần Thị Mỹ Hân, 2013) Bên cạnh đó, trên thế giới nghiên cứu về bệnh đốm đỏ do vi

khuẩn Edwardsiella cũng được thực hiện trên một số đối tượng nuôi tại một số quốc gia như lươn (Anguilla japonica) tại Nhật Bản và Đài Loan (Egusa, 1976), cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) (Nakatsugawa, 1983) và các loài cá khác ở châu

Á và các nơi khác Khi gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus puntatus), E tarda

thường gây ra những vết loét nhỏ trên da, những trường hợp bệnh nặng, chúng gây ra những vùng bạc màu trên da, tại đó hình thành vùng bị áp xe sâu trong cơ của cá (Meyer và Bullock, 1973)

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn, nhuộm Gram, các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và định danh của vi khuẩn

Các mẫu cá bệnh tiến hành phân tích vi sinh ở gan và thận kết quả phân lập được 12 chủng vi khuẩn: 9 chủng vi khuẩn từ cá bị bệnh đốm đỏ và 3 chủng vi khuẩn từ cá bị bệnh đỏ lườn Vi khuẩn phát triển trên môi trường TSA sau 24 giờ ở 280C và cho 2 dạng khuẩn lạc khác nhau Quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn có hình que ngắn và Gram âm Kiểm tra đặc điểm sinh lý và sinh hóa cho thấy

vi khuẩn có khả năng di động, phản ứng dương tính với oxidase và catalase (Bảng 1)

Bảng 1: Kết quả phân lập vi khuẩn

Chỉ tiêu Đốm đỏ E tarda

Buller (2004)

Đỏ lườn A hydrophila

Buller (2004)

Hình dạng khuẩn lạc 0.5 mm 0.5 mm 3-5 mm 3-5 mm Màu sắc khuẩn lạc Trắng trong Trắng trong Kem Kem

Hình dạng vi khuẩn Que ngắn Que Que ngắn Que ngắn

Đối với vi khuẩn gây bệnh đỏ lườn cho phản ứng dương tính với arginine, lysine, VP

và phản ứng âm tính với ornithine Vi khuẩn có khả năng sinh axít từ mannitol, sucrose, glucose và không sử dụng các đường rhamnose, sorbitol, abrabinose, innositol, melibiose, amygdalin Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các

chủng phân lập được hoàn toàn giống với A hydrophila (Buller, 2004) ngoại trừ không sinh axít từ abrabinose Vi khuẩn A hydrophila hình que, garm âm, di động và

số lượng lớn các chủng có thể tồn tại và có khả năng gây bệnh khác nhau (Camus et

al., 1998) Đường kính 0,1-1,0 µm, dài 1,0-3,5 µm, không tạo bào nang, nhiệt độ cực

thuận là 28°C, có thể phát triển ở 37°C Khuẩn lạc trên môi trường NA có màu trắng đến hồng nhạt, tròn, lồi, rìa trơn Trên môi trường đặc trưng GSP, chúng tạo thành

những khuẩn lạc màu vàng, to, trơn láng ủ ở 28°C sau 24 giờ (Trần Thị Mỹ Hân,

2013) Bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp được nghiên cứu đầu tiên bởi Scaperclous

(1930) Nhóm vi khuẩn này đã được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết

trên cá chình (Anguilla anguilla) và cá chép (Cyprinus carpio) ở nhiều nước trên thế giới (Inglis et al., 1993; Aoki, 1999) Tại Việt Nam, bệnh xuất huyết do A

hydrophila gây ra khá phổ biến trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá basa

(Pangasianodon bocorti) và nhiều loài cá nước ngọt khác như cá lóc, cá rô đồng, cá điêu hồng (Dung et al., 2005, Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004; Lư Trí Tài, 2010)

Mặt khác, chủng vi khuẩn gây bệnh đốm đỏ cho thấy có phản ứng dương tính với indol, H2S Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn không có khả năng sử dụng đường mannitol, sucrose và arabino nhưng cho phản ứng dương tính với lysine, ornithine và glucose Các đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập được hoàn toàn giống với

loài Edwardsiella tarda tham khảo của Buller (2004) phân lập được Từ đó cho kết quả hoàn toàn phù hợp với chủng chuẩn, xác định đây là loài E tarda Loài E.tarda

được phân lập đầu tiên trên cá chình tại Nhật Bản bởi Hoshinae (1962), được mô tả

đầy đủ và đặt tên bởi Ewing et al., (1965) Đây là loài được biết đến gây bệnh Ewardsiella trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), cá chình Nhật Bản (Anguilla

jabonica), nhiều loài cá nước ngọt, nước mặn khác, chim, các loài động vật hữu nhũ

và cả trên người Vi khuẩn di động mạnh ở điều kiện 370C Bên cạnh đó, khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ở 3 nồng độ 0, 1, 2, 3% NaCl trong môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion), có thể sinh trưởng ở môi trường có nồng độ NaCl từ 0 – 3% và ở điều kiện nhiệt độ 28oC, 37oC (Trần Thị Mỹ Hân, 2013)

Hình 2 Hình dạng vi khuẩn và kết quả nhuộm Gram

A-B Vi khuẩn Aeromonas hydrophila; C-D Vi khuẩn Edwardsiella tarda

3.3 Biến đổi cấu trúc mô học ở các cơ quan

3.3.1 Mang

Mang là cơ quan hô hấp chủ yếu của cá Quan sát mặt cắt ngang mô mang có sợi mang sơ cấp được bao phủ bởi các tế bào biểu mô vẩy, bên trong có chứa nhiều tế bào tiết chất nhầy và được nâng đỡ bỡi các tế bào ngoài gồm lớp ngoài và lớp biểu

mô vẩy đơn, bên trong có các tế bào trụ liên kết với nhau tạo thành các mao mạch liên hệ với động mạch ra vào mang (Herrera, 1996) Mang cá còm có 4 đôi cung mang, mỗi cung mang gồm có các sợi mang sơ cấp được tạo thành từ các sợi mang thứ cấp xếp thành hai hàng dọc xương cung mang

Hình 3 Mô mang cá thát lát còm nhiễm vi khuẩn (H&E)

A Mô mang khỏe a Sợi mang sơ cấp; b Sợi mang thứ cấp (100x); A hydrophila (B-C-D):

B Động mạch ra vào mang bị xung huyết (100x) C Sợi mang thứ cấp bị sưng phồng và

dính lại (200x) D Sợi mang thứ cấp bị xung huyết và mất đoạn (mũi tên, 400x); E tarda

(E-F): E Sợi mang bị gãy (200x) F Động mạch bị xung huyết (400x)

D

C

F

E

Quan sát mô mang cá bệnh vi khuẩn A hydrophila và E tarda có sự xung huyết ở

động mạch mang và sợi mang sơ cấp và thứ cấp Hiện tượng phình to sợi mang sơ cấp, thứ cấp và sự tăng lên của các tế bào biểu mô và các sợi mang thứ cấp dính lại Một số mẫu mang bị gãy đứt hay mất đoạn (Hình 3) Mô mang nhuộm Giemsa, có sự hiện diện của nhiều cụm vi khuẩn hình que trong sợi mang sơ cấp khi nhiễm hai loại

vi khuẩn này (Hình 4) Kết quả này trùng hợp với mô tả của Ferguson (2006), đã tìm thấy chúng ở mô mang cá hồi và mô mang cá tra bị bệnh trắng đuôi do vi khuẩn

Flavobacterium columnare gây ra do Từ Thanh Dung và ctv (2012) tìm được

Hiện tượng dính lại và phồng lên của mang là do khi mầm bệnh tấn công tạo nên phản ứng miễn dịch làm cho các tế bào mang sưng lên và khi các tế bào mang sưng

to sẽ dẫn đến sự tiếp xúc giữa các sợi mang này Từ đó làm giảm chức năng hô hấp

và khi bệnh xảy ra, cấu trúc mang bị hủy hoại nghiêm trọng hơn (Robert, 1989) Tế bào biểu mô bị sưng phồng và có sự thay đổi hình thái mô học của mang cho thấy mang đang bị tổn thương (Ferguson, 2006) Hiện tượng sợi mang thứ cấp bị sưng

phồng và dính lại khi bị hai loại vi khuẩn A hydrophila và E tarda gây ra trên mô

mang cá tương tự như kết quả của Quách Thị Tú Ly (2010) trên mô mang cá điêu

hồng do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh

Hình 4 Mô mang cá thát lát còm nhiễm vi khuẩn (Giemsa)

A Cụm vi khuẩn A hydrophila hình que ở mô mang, B Cụm vi khuẩn E tarda hình que ở

mô mang (200x)

Từ kết quả trên, ta có thể kết luận rằng khi cá thát lát còm bị nhiễm 2 loại vi khuẩn A

hydrophila và E tarda, các dấu hiệu trên mô mang đều giống nhau thông qua hai

cách nhuộm H&E và Giemsa

3.3.2 Gan

Gan bao gồm các tĩnh mạch, động mạch, ống dẫn mật, các trung tâm đại thực bào sắc

tố, các đảo tụy Đảo tụy có chức năng ngoại tiết dịch tụy để tiêu hóa thức ăn và chức năng nội tiết (Herrera, 1996) Gan cá còm có hình dạng như một khối lớn có thùy và thường nằm về một bên trong xoang bụng Ở giữa gan có tĩnh mạch trung tâm, tuyến tụy nằm rải rác trên mô gan cá còm Các tế bào gan có hình đa giác và sắp xếp lan tỏa theo tĩnh mạch trung tâm

Quan sát mô gan cá bệnh có hiện tượng xung huyết và xuất huyết Nhiều vùng cấu trúc mô gan có sự biến đổi cấu trúc tế bào gan, màng tế bào bị vỡ và hoại tử Vi khuẩn hình que xuất hiện rời rạc hay thành cụm trong mô gan khi nhuộm bằng H&E

và Giemsa Ngoài ra, phát hiện được vi khuẩn ở vùng cơ trơn của ống dẫn tụy (Hình

5A, B, C, D) đối với cá nhiễm vi khuẩn A hydrophila Kết quả này giống với nghiên cứu biến đổi cấu trúc mô học ở cá Fundulus grandis nhiễm Streptococcus sp cho

thấy tế bào gan bị teo đồng thời với sự giảm glycogen và gia tăng không bào, thoái

hóa và hoại tử tế bào (Rasheed et al., 1985) và cá rô phi nhiễm S agalactiae (Suanyuk et al., 2005; Filho et al., 2009)

Hình 5 Mô gan cá thát lát còm nhiễm vi khuẩn

A hydrophila (A-B-C-D) A (H&E, 100x): a Vùng tế bào gan bị biến đổi cấu trúc, b Vùng

tế bào gan bị hoại tử; B Cụm vi khuẩn ở cơ trơn của ống dẫn tụy; C (H&E, 400x): Gan bị xung huyết (mũi tên), cụm vi khuẩn nằm rải rác trong các tế bào gan (khoanh tròn) ; D Cụm

vi khuẩn trong tế bào gan (Giemsa, 200x) E tarda (E-F) E Động mạch bị hoại tử (H&E,

400x) F Vi khuẩn tập trung thành cụm ( Giemsa, 1000x)

D

C

a

b