(LUẬN văn THẠC sĩ) ứng dụng hệ thống CRISPR CAS9 tạo đột biến trên phấn hoa cà chua

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ THANH HUYỀN ỨNG DỤNG HỆ THỐNG CRISPR/CAS9 TẠO ĐỘT BIẾN TRÊN PHẤN HOA CÀ CHUA Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 842.02.01 Hướng dẫn khoa học: TS Bùi Thị Thu Hương TS Nguyễn Thị Lan Hoa NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực xác, có tơi làm việc thời gian thực luận văn Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huyền i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Thị Thu Hương – Bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam TS Nguyễn Thị Lan Hoa – Trung tâm Tài nguyên Thực vật dành thời gian định hướng bảo cho q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Dr Roland Schafleitner – Trưởng Bộ môn Chọn giống phân tử - World Vegateble Center trao cho hội quý giá học tập nghiên cứu Trung tâm Rau Thế Giới – Đài Loan, người giúp tơi có bước phát triển đề tài cách đắn, đốc thúc, giúp tơi tích cực chủ động với đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp nhiệt tình hướng dẫn, giúp thành thạo kỹ thuật phịng thí nghiệm Một lời cảm ơn đặc biệt, tơi xin phép gửi đến Bộ môn Sinh học Trung tâm Tài nguyên Thực vật tạo hội để tiếp cận với hướng nghiên cứu Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy giáo, Cô giáo Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo, cho tơi niềm đam mê suốt q trình học tập Cuối cùng, tơi xin cảm ơn giúp đỡ, quan tâm, động viên gia đình tồn thể bạn bè dành cho tơi Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Huyền ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract .x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thiết khoa học 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa khoa học .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung cà chua .3 2.1.1 Nguồn gốc .3 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng 2.2 Nghiên cứu chọn tạo giống trồng 2.2.1 Phương pháp lai .4 2.2.2 Phương pháp đột biến 2.2.3 Tạo giống công nghệ tế bào thực vật 2.2.4 Cây trồng biến đổi gen (GMO) 2.3 Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 2.3.1 Lịch sử 2.3.2 Cấu trúc 10 2.3.3 Cơ chế hoạt động 11 iii download by : skknchat@gmail.com 2.3.4 Thành tựu 12 2.4 Promoter hoạt động đặc thù phấn hoa 13 2.5 Gen alcohol dehydrogenase (ADH) .13 2.6 Tiềm tạo đột biến tế bào đơn bội 14 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 16 3.2 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu .16 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Xây dựng vector tái tổ hợp .16 3.3.2 Nhân dòng vector tái tổ hợp vi khuẩn E.coli 19 3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn A.tumefaciens sốc nhiệt 20 3.3.4 Chuyển cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn A tumefaciens .20 3.3.5 Đánh giá chọn lọc .23 Phần 4: Kết thảo luận 29 4.1 Xây dựng vector tái tổ hợp nhân dòng 29 4.1.1 Tạo vector tái tổ hợp dựa cấu trúc pCAMBIA1301 29 4.1.2 Tạo vector tái tổ hợp dựa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 .30 4.2 Chuyển cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101::PMP90) .32 4.2.1 Tạo vi khuẩn A tumefaciens chứa vector tái tổ hợp 32 4.2.2 Chuyển cấu trúc vào cà chua .33 4.2.3 Đánh giá hoạt động promoter LAT52 LAT59 .35 4.2.4 Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome hệ thống CRISPR/Cas9 .37 4.3 Kiểm tra đột biến hệ thứ hai T1 .40 Phần Kết luận kiến nghị 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị .43 Tài liệu tham khảo .44 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đủ Nghĩa tiếng Việt ADH Alcohol dehydrogenase Gen alcohol dehydrogenase Clustered Regularly Interspaced Trình tự xếp kiểu lặp lại ngắn xen Short Palindromic Repeats lẫn khoảng trống Cas9 CRISPR associated protein CRISPR liên kết với protein DSB Double-strand Break Sự phá vỡ sợi kép GA3 Gibberellic acid gRNA guide RNA RNA dẫn đường HDR Homology-directed repair Sửa chữa tương đồng trực tiếp LB Lysogeny broth IAA Indole-3-acetic acid NHEJ Non-homology end joining PAM Protospacer Adjacent Motif YEP Yeast Extract Peptone CRISPR Cơ chế sửa chữa đầu cuối khơng tương đồng Dạng trình tự liền kề v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự PAM ứng với Lồi/Biến thể Cas9 10 Bảng 4.1 Hiệu chuyển gen biểu gen GUS cấu trúc dựa pCAMBIA1301 36 Bảng 4.2 Hiệu chuyển gen tỷ lệ đột biến cấu trúc dựa pKSE401 ADH2-4 37 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ tạo lai Pomato sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần Hình 2.2 Cơ chế CRISPR/Cas9 vi khuẩn chống lại DNA ngoại lai Hình 2.3 Cơ chế phá vỡ sợi DNA kép 11 Hình 2.4 Cơ chế sửa chữa mạch kép bị cắt enzyme Cas9 12 Hình 3.1 Sơ đồ vector pCAMBIA1301 17 Hình 3.2 Sơ đồ vector pKSE401 ADH2-4 18 Hình 3.3 Minh họa thành phần phản ứng Gibson Assembly 19 Hình 3.4 Trình tự gen mục tiêu ADH gen 26 Hình 3.5 Minh họa alen hệ T0 T1 27 Hình 3.6 Phương pháp chọn lọc khuẩn lạc trắng-xanh 28 Hình 4.1 Sơ đồ cấu trúc gen GUS điều khiển promoter LAT52 LAT59 29 Hình 4.2 Ảnh điện di sản phẩm colony-PCR khuẩn lạc 30 Hình 4.3 Sơ đồ cấu trúc CRISPR/Cas9 tạo thành 31 Hình 4.4 Ảnh điện di khuẩn lạc vector tái tổ hợp pKSE401 ADH2-4 U6gRNA LAT52-Cas9 pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52Cas9 32 Hình 4.5 Cấy trang vi khuẩn A tumefaciens 33 Hình 4.6 Mẫu mầm môi trường dinh dưỡng 34 Hình 4.7 Ni cấy tạo chồi mơi trường có bổ sung 0.25 mg/L GA3 34 Hình 4.8 Chồi tái sinh có sức sống cao 35 Hình 4.9 Mẫu lá, bao phấn hạt phấn dòng chuyển gen sau nhuộm X-gluc 36 Hình 4.10 Dự đoán đột biến phương pháp PCR .38 Hình 4.11 Dự đốn đột biến enzyme cắt giới hạn BstNI 38 Hình 4.12 Trình tự gen ADH2-4 cấu trúc đối chứng pKSE401 ADH2-4 39 Hình 4.13 Trình tự gen ADH2-4 cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 (a) pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 (b) 39 Hình 4.14 Minh họa phận khác cà chua thẩm tra .40 vii download by : skknchat@gmail.com Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn mẫu mô khác 40 Hình 4.16 Các hệ thứ hai T1 41 Hình 4.17 Dự đốn đột biến hệ thứ hai T1 enzyme cắt giới hạn .41 Hình 4.18 Đột biến hệ T1 cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 42 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Thanh Huyền Tên luận văn: Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến phấn hoa cà chua Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 842.02.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Tạo hệ thống chỉnh sửa genome đặc hiệu phấn hoa cà chua sử dụng công cụ CRISPR/Cas9 Phương pháp nghiên cứu: - Thiết kế vector dựa hai vector pCAMBIA1301 pKSE401 ADH2-4 sử dụng enzyme cắt giới phương pháp nối Gibson Assembly - Chuyển vector vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Kiểm tra có mặt cấu trúc chuyển gen sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Đánh giá hoạt động promoter điều khiển gen GUS phương pháp nhuộm mô tế bào (X-Gluc) - Kiểm tra hiệu chỉnh sửa gen hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng PCR enzyme cắt giới hạn, kết thẩm định phương pháp giải trình tự Kết kết luận: Nghiên cứu thành công việc thiết kế vector khác mang cấu trúc promoter LAT52 – gen GUS, promoter LAT59 – gen GUS, promoter U6-gRNA/LAT52-Cas9 LAT59-gRNA/LAT52-Cas9 Đồng thời, vector chuyển thành công vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Promoter LAT52 chứng minh hoạt động đặc thù phấn hoa thông qua cấu trúc LAT52-GUS Hệ thống CRISPR/Cas9 công nghệ hiệu ứng dụng chỉnh sửa genome Thông qua cấu trúc pKSE401 ADH2-4, hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến gen ADH2-4 mẫu cà chua với tỷ lệ đột biến 13,33% Cấu trúc chứa promoter LAT52 LAT59 điều khiển Cas9 gRNA không tạo đột biến mẫu mô phân sinh cà chua hệ đầu T0 Hệ thống CRISPR/Cas9 với cấu trúc chứa promoter LAT52 điều kiển hoạt động Cas9 tạo đột biến phấn hoa cà chua chứng minh kết đột biến dị hợp tử hệ sau T1 Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến phấn hoa cà chua với gen mục tiêu Alcohol dehydrogenase Trong tương lai, ứng dụng phương pháp trực tiếp chuyển phức hợp gRNA-Cas9 vào hạt phấn tạo hệ mang cải tiến hiệu chuyển gen ix download by : skknchat@gmail.com Hình 4.8 Chồi tái sinh có sức sống cao 4.2.3 Đánh giá hoạt động promoter LAT52 LAT59 Ở cấu trúc xây dựng dựa vector pCAMBIA1301, hiệu chuyển gen khoảng từ 35% đến 41% thể Bảng 4.1 Cụ thể, cấu trúc đối chứng 35S-GUS 35,29%, cấu trúc LAT52-GUS 40,91% cấu trúc LAT59-GUS 36,92% Kết cho thấy đồng trình chuyển gen cấu trúc thao tác thực từ nhân dòng, chuyển vào vi khuẩn A tumefaciens chuyển gen vào cà chua tương đối ổn định Đối với kết nhuộm gen GUS, mẫu đối chứng chứa promoter 35S, chúng tơi tìm mẫu xuất màu xanh lam đặc trưng Hơn nữa, 100% cho kết nhuộm xanh lam hạt phấn Kết promoter 35S hoạt động quan sinh dưỡng (lá) hạt phấn cà chua Đối với cấu trúc kiểm tra hoạt động promoter LAT52 LAT59, 77,78% 95,83% (Bảng 4.1) không phát màu xanh lam Mặt khác, chứa promoter LAT52, màu xanh lam đặc trưng tìm thấy 100% hạt phấn Như vậy, promoter LAT52 không hoạt động quan sinh dưỡng, hoạt động phấn hoa cà chua Do thời gian hạn chế, chưa thể thu hoạch đánh giá hạt phấn từ chứa promoter LAT59 35 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.1 Hiệu chuyển gen biểu gen GUS cấu trúc dựa pCAMBIA1301 Cấu trúc Số lượng chồi Số lượng chồi Hiệu Tỷ lệ biểu gen Tỷ lệ biểu gen GUS nhận gen chuyển chuyển gen GUS mẫu mẫu phấn hoa 35S-GUS 17 35,29% 50,00% 100% LAT52-GUS 22 40,91% 23,22% 100% LAT59-GUS 65 24 36,92% 4,17% (chưa kiểm tra) Màu xanh lam tìm thấy lá, bao phấn phấn hoa cấu trúc đối chứng chứa promoter 35S, màu xanh khơng tìm thấy đối chứng âm Đối với cấu trúc có chứa promoter LAT52 LAT59, phần lớn mẫu sau nhuộm có màu trắng Đặc biệt, cấu trúc chứa promoter LAT52, mẫu khơng có màu xanh màu xanh lam tìm thấy bao phấn phấn hoa Các kết minh họa Hình 4.9 35S-GUS LAT52-GUS LAT59-GUS Đối chứng âm Mẫu Bao phấn * Phấn hoa * * Do thời gian hạn chế nên mẫu chưa đánh giá Hình 4.9 Mẫu lá, bao phấn hạt phấn dòng chuyển gen sau nhuộm X-gluc 36 download by : skknchat@gmail.com 4.2.4 Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome hệ thống CRISPR/Cas9 Trong cấu trúc đối chứng, hệ đầu T0 hiệu chuyển gen đạt 100% tỷ lệ đột biến 13,33% Tỷ lệ tương đồng với kết nhiều nghiên cứu trước Chẳng hạn tỷ lệ đột biến tạo hệ thống CRISPR/Cas9 ngô 13,1% (Liang et al., 2014), loại rêu Marchantia polymorpha L 11% (Sugano et al., 2014), Arabidopsis thaliana có tỷ lệ đột biến từ 2,5% lên tới 70% (Fauser et al., 2014) hay gạo – 16% (Xu et al., 2014) Đối với cấu trúc chứa promoter LAT52 điều kiển Cas9, hiệu chuyển gen 21,57% (có 11 chồi nhận gen chuyển tổng số 51 chồi) tỷ lệ đột biến 72,73% (8 11 chồi mang đột biến) hệ đầu T0 Kết khơng mong đợi theo giả thuyết, khơng tìm thấy đột biến hệ Tuy nhiên, số lượng mẫu thí nghiệm cịn nên độ tin cậy chưa cao, cần tăng số lượng mẫu để có kết luận xác Cuối cấu trúc chứa hai promoter LAT52 LAT59 điều khiển gRNA Cas9, hiệu chuyển gen đạt 88,24% (30 tổng số 34 chồi nhận toàn gen chuyển) tỷ lệ đột biến hệ đầu T0 0% (Bảng 4.2), đạt kết kỳ vọng Bảng 4.2 Hiệu chuyển gen tỷ lệ đột biến cấu trúc dựa pKSE401 ADH2-4 Cấu trúc Số lượng chồi Số lượng chồi nhận gen chuyển Hiệu chuyển gen Số lượng chồi mang đột biến Tỷ lệ đột biến pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA 35S-Cas9 60 60 100% 13,33% pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 51 11 21,57% 72,73% 34 30 88,24% 0% pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 Qua hai cấu trúc thử nghiệm hiệu chỉnh sửa gen, nhận thấy 37 download by : skknchat@gmail.com Cas9 chịu điều khiển promoter LAT52 gRNA hoạt động mạnh điều khiển promoter U6-26 tạo đột biến hệ đầu T0 Khi thay hoàn toàn promoter LAT52 LAT59, khơng có đột biến xảy hệ đầu T0 Vì vậy, gRNA nhân tố chỉnh ảnh hưởng đến tỷ lệ đột biến Trong cấu trúc đối chứng, đột biến dự đoán phương pháp PCR (Hình 4.10) và sử dụng enzyme cắt giới hạn (Hình 4.11) Có tổng số 60 mẫu dự đoán mang đột biến sau gen ADH2-4 mẫu nhân lên để kiểm tra cắt enzyme BstNI Mẫu số – 60: Gen ADH2-4 chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 cà chua bình thường) Các mẫu cho kết đột biến gen ADH2-4 mẫu số 15, 18, 25, 33, 35, 36, 37 59 Hình 4.10 Dự đoán đột biến phương pháp PCR Các mẫu đột biến tìm thấy sau sử dụng enzyme cắt giới hạn hoàn toàn trùng khớp với mẫu dự đoán phương pháp PCR Mẫu số – 60: Gen ADH2-4 chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 cà chua bình thường) Hình 4.11 Dự đốn đột biến enzyme cắt giới hạn BstNI Kết cuối kiểm chứng thơng qua giải trình tự Các dạng đột biến phổ biến phát đột biến đoạn Ngoài ra, đột biến thêm đoạn tìm thấy (Hình 4.12) Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 có khả tạo đột biến cấu trúc đối chứng Tuy nhiên, kiểu đột biến hoàn toàn ngẫu nhiên, khơng thể có lặp lại cách xác 38 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.12 Trình tự gen ADH2-4 cấu trúc đối chứng pKSE401 ADH2-4 Trong hai cấu trúc có chứa promoter LAT52 LAT59, quan tâm không chứa đột biến hệ đầu T0, chúng tơi sử dụng giải trình tự để xác nhận a b Hình 4.13 Trình tự gen ADH2-4 cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 (a) pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 (b) Các không chứa đột biến hệ đầu T0 cấu trúc pKSE401 ADH24 U6-gRNA LAT52-Cas9 thẩm tra kỹ thuật PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI để đảm bảo chúng chimeric Bởi sau tiến hành ni cấy mơ, chồi nhận nhiều quần thể tế bào khác trình hình thành callus phát triển thành hồn chỉnh 39 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.14 Minh họa phận khác cà chua thẩm tra Mẫu 1, 2: mô phân sinh thu từ cành khác Mẫu 3, 4, 5: mẫu thu từ cành khác P: mẫu đối chứng gen ADH2-4 từ cà chua bình thường Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn mẫu mơ khác Hình ảnh điện di (Hình 4.15) cho thấy gen ADH2-4 khơng có đột biến nhân lên phương pháp PCR cắt enzyme cắt giới hạn BstNI từ mẫu mô khác cà chua Như vậy, cà chua hệ đầu T0 không chứa đột biến phận sinh dưỡng (thân, lá) Những chuyển nhà lưới, tiếp tục trình sinh trưởng, phát triển, hoa kết 4.3 KIỂM TRA ĐỘT BIẾN Ở THẾ HỆ THỨ HAI T1 Hạt cà chua từ mục tiêu hệ đầu T0 đem gieo trồng 40 download by : skknchat@gmail.com nảy mầm Sau khoảng 15 ngày, hệ thứ hai T1 hình thành hình 4.16 Sau đó, chúng tơi tiến hành đánh số, thu mẫu, tách chiết DNA Đột biến dự đoán kỹ thuật PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI cho gen mục tiêu ADH2-4 (Hình 4.17) Hình 4.16 Các hệ thứ hai T1 Mẫu số – 48: Gen ADH2-4 hệ thứ hai T1 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 cà chua bình thường) Hình 4.17 Dự đoán đột biến hệ thứ hai T1 enzyme cắt giới hạn Các mẫu có khả chứa đột biến nhân lên, tinh chế từ gel chuyển vào vector pGEM®-T Easy Vector System I (Promega) Dịch khuẩn cấy trang môi trường thạch LB có bổ sung IPTG, X-gal Ampicillin (phương pháp tách dòng gen – sàng lọc xanh – trắng) Sau đó, đĩa thạch ủ 370C qua đêm Cuối cùng, tiến hành chọn lọc khuẩn lạc có màu trắng, xác thực chép, chuyển đến cơng ty giải trình tự Ở hệ này, chúng tơi tìm thấy kiểu alen giả thuyết ban đầu bao gồm alen bình thường alen đột biến Cụ thể, số có alen bình thường alen thêm đoạn, số 30 có alen bình thường alen đoạn, số 35 có alen bình thường alen thêm đoạn Một băng vạch khác băng 128 bp 42 bp xuất mẫu đột biến (gen 41 download by : skknchat@gmail.com ADH2-4 bình thường có kích thước 170 bp cắt thành hai mảnh 128 bp 42 bp enzyme cắt giới hạn BstNI) Như vậy, hình ảnh điện di (Hình 4.17) cho thấy dự đốn đột biến phù hợp với kết giải trình tự thu Mỗi xác nhận nhiều lần nhằm chứng minh đáng tin cậy kết Vị trí cắt enzyme cắt giới hạn BstNI (trình tự nhận biết CCAGG) bị phá vỡ số số 30 thể kết giải trình tự (Hình 4.18) Hình 4.18 Các trình tự đột biến hệ thứ hai T1 cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 Cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa promoter LAT52 điều kiển Cas9 cho kết đột biến gen ADH2-4 hệ sau T1 với kiểu đột biến dị hợp Kết chứng minh hệ thống CRISPR/Cas9 chứa promoter đặc hiệu phấn hoa LAT52 tạo đột biến phấn hoa cà chua 42 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Tạo vector chuyển cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien promoter LAT52 – gen GUS, promoter LAT59 – gen GUS, hệ thống CRISPR/Cas9 chứa U6-gRNA LAT52Cas9 hệ thống CRISPR/Cas9 chứa LAT59-gRNA LAT52-Cas9 - Promoter LAT52 hoạt động đặc hiệu phấn hoa cà chua - Hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng cấu trúc pKSE401 ADH2-4 tạo đột biến gen ADH2-4 mẫu cà chua (tỷ lệ đột biến 13.33%) - Cấu trúc chứa promoter LAT52 LAT59 điều khiển Cas9 gRNA không tạo đột biến mẫu mô phân sinh cà chua hệ T0 - Cấu trúc Cas9 điều khiển promoter LAT52 gRNA điều khiển promoter U6 tạo đột biến phấn hoa, thể hệ thứ hai T1 chứa nhân tố di truyền mang đột biến dị hợp tử 5.2 KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu bước đầu cho thấy tiềm cải tiến hệ trồng thông qua sử dụng tế bào đơn bào kết hợp với hệ thống CRISPR/Cas9 - Đánh giá hiệu tạo đột biến phấn hoa sử dụng cấu trúc chứa promoter LAT52 LAT59 - Ứng dụng phương pháp trực tiếp chuyển phức hợp gRNA-Cas9 vào hạt phấn tạo hệ mang cải tiến hiệu chuyển gen 43 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài Liệu Tiếng Anh Aust, O., Stahl, W., Sies, H., Tronnier, H., and Heinrich, U (2005) Supplementation with tomato-based products increases lycopene, phytofluene, and phytoene levels in human serum and protects against UV-light-induced erythema Int J Vitam Nutr Res 75 pp 54-60 Bakker, and Winfridus (2006) Enhanced Hybrid Vigor Benefits Breeder and Broiler Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D A., and Horvath, P (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes Science 315 pp 1709-12 Bassett, A R., and Liu, J L (2014) CRISPR/Cas9 and genome editing in Drosophila J Genet Genomics 41 pp 7-19 Brew-Appiah, R A., Ankrah, N., Liu, W., Konzak, C F., von Wettstein, D., and Rustgi, S (2013) Generation of doubled haploid transgenic wheat lines by microspore transformation PLoS One 8, e80155 Bugel, S (2003) Vitamin K and bone health Proc Nutr Soc 62 pp 839-43 Caroline Bolton-Smith, Marion ET McMurdo, Colin R Paterson, Patricia A Mole, Julia M Harvey, Steven T Fenton, Celia J Prynne, Gita D Mishra, and Shearer, M J (2007) Two-Year Randomized Controlled Trial of Vitamin K1 (Phylloquinone) and Vitamin D3 Plus Calcium on the Bone Health of Older Women JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH Carpenter, J E (2010) Peer-reviewed surveys indicate positive impact of commercialized GM crops Nat Biotechnol 28 pp 319-21 Chang, C., and Meyerowitz, E M (1986) Molecular cloning and DNA sequence of the Arabidopsis thaliana alcohol dehydrogenase gene Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83 pp 1408-1412 10 Char, S N., Neelakandan, A K., Nahampun, H., Frame, B., Main, M., Spalding, M H., Becraft, P W., Meyers, B C., Walbot, V., Wang, K., and Yang, B (2017) An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize Plant Biotechnol J 15 pp 257-268 11 Chen, X., Lu, X., Shu, N., Wang, S., Wang, J., Wang, D., Guo, L., and Ye, W (2017) Targeted mutagenesis in cotton (Gossypium hirsutum L.) using the CRISPR/Cas9 system Sci Rep 7, 44304 44 download by : skknchat@gmail.com 12 Chung, H.-J., and Ferl, R J (1999) Arabidopsis Alcohol Dehydrogenase Expression in Both Shoots and Roots Is Conditioned by Root Growth Environment Plant Physiology 121 pp 429 13 Cox, S (2000) I Say Tomayto, You Say Tomahto 14 Doudna, J A., and Charpentier, E (2014) Genome editing The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 Science 346, 1258096 15 Endo, M., Nishizawa-Yokoi, A., and Toki, S (2016) Targeted Mutagenesis in Rice Using TALENs and the CRISPR/Cas9 System Methods Mol Biol 1469 pp 123-35 16 Fauser, F., Schiml, S., and Puchta, H (2014) Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana Plant J 79 pp 348-59 17 Foolad, M R (2007) Genome mapping and molecular breeding of tomato Int J Plant Genomics 2007, 64358 18 Froger, A., and Hall, J E (2007) Transformation of plasmid DNA into E coli using the heat shock method J Vis Exp pp 253 19 Giovannucci, E (1999) Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature J Natl Cancer Inst 91 pp 317-31 20 Giovannucci, E (2002) A review of epidemiologic studies of tomatoes, lycopene, and prostate cancer Exp Biol Med (Maywood) 227 pp 852-9 21 Hamilton, C M (1997) A binary-BAC system for plant transformation with highmolecular-weight DNA Gene 200 pp 107-16 22 Hanson, D D., Hamilton, D A., Travis, J L., Bashe, D M., and Mascarenhas, J P (1989) Characterization of a pollen-specific cDNA clone from Zea mays and its expression The Plant Cell pp 173-179 23 Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A (1987) Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product J Bacteriol 169 pp 5429-33 24 Kaplinsky, N., Braun, D., Lisch, D., Hay, A., Hake, S., and Freeling, M (2002) Biodiversity (Communications arising): maize transgene results in Mexico are artefacts Nature 416, 601-2; discussion 600, 602 25 Key, S., Ma, J K., and Drake, P M (2008) Genetically modified plants and human health J R Soc Med 101, 290-8 26 Khang, D (2018) Potential application and current achievements of CRISPR/Cas in rice 45 download by : skknchat@gmail.com 27 Leclercq, J., Szabolcs, T., Martin, F., and Montoro, P (2015) Development of a new pCAMBIA binary vector using Gateway(R) technology Plasmid 81 pp 50-4 28 Lee, Z H., Yamaguchi, N., and Ito, T (2018) Using CRISPR/Cas9 System to Introduce Targeted Mutation in Arabidopsis Methods Mol Biol 1830 pp 93-108 29 Liang, Z., Zhang, K., Chen, K., and Gao, C (2014) Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system J Genet Genomics 41 pp 63-8 30 Liu, X., Wu, S., Xu, J., Sui, C., and Wei, J (2017) Application of CRISPR/Cas9 in plant biology Acta Pharm Sin B pp 292-302 31 Lodish H, Berk A, and SL, Z (2000) Mutations: Types and Causes 32 Losey, J E., Rayor, L S., and Carter, M E (1999) Transgenic pollen harms monarch larvae Nature 399, 214 33 Makarova, K S., Wolf, Y I., Alkhnbashi, O S., Costa, F., Shah, S A., Saunders, S J., Barrangou, R., Brouns, S J., Charpentier, E., Haft, D H., Horvath, P., Moineau, S., Mojica, F J., Terns, R M., Terns, M P., White, M F., Yakunin, A F., Garrett, R A., van der Oost, J., Backofen, R., and Koonin, E V (2015) An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems Nat Rev Microbiol 13 pp 722-36 34 Mikami, M., Toki, S., and Endo, M (2015) Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice Plant Mol Biol 88 pp 561-72 35 Palomo, I., Fuentes, E., Padro, T., and Badimon, L (2012) Platelets and atherogenesis: Platelet anti-aggregation activity and endothelial protection from tomatoes (Solanum lycopersicum L.) Exp Ther Med pp 577-584 36 Pankaj Bhowmik 1, E E., Brittany Polley1, Venkatesh Bollina1, Manoj Kulkarni1, Kaveh Ghanbarnia1, Halim Song1, Caixia Gao 3, Daniel F Voytas2 & Sateesh Kagale (2018) Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9 Scientific Reports 37 Paul, J W., 3rd, and Qi, Y (2016) CRISPR/Cas9 for plant genome editing: accomplishments, problems and prospects Plant Cell Rep 35 pp 1417-27 38 Potrykus, I (2001) Golden Rice and Beyond Plant Physiology 125 pp 11571161 39 Richter, C., Chang, J T., and Fineran, P C (2012) Function and Regulation of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / CRISPR Associated (Cas) Systems Viruses pp 2291-2311 40 Roddick, J G., and Melchers, G (1985) Steroidal glycoalkaloid content of potato, tomato and their somatic hybrids Theor Appl Genet 70 pp 655-60 46 download by : skknchat@gmail.com 41 Sato, R., Helzlsouer, K J., Alberg, A J., Hoffman, S C., Norkus, E P., and Comstock, G W (2002) Prospective study of carotenoids, tocopherols, and retinoid concentrations and the risk of breast cancer Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11 pp 451-7 42 Sato, S., Kamiyama, M., Iwata, T., Makita, N., Furukawa, H., and Ikeda, H (2006) Moderate increase of mean daily temperature adversely affects fruit set of Lycopersicon esculentum by disrupting specific physiological processes in male reproductive development Ann Bot 97 pp 731-8 43 Shi, J., Gao, H., Wang, H., Lafitte, H R., Archibald, R L., Yang, M., Hakimi, S M., Mo, H., and Habben, J E (2017) ARGOS8 variants generated by CRISPRCas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions Plant Biotechnol J 15 pp 207-216 44 Spier, R E (1998) Animal and plant cell technology: a critical evaluation of the technology/society interface J Biotechnol 65 pp 111-25 45 Stahl, W., Heinrich, U., Aust, O., Tronnier, H., and Sies, H (2006) Lycopene-rich products and dietary photoprotection Photochem Photobiol Sci pp 238-42 46 Sugano, S S., Shirakawa, M., Takagi, J., Matsuda, Y., Shimada, T., HaraNishimura, I., and Kohchi, T (2014) CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in the liverwort Marchantia polymorpha L Plant Cell Physiol 55 pp 475-81 47 Tanaka, A., Shikazono, N., and Hase, Y (2010) Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants J Radiat Res 51 pp 223-33 48 Tanksley, S D (1979) Linkage, chromosomal association, and expression of Adh1 and Pgm-2 in tomato Biochem Genet 17 pp 1159-67 49 Thompson, C E., Fernandes, C L., de Souza, O N., de Freitas, L B., and Salzano, F M (2010) Evaluation of the impact of functional diversification on Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, and Pinaceae alcohol dehydrogenase enzymes J Mol Model 16 pp 919-28 50 Tieman, D., Zhu, G., Resende, M F., Jr., Lin, T., Nguyen, C., Bies, D., Rambla, J L., Beltran, K S., Taylor, M., Zhang, B., Ikeda, H., Liu, Z., Fisher, J., Zemach, I., Monforte, A., Zamir, D., Granell, A., Kirst, M., Huang, S., and Klee, H (2017) A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor Science 355 pp 391-394 51 Tony Buhr, S S., Farida Ebrahim, Aiqiu Xing, You Zhou, Michelle Mathiesen, Bruce Schweiger, Anthony Kinney, Paul Staswick, Tom Clemente (2002) 47 download by : skknchat@gmail.com Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean 52 Twell, D., Yamaguchi, J., and McCormick, S (1990) Pollen-specific gene expression in transgenic plants: coordinate regulation of two different tomato gene promoters during microsporogenesis Development 109 pp 705-13 53 Waltz, E (2016) Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation Nature 532, 293 54 Wang, F., Wang, C., Liu, P., Lei, C., Hao, W., Gao, Y., Liu, Y G., and Zhao, K (2016) Enhanced Rice Blast Resistance by CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the ERF Transcription Factor Gene OsERF922 PLoS One 11, e0154027 55 Wang, S., Zhang, S., Wang, W., Xiong, X., Meng, F., and Cui, X (2015) Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system Plant Cell Rep 34, 1473-6 56 Wei, M Y., and Giovannucci, E L (2012) Lycopene, Tomato Products, and Prostate Cancer Incidence: A Review and Reassessment in the PSA Screening Era J Oncol 2012, 271063 57 Weigel, D., and Glazebrook, J (2006) Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method CSH Protoc 2006 58 Wing, R A., Yamaguchi, J., Larabell, S K., Ursin, V M., and McCormick, S (1990) Molecular and genetic characterization of two pollen-expressed genes that have sequence similarity to pectate lyases of the plant pathogen Erwinia Plant Mol Biol 14 pp 17-28 59 Woo, J W., Kim, J., Kwon, S I., Corvalán, C., Cho, S W., Kim, H., Kim, S.-G., Kim, S.-T., Choe, S., and Kim, J.-S (2015) DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins Nature Biotechnology 33 pp 1162 60 Xing, H L., Dong, L., Wang, Z P., Zhang, H Y., Han, C Y., Liu, B., Wang, X C., and Chen, Q J (2014) A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants BMC Plant Biol 14, 327 61 Xu, R., Li, H., Qin, R., Wang, L., Li, L., Wei, P., and Yang, J (2014) Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice Rice 7, 5-5 62 Yu, Q H., Wang, B., Li, N., Tang, Y., Yang, S., Yang, T., Xu, J., Guo, C., Yan, P., Wang, Q., and Asmutola, P (2017) CRISPR/Cas9-induced Targeted Mutagenesis and Gene Replacement to Generate Long-shelf Life Tomato Lines Sci Rep 7, 11874 48 download by : skknchat@gmail.com B Trang web điện tử 63 http://www.addgene.org/ 64 https://plants.sc.egov.usda.gov/java/ 65 https://solgenomics.net/ 66 https://www.uniprot.org/ 49 download by : skknchat@gmail.com ... khiển Cas9 gRNA không tạo đột biến mẫu mô phân sinh cà chua hệ đầu T0 Hệ thống CRISPR/ Cas9 với cấu trúc chứa promoter LAT52 điều kiển hoạt động Cas9 tạo đột biến phấn hoa cà chua chứng minh kết đột. .. hoạt động đặc thù hạt phấn Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài ? ?Ứng dụng hệ thống CRISPR/ Cas9 tạo đột biến phấn hoa cà chua? ?? 1.2 GIẢ THIẾT KHOA HỌC Hệ thống CRISPR/ Cas9 có khả chỉnh sửa... trúc LAT52-GUS Hệ thống CRISPR/ Cas9 công nghệ hiệu ứng dụng chỉnh sửa genome Thông qua cấu trúc pKSE401 ADH2-4, hệ thống CRISPR/ Cas9 tạo đột biến gen ADH2-4 mẫu cà chua với tỷ lệ đột biến 13,33%