Phần 4 : Kết quả và thảo luận
4.2. Chuyển các cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium
4.2.4. Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome của hệ thống CRISPR/Cas9
Trong cấu trúc đối chứng, ở thế hệ đầu T0 hiệu quả chuyển gen đạt 100% và tỷ lệ đột biến là 13,33%. Tỷ lệ này tương đồng với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đó. Chẳng hạn như tỷ lệ đột biến tạo bởi hệ thống CRISPR/Cas9 trên cây ngô là 13,1% (Liang et al., 2014), trên một loại rêu Marchantia polymorpha L. là 11% (Sugano et al., 2014), trên Arabidopsis thaliana có tỷ lệ đột biến từ 2,5% lên tới 70% (Fauser et al., 2014) hay trên gạo là 2 – 16% (Xu et al., 2014).
Đối với cấu trúc chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9, hiệu quả chuyển gen là 21,57% (có 11 chồi nhận gen chuyển trên tổng số 51 chồi) và tỷ lệ đột biến là 72,73% (8 trong 11 chồi mang đột biến) trong thế hệ đầu T0. Kết quả này không như mong đợi vì theo giả thuyết, không tìm thấy đột biến ở thế hệ này. Tuy nhiên, số lượng mẫu trong thí nghiệm này còn ít nên độ tin cậy chưa cao, vì vậy cần tăng số lượng mẫu để có kết luận chính xác.
Cuối cùng là cấu trúc chứa hai promoter LAT52 và LAT59 điều khiển gRNA và Cas9, hiệu quả chuyển gen đạt 88,24% (30 trên tổng số 34 chồi nhận toàn bộ gen chuyển) và tỷ lệ đột biến trong thế hệ đầu T0 là 0% (Bảng 4.2), đạt kết quả như kỳ vọng.
Bảng 4.2. Hiệu quả chuyển gen và tỷ lệ đột biến của các cấu trúc dựa trên pKSE401 ADH2-4
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả mang đột biến Số lượng chồi Tỷ lệ đột biến pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA 35S-Cas9 60 60 100% 8 13,33% pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 51 11 21,57% 8 72,73% pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 34 30 88,24% 0 0%
trong khi Cas9 chịu sự điều khiển của promoter LAT52 thì gRNA vẫn hoạt động mạnh dưới sự điều khiển của promoter U6-26 tạo đột biến ở thế hệ đầu T0. Khi thay thế hoàn toàn bởi các promoter LAT52 và LAT59, không có đột biến xảy ra ở thế hệ đầu T0. Vì vậy, gRNA là nhân tố chỉnh ảnh hưởng đến tỷ lệ đột biến.
Trong cấu trúc đối chứng, đột biến được dự đoán bằng phương pháp PCR (Hình 4.10) và và sử dụng enzyme cắt giới hạn (Hình 4.11). Có 8 trên tổng số 60 mẫu được dự đoán mang đột biến sau khi gen ADH2-4 của các mẫu này được nhân lên để kiểm tra và cắt bởi enzyme BstNI.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Các mẫu cho kết quả đột biến ở gen ADH2-4 là mẫu số 15, 18, 25, 33, 35, 36, 37 và 59
Hình 4.10. Dự đoán đột biến bằng phương pháp PCR
Các mẫu đột biến được tìm thấy sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn hoàn toàn trùng khớp với các mẫu được dự đoán bằng phương pháp PCR.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.11. Dự đoán đột biến bằng enzyme cắt giới hạn BstNI
Kết quả cuối cùng được kiểm chứng thông qua giải trình tự. Các dạng đột biến phổ biến nhất được phát hiện là đột biến mất đoạn. Ngoài ra, đột biến thêm đoạn cũng được tìm thấy (Hình 4.12). Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng tạo đột biến ở cấu trúc đối chứng. Tuy nhiên, đây là kiểu đột biến hoàn toàn ngẫu nhiên, không thể có sự lặp lại một cách chính xác.
Hình 4.12. Trình tự gen ADH2-4 của cấu trúc đối chứng pKSE401 ADH2-4
Trong hai cấu trúc có chứa promoter LAT52 và LAT59, chúng tôi quan tâm những cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0, vì vậy chúng tôi sử dụng giải trình tự để xác nhận.
Hình 4.13. Trình tự gen ADH2-4 ở cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 (a) và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 (b)
Các cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0 của cấu trúc pKSE401 ADH2- 4 U6-gRNA LAT52-Cas9 được thẩm tra bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI để đảm bảo chúng không phải là cây chimeric. Bởi vì sau khi tiến hành nuôi cấy mô, một chồi có thể nhận nhiều quần thể tế bào khác nhau trong quá trình hình thành callus và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
a
Hình 4.14. Minh họa các bộ phận khác nhau của cây cà chua được thẩm tra
Mẫu 1, 2: mô phân sinh thu được từ các cành khác nhau Mẫu 3, 4, 5: mẫu lá thu được từ các cành khác nhau P: mẫu đối chứng gen ADH2-4 từ cây cà chua bình thường
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn của các mẫu mô khác nhau
Hình ảnh điện di (Hình 4.15) cho thấy gen ADH2-4 không có sự đột biến khi được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BstNI từ các mẫu mô khác nhau của cây cà chua. Như vậy, cây cà chua thế hệ đầu T0 không chứa đột biến ở các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá). Những cây này được chuyển ra nhà lưới, tiếp tục quá trình sinh trưởng, phát triển, ra hoa và kết quả.