4.1.1. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pCAMBIA1301
Chuyển gen thực vật là một kĩ thuật được tiến hành ở hàng trăm phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, đặc biệt là việc sử dụng vật mang trung gian như vi khuẩn. Tuy nhiên, một số vật mang trung gian biến các cấu trúc trở nên phức tạp và cồng kềnh, dẫn đến hiệu quả sao chép thấp, kích thước lớn, hạn chế thao tác sử dụng các vị trí enzyme cắt giới hạn.
Vector pCAMBIA có nguồn gốc từ vector pPZP mang nhiều lợi ích hơn hẳn so với các vector truyền thống. Số lượng bản sao trong E. coli lớn, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong A. tumefaciens, kích thước chỉ từ 7 – 12 kb, các vị trí enzyme cắt giới hạn được thiết kế cho vector này với những sửa đổi đáng kể, các liên kết poly tuy nhỏ nhưng đầy đủ nhằm tạo ra DNA mục tiêu, với gen kháng kháng sinh cho thực vật là Hygromycine hoặc Kanamycine. Hiện nay, hệ thống các vector pCAMBIA trở nên phổ biến bởi sự vận hành dễ dàng, ổn định và sự tồn tại của một loạt các gen chọn lọc cùng các gen chỉ thị khác nhau (Leclercq et al., 2015).
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS
Hình 4.1. Sơ đồ các cấu trúc gen GUS được điều khiển bởi các promoter LAT52 và LAT59
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 với gen chỉ thị là gen GUS và gen chọn lọc là Hygromycine. Chúng tôi thay thế promoter 35S lần lượt bởi các promoter LAT52 và LAT59. Phương pháp được lựa chọn nhằm tạo ra hai vector mới là sử dụng enzyme cắt giới hạn HindIII và NCoI tạo đầu cắt so le, thuận tiện cho phản ứng nối bởi enzyme T4. Mục đích của hai vector là biểu hiện gen chỉ thị gen GUS, từ đó đánh giá mức độ hoạt động của hai promoter này.
Chuyển vector thu được vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 20 mg/l Hygromycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để khẳng định chắc chắn sự có mặt vector tái tổ hợp promoter – gen GUS bên trong vi khuẩn E.
coli, chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường chọn lọc và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GUS-F/GUS-R.
Mẫu số 1 – 8: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên P1, P2: mẫu đối chứng chứa DNA mẫu là plasmid pCAMBIA1301
Hình 4.2. Ảnh điện di sản phẩm colony-PCR của các khuẩn lạc
Trong số tám mẫu khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên của vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS, ngoại trừ mẫu số 1, bảy mẫu còn lại xuất hiện băng vạch 898 bp (gen GUS) chứng tỏ sự có mặt của vector tái tổ hợp này trong vi khuẩn E. coli. Tương tự, ở vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS, tất cả tám mẫu khuẩn lạc xuất hiện băng vạch thể hiện sự có mặt của gen GUS (898 bp). Điều này chứng minh vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS đã được biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.2).
4.1.2. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pKSE401 ADH2-4
Vector pKSE401 được thiết kế bởi Qi-Jun Chen và cộng sự vào năm 2014 dựa trên khung của vector pCAMBIA (Xing et al., 2014). Nhằm tăng cường ứng
dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trên các loại thực vật khác nhau, pKSE401 được hình thành với hai hệ thống biểu hiện đặc hiệu gồm promoter U6-26 điều kiển gRNA và CaMV 35S điều khiển Cas9.
Sợi oligo kép gRNA được thiết kế lại và thay thế cho gRNA ban đầu trong vector pKSE401. Cuối cùng, vector pKSE401 ADH2-4 được hình thành tại Trung tâm Rau Thế giới với mục tiêu tạo đột biến ở gen ADH2-4 của cà chua.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pKSE401 ADH2-4 thay thế lần lượt các promoter U6-26 và 35S điều kiển gRNA và Cas9 bằng các promoter LAT52 và LAT59. Cuối cùng, hai vector được hình thành là vector pKSE401 ADH2-4 LAT52-Cas9 với promoter LAT52 thay thế cho 35S và vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 chứa hai promoter LAT52 và LAT59.
Hình 4.3. Sơ đồ các cấu trúc CRISPR/Cas9 được tạo thành
Chuyển các vector tái tổ hợp lần lượt vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 25 mg/l Kanamycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để kiểm tra sự có mặt vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 bên trong vi khuẩn E. coli,
chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi insert2-F2/insert2-R.
Mẫu số 1 – 12: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn một cách ngẫu nhiên P: mẫu đối chứng
Hình 4.4. Ảnh điện di khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pKSE401 ADH2-4 U6- gRNA LAT52-Cas9 và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9
Đối với vector pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9, có 11 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch 325 bp (một phần gRNA và promoter LAT52). Đối với vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9, chỉ có 3 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch này. Kết quả đã chứng minh cả hai vector đã được biến nạp vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.4).
4.2. CHUYỂN CÁC CẤU TRÚC VÀO CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (GV3101::PMP90) KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (GV3101::PMP90)
4.2.1. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector tái tổ hợp
Các vector tái tổ hợp lần lượt được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng sốc nhiệt dựa trên phương pháp của Weigel và Glazebrook với một số cải biến (Weigel and Glazebrook, 2006). Dịch khuẩn được cấy trang trên môi trường đĩa thạch YEP có bổ sung 50 µg/ml Kanamycine và 50 µg/ml Gentamycine. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C, các khuẩn lạc tốt, trắng trong, nhầy lồi, biên khuẩn lạc đều, tròn được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường YEP lỏng.
Hình 4.5. Cấy trang vi khuẩn A. tumefaciens
4.2.2. Chuyển các cấu trúc vào cây cà chua
Vi khuẩn A. tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn này là tác nhân gây khối u trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Ti-plasmid) của nó vào tế bào thực vật. Ti-DNA sau đó được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen. Lợi dụng cơ chế này, từ những năm 1980, chúng được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật (Hamilton, 1997).
Sau khi hoàn thành việc chuyển các cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi tiến hành lây nhiễm với cây cà chua. Giống cà chua CLN1621 được cung cấp bởi Trung tâm Rau Thế giới có đặc tính sinh trưởng phát triển tốt được sử dụng trong nghiên cứu này.
Các dòng vi khuẩn mang 6 cấu trúc khác nhau (cấu trúc gen GUS đối chứng, cấu trúc gen GUS với promoter LAT52, cấu trúc gen GUS với promoter LAT59; cấu trúc CRISPR/Cas9 đối chứng, cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter đặc hiệu phấn hoa và cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa hai promoter đặc hiệu ở phấn hoa) được tiến hành thí nghiệm một cách độc lập. Mẫu lá mầm là vật liệu nhận gen chuyển thu được sau 7 đến 10 ngày gieo hạt ở 240C với 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày. Các mẫu lá mầm này được đặt trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 0,5 mg/L IAA trong 2 ngày (Hình 4.6). Vi khuẩn A. tumefaciens
mang cấu trúc cần chuyển được nuôi cấy ít nhất 30 giờ trước khi lây nhiễm trong môi trường YEP lỏng có bổ sung 100 mg/L Kanamycine, 50 mg/L Gentamycine.
Hình 4.6 Mẫu lá mầm trên môi trường dinh dưỡng
Quá trình đồng nuôi cấy được tiến hành trong môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Hygromycine (các cấu trúc của gen GUS) hoặc Kanamycine (các cấu trúc CRISPR/Cas9). Sau 2 ngày, các mẫu lá mầm được chuyển sang nuôi cấy tạo callus, chồi được hình thành trên môi trường kéo dài có bổ sung 0,25 mg/L GA3 (Hình 4.7).
Hình 4.7 Nuôi cấy tạo chồi trên môi trường có bổ sung 0,25 mg/L GA3
Dựa trên thực nghiệm với tổng số 16 lần tái sinh và biến nạp độc lập cho 6 cấu trúc khác nhau, trải qua quá trình chọn lọc liên tục, phần lớn các mẫu lá hóa đen hoặc chết trong môi trường chọn lọc. Những mẫu sống sót sau các quá trình này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Hình 4.8).
Hình 4.8 Chồi tái sinh có sức sống cao 4.2.3 Đánh giá hoạt động của các promoter LAT52 và LAT59
Ở các cấu trúc được xây dựng dựa trên vector pCAMBIA1301, hiệu quả chuyển gen khoảng từ 35% đến 41% được thể hiện ở Bảng 4.1. Cụ thể, ở cấu trúc đối chứng 35S-GUS là 35,29%, ở cấu trúc LAT52-GUS là 40,91% và ở cấu trúc LAT59-GUS là 36,92%. Kết quả này cho thấy sự đồng đều trong quá trình chuyển gen của từng cấu trúc cũng như các thao tác thực hiện từ nhân dòng, chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens cho đến chuyển gen vào cây cà chua tương đối ổn định.
Đối với kết quả nhuộm gen GUS, ở mẫu đối chứng chứa promoter 35S, chúng tôi đã tìm được 3 mẫu lá xuất hiện màu xanh lam đặc trưng. Hơn nữa, 100% những cây đó cho kết quả nhuộm xanh lam ở hạt phấn. Kết quả chỉ ra rằng promoter 35S hoạt động ở cả cơ quan sinh dưỡng (lá) và hạt phấn của cây cà chua.
Đối với các cấu trúc kiểm tra hoạt động của promoter LAT52 và LAT59, lần lượt 77,78% và 95,83% (Bảng 4.1) không phát hiện màu xanh lam ở lá. Mặt khác, đối với các cây chứa promoter LAT52, màu xanh lam đặc trưng được tìm thấy ở 100% các hạt phấn. Như vậy, promoter LAT52 không hoạt động ở cơ quan sinh dưỡng, chỉ hoạt động ở phấn hoa cà chua.
Do thời gian hạn chế, chúng tôi chưa thể thu hoạch và đánh giá hạt phấn từ những cây chứa promoter LAT59.
Bảng 4.1. Hiệu quả chuyển gen và biểu hiện của gen GUS ở các cấu trúc dựa trên pCAMBIA1301
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu lá Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu phấn hoa
35S-GUS 17 6 35,29% 50,00% 100%
LAT52-GUS 22 9 40,91% 23,22% 100%
LAT59-GUS 65 24 36,92% 4,17% (chưa kiểm tra) Màu xanh lam được tìm thấy ở lá, bao phấn và phấn hoa của cấu trúc đối chứng chứa promoter 35S, trong khi màu xanh không được tìm thấy ở đối chứng âm. Đối với các cấu trúc có chứa promoter LAT52 hoặc LAT59, phần lớn các mẫu lá sau khi nhuộm có màu trắng. Đặc biệt, ở cấu trúc chứa promoter LAT52, các mẫu không có màu xanh ở lá nhưng màu xanh lam được tìm thấy ở bao phấn và phấn hoa. Các kết quả được minh họa ở Hình 4.9.
35S-GUS LAT52-GUS LAT59-GUS Đối chứng âm
Mẫu lá
Bao
phấn *
Phấn
hoa *
* Do thời gian hạn chế nên các mẫu này chưa được đánh giá
Hình 4.9. Mẫu lá, bao phấn và hạt phấn của các dòng chuyển gen sau khi nhuộm X-gluc
4.2.4. Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome của hệ thống CRISPR/Cas9
Trong cấu trúc đối chứng, ở thế hệ đầu T0 hiệu quả chuyển gen đạt 100% và tỷ lệ đột biến là 13,33%. Tỷ lệ này tương đồng với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đó. Chẳng hạn như tỷ lệ đột biến tạo bởi hệ thống CRISPR/Cas9 trên cây ngô là 13,1% (Liang et al., 2014), trên một loại rêu Marchantia polymorpha L. là 11% (Sugano et al., 2014), trên Arabidopsis thaliana có tỷ lệ đột biến từ 2,5% lên tới 70% (Fauser et al., 2014) hay trên gạo là 2 – 16% (Xu et al., 2014).
Đối với cấu trúc chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9, hiệu quả chuyển gen là 21,57% (có 11 chồi nhận gen chuyển trên tổng số 51 chồi) và tỷ lệ đột biến là 72,73% (8 trong 11 chồi mang đột biến) trong thế hệ đầu T0. Kết quả này không như mong đợi vì theo giả thuyết, không tìm thấy đột biến ở thế hệ này. Tuy nhiên, số lượng mẫu trong thí nghiệm này còn ít nên độ tin cậy chưa cao, vì vậy cần tăng số lượng mẫu để có kết luận chính xác.
Cuối cùng là cấu trúc chứa hai promoter LAT52 và LAT59 điều khiển gRNA và Cas9, hiệu quả chuyển gen đạt 88,24% (30 trên tổng số 34 chồi nhận toàn bộ gen chuyển) và tỷ lệ đột biến trong thế hệ đầu T0 là 0% (Bảng 4.2), đạt kết quả như kỳ vọng.
Bảng 4.2. Hiệu quả chuyển gen và tỷ lệ đột biến của các cấu trúc dựa trên pKSE401 ADH2-4
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả mang đột biến Số lượng chồi Tỷ lệ đột biến pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA 35S-Cas9 60 60 100% 8 13,33% pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 51 11 21,57% 8 72,73% pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 34 30 88,24% 0 0%
trong khi Cas9 chịu sự điều khiển của promoter LAT52 thì gRNA vẫn hoạt động mạnh dưới sự điều khiển của promoter U6-26 tạo đột biến ở thế hệ đầu T0. Khi thay thế hoàn toàn bởi các promoter LAT52 và LAT59, không có đột biến xảy ra ở thế hệ đầu T0. Vì vậy, gRNA là nhân tố chỉnh ảnh hưởng đến tỷ lệ đột biến.
Trong cấu trúc đối chứng, đột biến được dự đoán bằng phương pháp PCR (Hình 4.10) và và sử dụng enzyme cắt giới hạn (Hình 4.11). Có 8 trên tổng số 60 mẫu được dự đoán mang đột biến sau khi gen ADH2-4 của các mẫu này được nhân lên để kiểm tra và cắt bởi enzyme BstNI.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Các mẫu cho kết quả đột biến ở gen ADH2-4 là mẫu số 15, 18, 25, 33, 35, 36, 37 và 59
Hình 4.10. Dự đoán đột biến bằng phương pháp PCR
Các mẫu đột biến được tìm thấy sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn hoàn toàn trùng khớp với các mẫu được dự đoán bằng phương pháp PCR.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.11. Dự đoán đột biến bằng enzyme cắt giới hạn BstNI
Kết quả cuối cùng được kiểm chứng thông qua giải trình tự. Các dạng đột biến phổ biến nhất được phát hiện là đột biến mất đoạn. Ngoài ra, đột biến thêm đoạn cũng được tìm thấy (Hình 4.12). Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng tạo đột biến ở cấu trúc đối chứng. Tuy nhiên, đây là kiểu đột biến hoàn toàn ngẫu nhiên, không thể có sự lặp lại một cách chính xác.
Hình 4.12. Trình tự gen ADH2-4 của cấu trúc đối chứng pKSE401 ADH2-4
Trong hai cấu trúc có chứa promoter LAT52 và LAT59, chúng tôi quan tâm những cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0, vì vậy chúng tôi sử dụng giải trình tự để xác nhận.
Hình 4.13. Trình tự gen ADH2-4 ở cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 (a) và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 (b)
Các cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0 của cấu trúc pKSE401 ADH2- 4 U6-gRNA LAT52-Cas9 được thẩm tra bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI để đảm bảo chúng không phải là cây chimeric. Bởi vì sau khi tiến hành nuôi cấy mô, một chồi có thể nhận nhiều quần thể tế bào khác nhau trong quá trình hình thành callus và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
a
Hình 4.14. Minh họa các bộ phận khác nhau của cây cà chua được thẩm tra
Mẫu 1, 2: mô phân sinh thu được từ các cành khác nhau Mẫu 3, 4, 5: mẫu lá thu được từ các cành khác nhau P: mẫu đối chứng gen ADH2-4 từ cây cà chua bình thường
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn của các mẫu mô khác nhau
Hình ảnh điện di (Hình 4.15) cho thấy gen ADH2-4 không có sự đột biến khi được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BstNI từ các mẫu mô khác nhau của cây cà chua. Như vậy, cây cà chua thế hệ đầu T0 không chứa đột biến ở các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá). Những cây này được chuyển ra nhà lưới, tiếp tục quá trình sinh trưởng, phát triển, ra hoa và kết quả.
4.3. KIỂM TRA ĐỘT BIẾN Ở THẾ HỆ THỨ HAI T1