Phần 4 : Kết quả và thảo luận
4.3.Kiểm tra đột biến ở thế hệ thứ hai T1
nảy mầm. Sau khoảng 15 ngày, cây con thế hệ thứ hai T1 được hình thành như hình 4.16. Sau đó, chúng tôi tiến hành đánh số, thu mẫu, và tách chiết DNA. Đột biến được dự đoán bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI cho gen mục tiêu ADH2-4 (Hình 4.17).
Hình 4.16. Các cây con thế hệ thứ hai T1
Mẫu số 1 – 48: Gen ADH2-4 của các cây con thế hệ thứ hai T1
P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.17. Dự đoán đột biến ở thế hệ thứ hai T1 bằng enzyme cắt giới hạn
Các mẫu có khả năng chứa đột biến được nhân lên, tinh chế từ bản gel và chuyển vào vector pGEM®-T Easy Vector System I (Promega). Dịch khuẩn được cấy trang trên môi trường thạch LB có bổ sung IPTG, X-gal và Ampicillin (phương pháp tách dòng gen – sàng lọc xanh – trắng). Sau đó, các đĩa thạch được ủ ở 370C qua đêm. Cuối cùng, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc có màu trắng, xác thực và sao chép, chuyển đến công ty giải trình tự.
Ở thế hệ này, chúng tôi tìm thấy 2 kiểu alen trên mỗi cây con như giả thuyết ban đầu bao gồm một alen bình thường và một alen đột biến. Cụ thể, cây số 4 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn, cây số 30 có một alen bình thường và một alen mất đoạn, cây số 35 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn. Một băng vạch khác các băng 128 bp và 42 bp xuất hiện ở các mẫu đột biến (gen
ADH2-4 bình thường có kích thước 170 bp sẽ được cắt thành hai mảnh là 128 bp và 42 bp bằng enzyme cắt giới hạn BstNI). Như vậy, hình ảnh điện di (Hình 4.17) cho thấy sự dự đoán đột biến phù hợp với kết quả giải trình tự thu được. Mỗi cây con được xác nhận nhiều lần nhằm chứng minh sự đáng tin cậy của kết quả. Vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BstNI (trình tự nhận biết CCAGG) bị phá vỡ ở cây số 4 và cây số 30 được thể hiện ở kết quả giải trình tự (Hình 4.18).
Hình 4.18. Các trình tự đột biến trên thế hệ thứ hai T1 của cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9
Cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9 cho kết quả đột biến trên gen ADH2-4 ở thế hệ sau T1 với kiểu đột biến dị hợp. Kết quả này chứng minh rằng hệ thống CRISPR/Cas9 chứa promoter đặc hiệu phấn hoa LAT52 có thể tạo ra đột biến trên phấn hoa cà chua.