Trộn các thành phần trong Assembly Master Mix, ủ ở 500C trong 4 giờ.
3.3.2. Nhân dòng vector tái tổ hợp bằng vi khuẩn E.coli (Froger and Hall, 2007) 2007)
- Cho 10 µl sản phẩm của phản ứng nối vào tuýp chứa 100 µl dịch khuẩn (cung cấp bởi Addgene.Co)
- Trộn nhẹ và giữ trên đá khoảng 5 – 10 phút - Sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây
- Nhanh chóng đặt trên đá 2 phút
- Thêm 900 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc 45-60 phút ở 370C
- Hút 200 µl dịch khuẩn cấy trang trên đĩa môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 µg/ml Hygromycine hoặc 50 µg/ml Kanamycine
- Nuôi cấy qua đêm ở 370C
- Chọn 4-5 khuẩn lạc đơn trong đĩa nuôi cấy và chuyển vào 3 – 5 ml LB lỏng chứa 50µg/mL Kanamycine
- Nuôi lắc qua đêm ở 370C
- Tách plasmid DNA bằng KIT Mini Plus Plasmid DNA Extraction System (Viogene)
3.3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn A.tumefaciens bằng sốc nhiệt (Weigel and Glazebrook, 2006) (Weigel and Glazebrook, 2006)
- Lấy tuýp chứa 100 µl khuẩn A.tumefaciens (GV3101::pMP90) từ -800C, dã đông trên đá.
- Thêm 1-2 µg plasmid DNA của mỗi cấu trúc vào tuýp khuẩn, trộn nhẹ. - Làm đông hỗn hợp bằng nitơ lỏng 5 phút.
- Chuyển các tuýp sang bể ủ nhiệt 370C trong 5 phút.
- Bổ sung 1ml môi trường YEP lỏng, nuôi cấy khuẩn ở 280C khoảng 2-4 giờ, lắc nhẹ.
- Ly tâm 5000 vòng, 1 phút ở 40C, thu lấy tủa, hòa tan bằng 100 µl YEP. - Dịch khuẩn được cấy trên môi trường đĩa thạch YEP đã bổ sung 50 µg/ml Kanamycine và 50 µg/ml Gentamycine.
- Hình thành khuẩn lạc sau khi ủ các đĩa petri 2 ngày ở 280C.
- Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm bằng kĩ thuật PCR sau khi tách chiết DNA plasmid.
3.3.4 Chuyển các cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
3.3.4.1 Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
Thành phần 100ml môi trường MS Sucrose Agar 0,22 g 3 g 0,7 g
Hộp nuôi cấy (5x5x10cm3), mật độ 40 – 42 hạt/hộp, thời gian gieo hạt 7 ngày, ở 240C điều kiện 16h chiếu sáng. Cây xuất hiện 2 lá mầm, đặt trên môi trường dinh dưỡng 2 ngày, sẵn sàng cho lây nhiễm.
3.3.4.2. Tạo dich huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn YEP
Thành phần 100ml môi trường Pepton Yeast extract NaCl 1 g 1 g 0,5 g
Chứa 20 ml môi trường trong bình tam giác, hấp khử trùng, bổ sung kháng sinh gồm 50 µg/ml Kanamycine và 50 µg/ml Gentamycine. Nuôi cấy 1-2 khuẩn lạc đơn trong 20 ml YEP, 30 giờ ở 280C, 175rmp.
3.3.4.3. Cảm ứng mẫu, lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Bổ sung 8µl AS vào dịch vi khuẩn trước 4h lây nhiễm.
Ly tâm 6000 rmp, 5 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, thu lấy cặn vi khuẩn. Hòa tan cặn khuẩn trong môi trường MSO (0,443 g MS trong 100ml môi trường, pH = 5,8)
Điều chỉnh OD600 = 0,5 trong môi trường MSO chứa 200 µM AS. Ngâm lá mầm trong 40 ml dịch khuẩn khoảng 5 phút, lắc nhẹ.
Làm ráo bằng giấy lọc và đặt lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy (100 ml chứa 0,443 g MS, 3 g sucrose, 200 µl BA và 0,7 g agar) trong 2 ngày.
3.3.4.4. Rửa khuẩn và tái sinh chồi
Sau thời gian đồng nuôi cấy, các lá mầm được rửa bằng dung dịch 100 ml nước chứa 1 ml Carbecilin 50 mg/mL và 200 µl Cefotaxime 50 mg/mL lắc nhẹ 10 phút rồi thấm khô trên giấy vô trùng.
Đặt mẫu trên môi trường cảm ứng callus ở 240C điều kiện 16h chiếu sáng Thành phần Cấu trúc promoter-GUS Cấu trúc CRISPR/Cas9 MS Sucrose BA 1 mg/ml Agar IAA 100 mg/ml 0,443 g 3 g 200 µl 0,7 g 50 µl 0,443 g 3 g 200 µl 0,7 g 50 µl Kanamycine 50 mg/ml 100 µl Hygromycine 50 mg/ml 50 µl Cefotaxime 50 mg/ml Ticarcillin2NA 50 mg/ml 500 µl 200 µl 500 µl 200 µl
Sau 14 ngày, các callus được chuyển sang môi trường kích thích sự phân chia các tế bào mô sẹo
Thành phần Cấu trúc promoter-GUS Cấu trúc CRISPR/Cas9 MS Sucrose BA 1 mg/ml Agar IAA 100 mg/ml 0,443 g 3 g 200 µl 0,7 g 40 µl 0,443 g 3 g 200 µl 0,7 g 40 µl Kanamycine 50mg/ml 100 µl Hygromycine 50 mg/ml 50 µl Cefotaxime 50 mg/ml Ticarcillin2NA 50 mg/ml 400 µl 200 µl 400 µl 200 µl
Khi callus đủ lớn, chuyển sang môi trường kích thích sinh chồi Enlongation Medium có bổ sung kháng sinh chọn lọc.
Thành phần Cấu trúc promoter-GUS Cấu trúc CRISPR/Cas9 MS Sucrose BA 1mg/ml Agar 0,443 g 3 g 25 µl 0,7 g 0,443 g 3 g 25 µl 0,7 g Kanamycine 50 mg/ml 100 µl Hygromycine 50 mg/ml 30 µl Cefotaxime 50 mg/ml Ticarcillin2NA 50 mg/ml GA3 1mg/ml 200 µl 200 µl 25 µl 200 µl 200 µl 25 µl
Chồi phát triển từ 2 – 4 lá sẽ được chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễ
Thành phần Cấu trúc promoter-GUS Cấu trúc CRISPR/Cas9
MS Sucrose Agar IAA 100 mg/ml 0,443 g 3 g 0,7 g 50 µl 0,443 g 3 g 0,7 g 50 µl Kanamycine 50 mg/ml 50 µl Hygromycine 50 mg/ml 20 µl Cefotaxime 50 mg/ml Ticarcillin2NA 50 mg/ml 200 µl 100 µl 200 µl 100 µl 3.3.5. Đánh giá và chọn lọc
3.3.5.1. Các cấu trúc kiểm tra hoạt động của các promoter
a. Kiểm tra cây chuyển gen sử dụng kỹ thuật PCR
Bước 1: Tách chiết mẫu lá trên các cây biến nạp Bước 2: Kiểm tra gen biến nạp bằng kĩ thuật PCR
Cấu trúc Gen Cặp mồi Kích thước pCAMBIA1301 35S promoter 35S+GUS-F: 5-TCAGAAGACCAAAGGGCAAT 35S+GUS-R: 5-TGATGCTCCATCACTTCCTG 919bp
GUS GUS-F: 5-AACGGCAAGAAAAAGCAGTC
GUS-R: 5-GAGCGTCGCAGAACATTACA 898bp
pCAMBIA1301 + LAT52
LAT52 promoter
LAT52 GUS-F: 5-TACAAGCTTccttggataagggtagctc
GUS-R1: 5-AATATCTGCATCGGCGAACT 1082bp
GUS GUS-F: 5-AACGGCAAGAAAAAGCAGTC
GUS-R: 5-GAGCGTCGCAGAACATTACA 898bp
pCAMBIA1301 + LAT59
LAT59 promoter
LAT59 GUS-F: 5-atccatAAGCTTgagctctctctaaagaagttg
GUS-R1: 5-AATATCTGCATCGGCGAACT 1707bp
GUS GUS-F: 5-AACGGCAAGAAAAAGCAGTC
GUS-R: 5-GAGCGTCGCAGAACATTACA 898bp
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agrose 0,8%
Bước 3: Trồng đến lúc ra hoa, kiểm tra hoạt động của các promoter bằng phương pháp nhuộm gen GUS.
b. Kiểm tra sự có mặt của gen GUS
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch nhuộm * Reaction Buffer Thành phần 1000 ml 100 mM Tris Buffer 50 mM NaCl 0,1% Trion – X100 12,11 g 3,51 g 1 ml Điều chỉnh pH = 7 và hấp khử trùng
* Dung dịch X-Glu (pha mới trước mỗi lần sử dụng)
Thành phần dung dịch bao gồm 22,5 ml Reaction Buffer, 14,8 mg 2 mM Potassium Ferriyanide và 20 mg X-Gluc. Giữ dung dịch ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
Bước 2: Thu lá, ủ trong dung dịch X-Glu ở điều kiện 370C trong 24 – 48 giờ. Phá hủy diệp lục bằng cồn 70% (rửa 2-3 lần mỗi lần cách nhau 3-5 giờ).
3.3.5.2. Các cấu trúc chứng minh khả năng chỉnh sửa gen của hệ thống CRISPR/Cas9 đặc hiệu ở phấn hoa cà chua
a. Kiểm tra sự có mặt của gen biến nạp bằng phương pháp PCR
Cấu trúc Gen Cặp mồi Kích thước (bp)
pKSE401 ADH2-4
ADH ADH2-4g_F: aattgtggagagtgtaggtga
ADH2-4g_R: gaccatcactaatcataactcc 170
gRNA insert2-F2: 5-tcacaaagtgctaggtgttacagatcttcaacc
insert2-R: 5-gagctacccttatccaaggaagcttattggtttatctcatcggaac 325
Cas9 Cas9-2F: 5-agaccgtgaaggttgtggac
Cas9-2R: 5-tagtgatctgccgtgtctcg 570 pKSE401 ADH2-4 + LAT52 LAT52 +gRNA ADH-F: 5-caaaagtcccacatcgctta
LAT52 Cas9-R: tcatctagaggagcacaatagcctttgc 1053
Cas9 Cas9-2F: 5-agaccgtgaaggttgtggac
Cas9-2R: 5-tagtgatctgccgtgtctcg 570
gRNA insert2-F2: 5-tcacaaagtgctaggtgttacagatcttcaacc
insert2-R: 5-gagctacccttatccaaggaagcttattggtttatctcatcggaac 325
ADH ADH2-4g_F: aattgtggagagtgtaggtga
ADH2-4g_R: gaccatcactaatcataactcc 170 pKSE401 ADH2-4 + LAT52 + LAT59 LAT52 +gRNA insert2-F2: 5-tcacaaagtgctaggtgttacagatcttcaacc
LAT52 Cas9-R: 5-tcatctagaggagcacaatagcctttgc 994
LAT59 +gRNA insert1-F: 5-taaaacgacggccagtgccaagcttgagctctctctaaagaagttgaaatac insert2-R: 5-gagctacccttatccaaggaagcttattggtttatctcatcggaac 1650
Cas9 Cas9-2F: 5-agaccgtgaaggttgtggac
Cas9-2R: 5-tagtgatctgccgtgtctcg 570
gRNA insert2-F2: 5-tcacaaagtgctaggtgttacagatcttcaacc
insert2-R: 5-gagctacccttatccaaggaagcttattggtttatctcatcggaac 325
ADH ADH2-4g_F: aattgtggagagtgtaggtga
ADH2-4g_R: gaccatcactaatcataactcc 170
b. Xác định đột biến tạo bởi cấu trúc pKSE401 ADH2-4 (mẫu đối chứng)
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu kiểm tra sự đột biến trên đoạn gene ADH2-4, sản phẩm được kiểm tra trên gel acrylamid 6%, đột biến xuất hiện khi các băng
vạch có kích thước khác nhau.
Acrylamid 6% 100 ml
APS10% 1000 µl
Tedmed 70 µl
Gel được chạy trên thiết bị điện di đứng với đệm TBE 0.5% ở điện thế 160V trong 35 phút. Kiểm tra bản gel dưới ánh sáng tử ngoại.
- Xác định đột biến bằng phương pháp giải trình tự
Các mẫu DNA được gửi tới công ty Genomics (Đài Loan) để giải trình tự, cung cấp 10 µl sản phẩm PCR và 5 µl mồi. Kết quả trình tự được phân tích và so sánh với trình tự DNA chuẩn bằng phần mềm BioEdit.
c. Xác định mẫu không chứa đột biến tạo bởi các cấu trúc chứa promoter LAT52 và LAT59
- Kiểm tra gen ADH2-4 bằng cặp mồi đặc hiệu và kiểm tra sản phẩm trên gel Acrylamid 6%
- Sử dụng enzyme cắt giới hạn có khả năng nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu, bất kì thay đổi trong trình tự đều gây bất hoạt sự nhận diện của enzyme cắt giới hạn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI có vị trí nhận biết ngay trước trình tự PAM. Nhiều nghiên cứu cho rằng Cas9 có tỷ lệ cao cắt tại vị trí cách trình tự PAM từ 3 đến 4 nucleotides.
Hình 3.4. Trình tự gen mục tiêu gen ADH
(https://solgenomics.net)
Sản phẩm PCR Nước cất Đệm CutSmart
Enzyme BstNI (NEB)
5 µl 8.3 µl 1.5 µl 0.2 µl
Tổng 15 µl
Ủ ở điều kiện 600C qua đêm, mẫu không chứa đột biến thể hiện 2 băng vạch 128 bp và 42 bp được kiểm tra trên gel Acrylamid 6%.
d. Kiểm tra sự đột biến trên phấn hoa thông qua thế hệ thứ hai T1.
Giả sử thế hệ đầu T0 chứa noãn bình thường và phấn hoa đột biến, sau khi thụ phấn, chúng tôi có 1 alen bình thường và 1 alen đột biến ở mỗi cây con thế hệ T1 (Hình 3.5). Để kiểm tra thế hệ đầu T0 không chứa đột biến, chúng tôi tách chiết DNA từ nhiều phần khác nhau của cây, đánh giá dựa trên phương pháp PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn. Mẫu có khả năng chứa đột biến được giải trình tự tại công ty Genomics (Đài Loan).
Hình 3.5. Minh họa alen của thế hệ T0 và T1
Giải trình tự: Mẫu dự đoán chứa đột biến được chuyển vào vector
pGEM®-T Easy Vector System I (Promega), sử dụng phương pháp tách dòng gen (sàng lọc xanh – trắng). DNA được tinh chế từ các bản gel chuẩn bị cho phản ứng nối. Thành phần phản ứng nối bao gồm:
Đối chứng dương (µl) Đối chứng âm (µl) Mẫu (µl) DNA 2 3,6 Buffer 5 5 5 Vector 0,4 0,4 0,4 Enzyme T4 1 1 1 H2O 1,6 3,6 Tổng 10 10 10
Thực hiện chuyển các vector vào DH5α Escherichia coli theo sơ đồ
Hình 3.6. Phương pháp tách dòng gen
Các đĩa khuẩn được ủ ở 370C qua đêm, Sau đó, chúng tôi tiến hành chọn các khuẩn lạc màu trắng, xác thực gen mục tiêu gen ADH2-4 bằng phương pháp PCR và gửi đến công ty giải trình tự.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. XÂY DỰNG CÁC VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀ NHÂN DÒNG 4.1.1. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pCAMBIA1301 4.1.1. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pCAMBIA1301
Chuyển gen thực vật là một kĩ thuật được tiến hành ở hàng trăm phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, đặc biệt là việc sử dụng vật mang trung gian như vi khuẩn. Tuy nhiên, một số vật mang trung gian biến các cấu trúc trở nên phức tạp và cồng kềnh, dẫn đến hiệu quả sao chép thấp, kích thước lớn, hạn chế thao tác sử dụng các vị trí enzyme cắt giới hạn.
Vector pCAMBIA có nguồn gốc từ vector pPZP mang nhiều lợi ích hơn hẳn so với các vector truyền thống. Số lượng bản sao trong E. coli lớn, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong A. tumefaciens, kích thước chỉ từ 7 – 12 kb, các vị trí enzyme cắt giới hạn được thiết kế cho vector này với những sửa đổi đáng kể, các liên kết poly tuy nhỏ nhưng đầy đủ nhằm tạo ra DNA mục tiêu, với gen kháng kháng sinh cho thực vật là Hygromycine hoặc Kanamycine. Hiện nay, hệ thống các vector pCAMBIA trở nên phổ biến bởi sự vận hành dễ dàng, ổn định và sự tồn tại của một loạt các gen chọn lọc cùng các gen chỉ thị khác nhau (Leclercq et al., 2015).
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS
Hình 4.1. Sơ đồ các cấu trúc gen GUS được điều khiển bởi các promoter LAT52 và LAT59
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 với gen chỉ thị là gen GUS và gen chọn lọc là Hygromycine. Chúng tôi thay thế promoter 35S lần lượt bởi các promoter LAT52 và LAT59. Phương pháp được lựa chọn nhằm tạo ra hai vector mới là sử dụng enzyme cắt giới hạn HindIII và NCoI tạo đầu cắt so le, thuận tiện cho phản ứng nối bởi enzyme T4. Mục đích của hai vector là biểu hiện gen chỉ thị gen GUS, từ đó đánh giá mức độ hoạt động của hai promoter này.
Chuyển vector thu được vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 20 mg/l Hygromycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để khẳng định chắc chắn sự có mặt vector tái tổ hợp promoter – gen GUS bên trong vi khuẩn E.
coli, chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường chọn lọc và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GUS-F/GUS-R.
Mẫu số 1 – 8: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên P1, P2: mẫu đối chứng chứa DNA mẫu là plasmid pCAMBIA1301
Hình 4.2. Ảnh điện di sản phẩm colony-PCR của các khuẩn lạc
Trong số tám mẫu khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên của vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS, ngoại trừ mẫu số 1, bảy mẫu còn lại xuất hiện băng vạch 898 bp (gen GUS) chứng tỏ sự có mặt của vector tái tổ hợp này trong vi khuẩn E. coli. Tương tự, ở vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS, tất cả tám mẫu khuẩn lạc xuất hiện băng vạch thể hiện sự có mặt của gen GUS (898 bp). Điều này chứng minh vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS đã được biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.2).
4.1.2. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pKSE401 ADH2-4
Vector pKSE401 được thiết kế bởi Qi-Jun Chen và cộng sự vào năm 2014 dựa trên khung của vector pCAMBIA (Xing et al., 2014). Nhằm tăng cường ứng
dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trên các loại thực vật khác nhau, pKSE401 được hình thành với hai hệ thống biểu hiện đặc hiệu gồm promoter U6-26 điều kiển gRNA và CaMV 35S điều khiển Cas9.
Sợi oligo kép gRNA được thiết kế lại và thay thế cho gRNA ban đầu trong vector pKSE401. Cuối cùng, vector pKSE401 ADH2-4 được hình thành tại Trung tâm Rau Thế giới với mục tiêu tạo đột biến ở gen ADH2-4 của cà chua.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pKSE401 ADH2-4 thay thế lần lượt các promoter U6-26 và 35S điều kiển gRNA và Cas9 bằng các promoter LAT52 và LAT59. Cuối cùng, hai vector được hình thành là vector pKSE401 ADH2-4 LAT52-Cas9 với promoter LAT52 thay thế cho 35S và vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 chứa hai promoter LAT52 và LAT59.
Hình 4.3. Sơ đồ các cấu trúc CRISPR/Cas9 được tạo thành
Chuyển các vector tái tổ hợp lần lượt vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 25 mg/l Kanamycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để kiểm tra sự có mặt vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 bên trong vi khuẩn E. coli,
chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi insert2-F2/insert2-R.
Mẫu số 1 – 12: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn một cách ngẫu nhiên P: mẫu đối chứng
Hình 4.4. Ảnh điện di khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pKSE401 ADH2-4 U6- gRNA LAT52-Cas9 và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9
Đối với vector pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9, có 11 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch 325 bp (một phần gRNA và promoter LAT52). Đối với vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9, chỉ có