4.2.3 Đánh giá hoạt động của các promoter LAT52 và LAT59
Ở các cấu trúc được xây dựng dựa trên vector pCAMBIA1301, hiệu quả chuyển gen khoảng từ 35% đến 41% được thể hiện ở Bảng 4.1. Cụ thể, ở cấu trúc đối chứng 35S-GUS là 35,29%, ở cấu trúc LAT52-GUS là 40,91% và ở cấu trúc LAT59-GUS là 36,92%. Kết quả này cho thấy sự đồng đều trong quá trình chuyển gen của từng cấu trúc cũng như các thao tác thực hiện từ nhân dòng, chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens cho đến chuyển gen vào cây cà chua tương đối ổn định.
Đối với kết quả nhuộm gen GUS, ở mẫu đối chứng chứa promoter 35S, chúng tôi đã tìm được 3 mẫu lá xuất hiện màu xanh lam đặc trưng. Hơn nữa, 100% những cây đó cho kết quả nhuộm xanh lam ở hạt phấn. Kết quả chỉ ra rằng promoter 35S hoạt động ở cả cơ quan sinh dưỡng (lá) và hạt phấn của cây cà chua.
Đối với các cấu trúc kiểm tra hoạt động của promoter LAT52 và LAT59, lần lượt 77,78% và 95,83% (Bảng 4.1) không phát hiện màu xanh lam ở lá. Mặt khác, đối với các cây chứa promoter LAT52, màu xanh lam đặc trưng được tìm thấy ở 100% các hạt phấn. Như vậy, promoter LAT52 không hoạt động ở cơ quan sinh dưỡng, chỉ hoạt động ở phấn hoa cà chua.
Do thời gian hạn chế, chúng tôi chưa thể thu hoạch và đánh giá hạt phấn từ những cây chứa promoter LAT59.
Bảng 4.1. Hiệu quả chuyển gen và biểu hiện của gen GUS ở các cấu trúc dựa trên pCAMBIA1301
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu lá Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu phấn hoa
35S-GUS 17 6 35,29% 50,00% 100%
LAT52-GUS 22 9 40,91% 23,22% 100%
LAT59-GUS 65 24 36,92% 4,17% (chưa kiểm tra) Màu xanh lam được tìm thấy ở lá, bao phấn và phấn hoa của cấu trúc đối chứng chứa promoter 35S, trong khi màu xanh không được tìm thấy ở đối chứng âm. Đối với các cấu trúc có chứa promoter LAT52 hoặc LAT59, phần lớn các mẫu lá sau khi nhuộm có màu trắng. Đặc biệt, ở cấu trúc chứa promoter LAT52, các mẫu không có màu xanh ở lá nhưng màu xanh lam được tìm thấy ở bao phấn và phấn hoa. Các kết quả được minh họa ở Hình 4.9.
35S-GUS LAT52-GUS LAT59-GUS Đối chứng âm
Mẫu lá
Bao
phấn *
Phấn
hoa *
* Do thời gian hạn chế nên các mẫu này chưa được đánh giá
Hình 4.9. Mẫu lá, bao phấn và hạt phấn của các dòng chuyển gen sau khi nhuộm X-gluc
4.2.4. Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome của hệ thống CRISPR/Cas9
Trong cấu trúc đối chứng, ở thế hệ đầu T0 hiệu quả chuyển gen đạt 100% và tỷ lệ đột biến là 13,33%. Tỷ lệ này tương đồng với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đó. Chẳng hạn như tỷ lệ đột biến tạo bởi hệ thống CRISPR/Cas9 trên cây ngô là 13,1% (Liang et al., 2014), trên một loại rêu Marchantia polymorpha L. là 11% (Sugano et al., 2014), trên Arabidopsis thaliana có tỷ lệ đột biến từ 2,5% lên tới 70% (Fauser et al., 2014) hay trên gạo là 2 – 16% (Xu et al., 2014).
Đối với cấu trúc chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9, hiệu quả chuyển gen là 21,57% (có 11 chồi nhận gen chuyển trên tổng số 51 chồi) và tỷ lệ đột biến là 72,73% (8 trong 11 chồi mang đột biến) trong thế hệ đầu T0. Kết quả này không như mong đợi vì theo giả thuyết, không tìm thấy đột biến ở thế hệ này. Tuy nhiên, số lượng mẫu trong thí nghiệm này còn ít nên độ tin cậy chưa cao, vì vậy cần tăng số lượng mẫu để có kết luận chính xác.
Cuối cùng là cấu trúc chứa hai promoter LAT52 và LAT59 điều khiển gRNA và Cas9, hiệu quả chuyển gen đạt 88,24% (30 trên tổng số 34 chồi nhận toàn bộ gen chuyển) và tỷ lệ đột biến trong thế hệ đầu T0 là 0% (Bảng 4.2), đạt kết quả như kỳ vọng.
Bảng 4.2. Hiệu quả chuyển gen và tỷ lệ đột biến của các cấu trúc dựa trên pKSE401 ADH2-4
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả mang đột biến Số lượng chồi Tỷ lệ đột biến pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA 35S-Cas9 60 60 100% 8 13,33% pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 51 11 21,57% 8 72,73% pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 34 30 88,24% 0 0%
trong khi Cas9 chịu sự điều khiển của promoter LAT52 thì gRNA vẫn hoạt động mạnh dưới sự điều khiển của promoter U6-26 tạo đột biến ở thế hệ đầu T0. Khi thay thế hoàn toàn bởi các promoter LAT52 và LAT59, không có đột biến xảy ra ở thế hệ đầu T0. Vì vậy, gRNA là nhân tố chỉnh ảnh hưởng đến tỷ lệ đột biến.
Trong cấu trúc đối chứng, đột biến được dự đoán bằng phương pháp PCR (Hình 4.10) và và sử dụng enzyme cắt giới hạn (Hình 4.11). Có 8 trên tổng số 60 mẫu được dự đoán mang đột biến sau khi gen ADH2-4 của các mẫu này được nhân lên để kiểm tra và cắt bởi enzyme BstNI.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Các mẫu cho kết quả đột biến ở gen ADH2-4 là mẫu số 15, 18, 25, 33, 35, 36, 37 và 59