Mẫu 1, 2: mô phân sinh thu được từ các cành khác nhau Mẫu 3, 4, 5: mẫu lá thu được từ các cành khác nhau P: mẫu đối chứng gen ADH2-4 từ cây cà chua bình thường
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn của các mẫu mô khác nhau
Hình ảnh điện di (Hình 4.15) cho thấy gen ADH2-4 không có sự đột biến khi được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BstNI từ các mẫu mô khác nhau của cây cà chua. Như vậy, cây cà chua thế hệ đầu T0 không chứa đột biến ở các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá). Những cây này được chuyển ra nhà lưới, tiếp tục quá trình sinh trưởng, phát triển, ra hoa và kết quả.
4.3. KIỂM TRA ĐỘT BIẾN Ở THẾ HỆ THỨ HAI T1
nảy mầm. Sau khoảng 15 ngày, cây con thế hệ thứ hai T1 được hình thành như hình 4.16. Sau đó, chúng tôi tiến hành đánh số, thu mẫu, và tách chiết DNA. Đột biến được dự đoán bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI cho gen mục tiêu ADH2-4 (Hình 4.17).
Hình 4.16. Các cây con thế hệ thứ hai T1
Mẫu số 1 – 48: Gen ADH2-4 của các cây con thế hệ thứ hai T1
P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.17. Dự đoán đột biến ở thế hệ thứ hai T1 bằng enzyme cắt giới hạn
Các mẫu có khả năng chứa đột biến được nhân lên, tinh chế từ bản gel và chuyển vào vector pGEM®-T Easy Vector System I (Promega). Dịch khuẩn được cấy trang trên môi trường thạch LB có bổ sung IPTG, X-gal và Ampicillin (phương pháp tách dòng gen – sàng lọc xanh – trắng). Sau đó, các đĩa thạch được ủ ở 370C qua đêm. Cuối cùng, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc có màu trắng, xác thực và sao chép, chuyển đến công ty giải trình tự.
Ở thế hệ này, chúng tôi tìm thấy 2 kiểu alen trên mỗi cây con như giả thuyết ban đầu bao gồm một alen bình thường và một alen đột biến. Cụ thể, cây số 4 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn, cây số 30 có một alen bình thường và một alen mất đoạn, cây số 35 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn. Một băng vạch khác các băng 128 bp và 42 bp xuất hiện ở các mẫu đột biến (gen
ADH2-4 bình thường có kích thước 170 bp sẽ được cắt thành hai mảnh là 128 bp và 42 bp bằng enzyme cắt giới hạn BstNI). Như vậy, hình ảnh điện di (Hình 4.17) cho thấy sự dự đoán đột biến phù hợp với kết quả giải trình tự thu được. Mỗi cây con được xác nhận nhiều lần nhằm chứng minh sự đáng tin cậy của kết quả. Vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BstNI (trình tự nhận biết CCAGG) bị phá vỡ ở cây số 4 và cây số 30 được thể hiện ở kết quả giải trình tự (Hình 4.18).
Hình 4.18. Các trình tự đột biến trên thế hệ thứ hai T1 của cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9
Cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9 cho kết quả đột biến trên gen ADH2-4 ở thế hệ sau T1 với kiểu đột biến dị hợp. Kết quả này chứng minh rằng hệ thống CRISPR/Cas9 chứa promoter đặc hiệu phấn hoa LAT52 có thể tạo ra đột biến trên phấn hoa cà chua.
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Tạo 4 vector và lần lượt chuyển các cấu trúc này vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien là promoter LAT52 – gen GUS, promoter LAT59 – gen GUS, hệ thống CRISPR/Cas9 chứa U6-gRNA LAT52- Cas9 và hệ thống CRISPR/Cas9 chứa LAT59-gRNA LAT52-Cas9.
- Promoter LAT52 hoạt động đặc hiệu trên phấn hoa cà chua.
- Hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng cấu trúc pKSE401 ADH2-4 đã tạo ra đột biến trên gen ADH2-4 ở các mẫu lá của cây cà chua (tỷ lệ đột biến là 13.33%).
- Cấu trúc chứa promoter LAT52 và LAT59 điều khiển Cas9 và gRNA không tạo ra đột biến ở mẫu lá cũng như mô phân sinh của cây cà chua ở thế hệ T0.
- Cấu trúc Cas9 dưới sự điều khiển của promoter LAT52 và gRNA dưới sự điều khiển của promoter U6 tạo ra đột biến ở phấn hoa, thể hiện ở thế hệ thứ hai T1 chứa nhân tố di truyền mang đột biến dị hợp tử.
5.2. KIẾN NGHỊ
Kết quả của nghiên cứu bước đầu cho thấy tiềm năng cải tiến hệ cây trồng thông qua sử dụng các tế bào đơn bào kết hợp với hệ thống CRISPR/Cas9
- Đánh giá hiệu quả tạo đột biến trên phấn hoa sử dụng cấu trúc chứa promoter LAT52 và LAT59.
- Ứng dụng phương pháp trực tiếp chuyển phức hợp gRNA-Cas9 vào hạt phấn tạo thế hệ mới mang cải tiến hiệu quả nhưng không phải là cây chuyển gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài Liệu Tiếng Anh
1. Aust, O., Stahl, W., Sies, H., Tronnier, H., and Heinrich, U. (2005). Supplementation with tomato-based products increases lycopene, phytofluene, and phytoene levels in human serum and protects against UV-light-induced erythema.
Int J Vitam Nutr Res75. pp. 54-60.
2. Bakker, and Winfridus (2006). Enhanced Hybrid Vigor Benefits Breeder and Broiler.
3. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., and Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science315. pp. 1709-12.
4. Bassett, A. R., and Liu, J. L. (2014). CRISPR/Cas9 and genome editing in Drosophila. J Genet Genomics41. pp. 7-19.
5. Brew-Appiah, R. A., Ankrah, N., Liu, W., Konzak, C. F., von Wettstein, D., and Rustgi, S. (2013). Generation of doubled haploid transgenic wheat lines by microspore transformation. PLoS One8, e80155.
6. Bugel, S. (2003). Vitamin K and bone health. Proc Nutr Soc62. pp. 839-43.
7. Caroline Bolton-Smith, Marion ET McMurdo, Colin R Paterson, Patricia A Mole, Julia M Harvey, Steven T Fenton, Celia J Prynne, Gita D Mishra, and Shearer, M. J. (2007). Two-Year Randomized Controlled Trial of Vitamin K1 (Phylloquinone) and Vitamin D3 Plus Calcium on the Bone Health of Older Women. JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH.
8. Carpenter, J. E. (2010). Peer-reviewed surveys indicate positive impact of commercialized GM crops. Nat Biotechnol28. pp. 319-21.
9. Chang, C., and Meyerowitz, E. M. (1986). Molecular cloning and DNA sequence of the Arabidopsis thaliana alcohol dehydrogenase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America83. pp. 1408-1412. 10. Char, S. N., Neelakandan, A. K., Nahampun, H., Frame, B., Main, M., Spalding,
M. H., Becraft, P. W., Meyers, B. C., Walbot, V., Wang, K., and Yang, B. (2017). An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize. Plant Biotechnol J15. pp. 257-268.
11. Chen, X., Lu, X., Shu, N., Wang, S., Wang, J., Wang, D., Guo, L., and Ye, W. (2017). Targeted mutagenesis in cotton (Gossypium hirsutum L.) using the CRISPR/Cas9 system. Sci Rep7, 44304.
12. Chung, H.-J., and Ferl, R. J. (1999). Arabidopsis Alcohol Dehydrogenase Expression in Both Shoots and Roots Is Conditioned by Root Growth Environment.
Plant Physiology121. pp. 429.
13. Cox, S. (2000). I Say Tomayto, You Say Tomahto...
14. Doudna, J. A., and Charpentier, E. (2014). Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science346, 1258096.
15. Endo, M., Nishizawa-Yokoi, A., and Toki, S. (2016). Targeted Mutagenesis in Rice Using TALENs and the CRISPR/Cas9 System. Methods Mol Biol1469. pp. 123-35. 16. Fauser, F., Schiml, S., and Puchta, H. (2014). Both CRISPR/Cas-based nucleases
and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. Plant J79. pp. 348-59.
17. Foolad, M. R. (2007). Genome mapping and molecular breeding of tomato. Int J Plant Genomics2007, 64358.
18. Froger, A., and Hall, J. E. (2007). Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. pp. 253.
19. Giovannucci, E. (1999). Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature. J Natl Cancer Inst91. pp. 317-31.
20. Giovannucci, E. (2002). A review of epidemiologic studies of tomatoes, lycopene, and prostate cancer. Exp Biol Med (Maywood)227. pp. 852-9.
21. Hamilton, C. M. (1997). A binary-BAC system for plant transformation with high- molecular-weight DNA. Gene200. pp. 107-16.
22. Hanson, D. D., Hamilton, D. A., Travis, J. L., Bashe, D. M., and Mascarenhas, J. P. (1989). Characterization of a pollen-specific cDNA clone from Zea mays and its expression. The Plant Cell1. pp. 173-179.
23. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol
169. pp. 5429-33.
24. Kaplinsky, N., Braun, D., Lisch, D., Hay, A., Hake, S., and Freeling, M. (2002). Biodiversity (Communications arising): maize transgene results in Mexico are artefacts. Nature416, 601-2; discussion 600, 602.
25. Key, S., Ma, J. K., and Drake, P. M. (2008). Genetically modified plants and human health. J R Soc Med101, 290-8.
26. Khang, D. (2018). Potential application and current achievements of CRISPR/Cas in rice.
27. Leclercq, J., Szabolcs, T., Martin, F., and Montoro, P. (2015). Development of a new pCAMBIA binary vector using Gateway(R) technology. Plasmid81. pp. 50-4. 28. Lee, Z. H., Yamaguchi, N., and Ito, T. (2018). Using CRISPR/Cas9 System to
Introduce Targeted Mutation in Arabidopsis. Methods Mol Biol1830. pp. 93-108. 29. Liang, Z., Zhang, K., Chen, K., and Gao, C. (2014). Targeted mutagenesis in Zea
mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. J Genet Genomics41. pp. 63-8. 30. Liu, X., Wu, S., Xu, J., Sui, C., and Wei, J. (2017). Application of CRISPR/Cas9 in
plant biology. Acta Pharm Sin B7. pp. 292-302.
31. Lodish H, Berk A, and SL, Z. (2000). Mutations: Types and Causes.
32. Losey, J. E., Rayor, L. S., and Carter, M. E. (1999). Transgenic pollen harms monarch larvae. Nature399, 214.
33. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Haft, D. H., Horvath, P., Moineau, S., Mojica, F. J., Terns, R. M., Terns, M. P., White, M. F., Yakunin, A. F., Garrett, R. A., van der Oost, J., Backofen, R., and Koonin, E. V. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol13. pp. 722-36.
34. Mikami, M., Toki, S., and Endo, M. (2015). Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice. Plant Mol Biol88. pp. 561-72.
35. Palomo, I., Fuentes, E., Padro, T., and Badimon, L. (2012). Platelets and atherogenesis: Platelet anti-aggregation activity and endothelial protection from tomatoes (Solanum lycopersicum L.). Exp Ther Med3. pp. 577-584.
36. Pankaj Bhowmik 1, E. E., Brittany Polley1, Venkatesh Bollina1, Manoj Kulkarni1, Kaveh Ghanbarnia1, Halim Song1, Caixia Gao 3, Daniel F. Voytas2 & Sateesh Kagale 1 (2018). Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.
Scientific Reports.
37. Paul, J. W., 3rd, and Qi, Y. (2016). CRISPR/Cas9 for plant genome editing: accomplishments, problems and prospects. Plant Cell Rep35. pp. 1417-27.
38. Potrykus, I. (2001). Golden Rice and Beyond. Plant Physiology 125. pp. 1157- 1161.
39. Richter, C., Chang, J. T., and Fineran, P. C. (2012). Function and Regulation of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / CRISPR Associated (Cas) Systems. Viruses4. pp. 2291-2311.
40. Roddick, J. G., and Melchers, G. (1985). Steroidal glycoalkaloid content of potato, tomato and their somatic hybrids. Theor Appl Genet70. pp. 655-60.
41. Sato, R., Helzlsouer, K. J., Alberg, A. J., Hoffman, S. C., Norkus, E. P., and Comstock, G. W. (2002). Prospective study of carotenoids, tocopherols, and retinoid concentrations and the risk of breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev11. pp. 451-7.
42. Sato, S., Kamiyama, M., Iwata, T., Makita, N., Furukawa, H., and Ikeda, H. (2006). Moderate increase of mean daily temperature adversely affects fruit set of Lycopersicon esculentum by disrupting specific physiological processes in male reproductive development. Ann Bot97. pp. 731-8.
43. Shi, J., Gao, H., Wang, H., Lafitte, H. R., Archibald, R. L., Yang, M., Hakimi, S. M., Mo, H., and Habben, J. E. (2017). ARGOS8 variants generated by CRISPR- Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions. Plant Biotechnol J15. pp. 207-216.
44. Spier, R. E. (1998). Animal and plant cell technology: a critical evaluation of the technology/society interface. J Biotechnol65. pp. 111-25.
45. Stahl, W., Heinrich, U., Aust, O., Tronnier, H., and Sies, H. (2006). Lycopene-rich products and dietary photoprotection. Photochem Photobiol Sci5. pp. 238-42. 46. Sugano, S. S., Shirakawa, M., Takagi, J., Matsuda, Y., Shimada, T., Hara-
Nishimura, I., and Kohchi, T. (2014). CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in the liverwort Marchantia polymorpha L. Plant Cell Physiol55. pp. 475-81. 47. Tanaka, A., Shikazono, N., and Hase, Y. (2010). Studies on biological effects of
ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. J Radiat Res51. pp. 223-33.
48. Tanksley, S. D. (1979). Linkage, chromosomal association, and expression of Adh- 1 and Pgm-2 in tomato. Biochem Genet17. pp. 1159-67.
49. Thompson, C. E., Fernandes, C. L., de Souza, O. N., de Freitas, L. B., and Salzano, F. M. (2010). Evaluation of the impact of functional diversification on Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, and Pinaceae alcohol dehydrogenase enzymes. J Mol Model16. pp. 919-28.
50. Tieman, D., Zhu, G., Resende, M. F., Jr., Lin, T., Nguyen, C., Bies, D., Rambla, J. L., Beltran, K. S., Taylor, M., Zhang, B., Ikeda, H., Liu, Z., Fisher, J., Zemach, I., Monforte, A., Zamir, D., Granell, A., Kirst, M., Huang, S., and Klee, H. (2017). A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science355. pp. 391-394. 51. Tony Buhr, S. S., Farida Ebrahim, Aiqiu Xing, You Zhou, Michelle Mathiesen,
Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean.
52. Twell, D., Yamaguchi, J., and McCormick, S. (1990). Pollen-specific gene expression in transgenic plants: coordinate regulation of two different tomato gene promoters during microsporogenesis. Development109. pp. 705-13.
53. Waltz, E. (2016). Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature
532, 293.
54. Wang, F., Wang, C., Liu, P., Lei, C., Hao, W., Gao, Y., Liu, Y. G., and Zhao, K. (2016). Enhanced Rice Blast Resistance by CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the ERF Transcription Factor Gene OsERF922. PLoS One11, e0154027.
55. Wang, S., Zhang, S., Wang, W., Xiong, X., Meng, F., and Cui, X. (2015). Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system. Plant Cell Rep 34, 1473-6.
56. Wei, M. Y., and Giovannucci, E. L. (2012). Lycopene, Tomato Products, and Prostate Cancer Incidence: A Review and Reassessment in the PSA Screening Era.
J Oncol2012, 271063.
57. Weigel, D., and Glazebrook, J. (2006). Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc2006.
58. Wing, R. A., Yamaguchi, J., Larabell, S. K., Ursin, V. M., and McCormick, S. (1990). Molecular and genetic characterization of two pollen-expressed genes that have sequence similarity to pectate lyases of the plant pathogen Erwinia. Plant Mol Biol14. pp. 17-28.
59. Woo, J. W., Kim, J., Kwon, S. I., Corvalán, C., Cho, S. W., Kim, H., Kim, S.-G., Kim, S.-T., Choe, S., and Kim, J.-S. (2015). DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology33. pp. 1162.
60. Xing, H. L., Dong, L., Wang, Z. P., Zhang, H. Y., Han, C. Y., Liu, B., Wang, X. C., and Chen, Q. J. (2014). A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol14, 327.
61. Xu, R., Li, H., Qin, R., Wang, L., Li, L., Wei, P., and Yang, J. (2014). Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice. Rice7, 5-5.
62. Yu, Q. H., Wang, B., Li, N., Tang, Y., Yang, S., Yang, T., Xu, J., Guo, C., Yan, P., Wang, Q., and Asmutola, P. (2017). CRISPR/Cas9-induced Targeted Mutagenesis and Gene Replacement to Generate Long-shelf Life Tomato Lines. Sci Rep 7, 11874.
B. Trang web điện tử
63. http://www.addgene.org/
64. https://plants.sc.egov.usda.gov/java/ 65. https://solgenomics.net/