Chuyển các vector tái tổ hợp lần lượt vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 25 mg/l Kanamycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để kiểm tra sự có mặt vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 bên trong vi khuẩn E. coli,
chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi insert2-F2/insert2-R.
Mẫu số 1 – 12: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn một cách ngẫu nhiên P: mẫu đối chứng
Hình 4.4. Ảnh điện di khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pKSE401 ADH2-4 U6- gRNA LAT52-Cas9 và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9
Đối với vector pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9, có 11 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch 325 bp (một phần gRNA và promoter LAT52). Đối với vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9, chỉ có 3 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch này. Kết quả đã chứng minh cả hai vector đã được biến nạp vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.4).
4.2. CHUYỂN CÁC CẤU TRÚC VÀO CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (GV3101::PMP90) KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (GV3101::PMP90)
4.2.1. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector tái tổ hợp
Các vector tái tổ hợp lần lượt được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng sốc nhiệt dựa trên phương pháp của Weigel và Glazebrook với một số cải biến (Weigel and Glazebrook, 2006). Dịch khuẩn được cấy trang trên môi trường đĩa thạch YEP có bổ sung 50 µg/ml Kanamycine và 50 µg/ml Gentamycine. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C, các khuẩn lạc tốt, trắng trong, nhầy lồi, biên khuẩn lạc đều, tròn được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường YEP lỏng.
Hình 4.5. Cấy trang vi khuẩn A. tumefaciens
4.2.2. Chuyển các cấu trúc vào cây cà chua
Vi khuẩn A. tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn này là tác nhân gây khối u trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Ti-plasmid) của nó vào tế bào thực vật. Ti-DNA sau đó được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen. Lợi dụng cơ chế này, từ những năm 1980, chúng được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật (Hamilton, 1997).
Sau khi hoàn thành việc chuyển các cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi tiến hành lây nhiễm với cây cà chua. Giống cà chua CLN1621 được cung cấp bởi Trung tâm Rau Thế giới có đặc tính sinh trưởng phát triển tốt được sử dụng trong nghiên cứu này.
Các dòng vi khuẩn mang 6 cấu trúc khác nhau (cấu trúc gen GUS đối chứng, cấu trúc gen GUS với promoter LAT52, cấu trúc gen GUS với promoter LAT59; cấu trúc CRISPR/Cas9 đối chứng, cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter đặc hiệu phấn hoa và cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa hai promoter đặc hiệu ở phấn hoa) được tiến hành thí nghiệm một cách độc lập. Mẫu lá mầm là vật liệu nhận gen chuyển thu được sau 7 đến 10 ngày gieo hạt ở 240C với 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày. Các mẫu lá mầm này được đặt trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 0,5 mg/L IAA trong 2 ngày (Hình 4.6). Vi khuẩn A. tumefaciens
mang cấu trúc cần chuyển được nuôi cấy ít nhất 30 giờ trước khi lây nhiễm trong môi trường YEP lỏng có bổ sung 100 mg/L Kanamycine, 50 mg/L Gentamycine.