Phần 4 : Kết quả và thảo luận
4.1. Xây dựng các vector tái tổ hợp và nhân dòng
4.1.1. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pCAMBIA1301
Chuyển gen thực vật là một kĩ thuật được tiến hành ở hàng trăm phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, đặc biệt là việc sử dụng vật mang trung gian như vi khuẩn. Tuy nhiên, một số vật mang trung gian biến các cấu trúc trở nên phức tạp và cồng kềnh, dẫn đến hiệu quả sao chép thấp, kích thước lớn, hạn chế thao tác sử dụng các vị trí enzyme cắt giới hạn.
Vector pCAMBIA có nguồn gốc từ vector pPZP mang nhiều lợi ích hơn hẳn so với các vector truyền thống. Số lượng bản sao trong E. coli lớn, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong A. tumefaciens, kích thước chỉ từ 7 – 12 kb, các vị trí enzyme cắt giới hạn được thiết kế cho vector này với những sửa đổi đáng kể, các liên kết poly tuy nhỏ nhưng đầy đủ nhằm tạo ra DNA mục tiêu, với gen kháng kháng sinh cho thực vật là Hygromycine hoặc Kanamycine. Hiện nay, hệ thống các vector pCAMBIA trở nên phổ biến bởi sự vận hành dễ dàng, ổn định và sự tồn tại của một loạt các gen chọn lọc cùng các gen chỉ thị khác nhau (Leclercq et al., 2015).
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS
Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS
Hình 4.1. Sơ đồ các cấu trúc gen GUS được điều khiển bởi các promoter LAT52 và LAT59
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 với gen chỉ thị là gen GUS và gen chọn lọc là Hygromycine. Chúng tôi thay thế promoter 35S lần lượt bởi các promoter LAT52 và LAT59. Phương pháp được lựa chọn nhằm tạo ra hai vector mới là sử dụng enzyme cắt giới hạn HindIII và NCoI tạo đầu cắt so le, thuận tiện cho phản ứng nối bởi enzyme T4. Mục đích của hai vector là biểu hiện gen chỉ thị gen GUS, từ đó đánh giá mức độ hoạt động của hai promoter này.
Chuyển vector thu được vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 20 mg/l Hygromycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để khẳng định chắc chắn sự có mặt vector tái tổ hợp promoter – gen GUS bên trong vi khuẩn E.
coli, chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường chọn lọc và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GUS-F/GUS-R.
Mẫu số 1 – 8: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên P1, P2: mẫu đối chứng chứa DNA mẫu là plasmid pCAMBIA1301
Hình 4.2. Ảnh điện di sản phẩm colony-PCR của các khuẩn lạc
Trong số tám mẫu khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn ngẫu nhiên của vector pCAMBIA1301 LAT52-GUS, ngoại trừ mẫu số 1, bảy mẫu còn lại xuất hiện băng vạch 898 bp (gen GUS) chứng tỏ sự có mặt của vector tái tổ hợp này trong vi khuẩn E. coli. Tương tự, ở vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS, tất cả tám mẫu khuẩn lạc xuất hiện băng vạch thể hiện sự có mặt của gen GUS (898 bp). Điều này chứng minh vector pCAMBIA1301 LAT59-GUS đã được biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.2).
4.1.2. Tạo các vector tái tổ hợp dựa trên cấu trúc pKSE401 ADH2-4
Vector pKSE401 được thiết kế bởi Qi-Jun Chen và cộng sự vào năm 2014 dựa trên khung của vector pCAMBIA (Xing et al., 2014). Nhằm tăng cường ứng
dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trên các loại thực vật khác nhau, pKSE401 được hình thành với hai hệ thống biểu hiện đặc hiệu gồm promoter U6-26 điều kiển gRNA và CaMV 35S điều khiển Cas9.
Sợi oligo kép gRNA được thiết kế lại và thay thế cho gRNA ban đầu trong vector pKSE401. Cuối cùng, vector pKSE401 ADH2-4 được hình thành tại Trung tâm Rau Thế giới với mục tiêu tạo đột biến ở gen ADH2-4 của cà chua.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pKSE401 ADH2-4 thay thế lần lượt các promoter U6-26 và 35S điều kiển gRNA và Cas9 bằng các promoter LAT52 và LAT59. Cuối cùng, hai vector được hình thành là vector pKSE401 ADH2-4 LAT52-Cas9 với promoter LAT52 thay thế cho 35S và vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 chứa hai promoter LAT52 và LAT59.
Hình 4.3. Sơ đồ các cấu trúc CRISPR/Cas9 được tạo thành
Chuyển các vector tái tổ hợp lần lượt vào vi khuẩn E. coli DH5α (Froger and Hall, 2007) và chọn lọc trên môi trường kháng sinh 25 mg/l Kanamycine. Sau một ngày đêm nuôi cấy ở 370C, trên các đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc. Để kiểm tra sự có mặt vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 bên trong vi khuẩn E. coli,
chúng tôi chọn một vài bản sao bất kỳ trong đĩa môi trường và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi insert2-F2/insert2-R.
Mẫu số 1 – 12: các khuẩn lạc khác nhau được lựa chọn một cách ngẫu nhiên P: mẫu đối chứng
Hình 4.4. Ảnh điện di khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pKSE401 ADH2-4 U6- gRNA LAT52-Cas9 và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9
Đối với vector pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9, có 11 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch 325 bp (một phần gRNA và promoter LAT52). Đối với vector pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9, chỉ có 3 trên tổng số 12 mẫu khuẩn lạc chứa băng vạch này. Kết quả đã chứng minh cả hai vector đã được biến nạp vào vi khuẩn E. coli (Hình 4.4).