Phần 4 : Kết quả và thảo luận
4.2. Chuyển các cấu trúc vào cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium
4.2.2. Chuyển các cấu trúc vào cây cà chua
Vi khuẩn A. tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn này là tác nhân gây khối u trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Ti-plasmid) của nó vào tế bào thực vật. Ti-DNA sau đó được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen. Lợi dụng cơ chế này, từ những năm 1980, chúng được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật (Hamilton, 1997).
Sau khi hoàn thành việc chuyển các cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi tiến hành lây nhiễm với cây cà chua. Giống cà chua CLN1621 được cung cấp bởi Trung tâm Rau Thế giới có đặc tính sinh trưởng phát triển tốt được sử dụng trong nghiên cứu này.
Các dòng vi khuẩn mang 6 cấu trúc khác nhau (cấu trúc gen GUS đối chứng, cấu trúc gen GUS với promoter LAT52, cấu trúc gen GUS với promoter LAT59; cấu trúc CRISPR/Cas9 đối chứng, cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter đặc hiệu phấn hoa và cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa hai promoter đặc hiệu ở phấn hoa) được tiến hành thí nghiệm một cách độc lập. Mẫu lá mầm là vật liệu nhận gen chuyển thu được sau 7 đến 10 ngày gieo hạt ở 240C với 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày. Các mẫu lá mầm này được đặt trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 0,5 mg/L IAA trong 2 ngày (Hình 4.6). Vi khuẩn A. tumefaciens
mang cấu trúc cần chuyển được nuôi cấy ít nhất 30 giờ trước khi lây nhiễm trong môi trường YEP lỏng có bổ sung 100 mg/L Kanamycine, 50 mg/L Gentamycine.
Hình 4.6 Mẫu lá mầm trên môi trường dinh dưỡng
Quá trình đồng nuôi cấy được tiến hành trong môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Hygromycine (các cấu trúc của gen GUS) hoặc Kanamycine (các cấu trúc CRISPR/Cas9). Sau 2 ngày, các mẫu lá mầm được chuyển sang nuôi cấy tạo callus, chồi được hình thành trên môi trường kéo dài có bổ sung 0,25 mg/L GA3 (Hình 4.7).
Hình 4.7 Nuôi cấy tạo chồi trên môi trường có bổ sung 0,25 mg/L GA3
Dựa trên thực nghiệm với tổng số 16 lần tái sinh và biến nạp độc lập cho 6 cấu trúc khác nhau, trải qua quá trình chọn lọc liên tục, phần lớn các mẫu lá hóa đen hoặc chết trong môi trường chọn lọc. Những mẫu sống sót sau các quá trình này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Hình 4.8).
Hình 4.8 Chồi tái sinh có sức sống cao 4.2.3 Đánh giá hoạt động của các promoter LAT52 và LAT59 4.2.3 Đánh giá hoạt động của các promoter LAT52 và LAT59
Ở các cấu trúc được xây dựng dựa trên vector pCAMBIA1301, hiệu quả chuyển gen khoảng từ 35% đến 41% được thể hiện ở Bảng 4.1. Cụ thể, ở cấu trúc đối chứng 35S-GUS là 35,29%, ở cấu trúc LAT52-GUS là 40,91% và ở cấu trúc LAT59-GUS là 36,92%. Kết quả này cho thấy sự đồng đều trong quá trình chuyển gen của từng cấu trúc cũng như các thao tác thực hiện từ nhân dòng, chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens cho đến chuyển gen vào cây cà chua tương đối ổn định.
Đối với kết quả nhuộm gen GUS, ở mẫu đối chứng chứa promoter 35S, chúng tôi đã tìm được 3 mẫu lá xuất hiện màu xanh lam đặc trưng. Hơn nữa, 100% những cây đó cho kết quả nhuộm xanh lam ở hạt phấn. Kết quả chỉ ra rằng promoter 35S hoạt động ở cả cơ quan sinh dưỡng (lá) và hạt phấn của cây cà chua.
Đối với các cấu trúc kiểm tra hoạt động của promoter LAT52 và LAT59, lần lượt 77,78% và 95,83% (Bảng 4.1) không phát hiện màu xanh lam ở lá. Mặt khác, đối với các cây chứa promoter LAT52, màu xanh lam đặc trưng được tìm thấy ở 100% các hạt phấn. Như vậy, promoter LAT52 không hoạt động ở cơ quan sinh dưỡng, chỉ hoạt động ở phấn hoa cà chua.
Do thời gian hạn chế, chúng tôi chưa thể thu hoạch và đánh giá hạt phấn từ những cây chứa promoter LAT59.
Bảng 4.1. Hiệu quả chuyển gen và biểu hiện của gen GUS ở các cấu trúc dựa trên pCAMBIA1301
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu lá Tỷ lệ biểu hiện gen GUS ở mẫu phấn hoa
35S-GUS 17 6 35,29% 50,00% 100%
LAT52-GUS 22 9 40,91% 23,22% 100%
LAT59-GUS 65 24 36,92% 4,17% (chưa kiểm tra) Màu xanh lam được tìm thấy ở lá, bao phấn và phấn hoa của cấu trúc đối chứng chứa promoter 35S, trong khi màu xanh không được tìm thấy ở đối chứng âm. Đối với các cấu trúc có chứa promoter LAT52 hoặc LAT59, phần lớn các mẫu lá sau khi nhuộm có màu trắng. Đặc biệt, ở cấu trúc chứa promoter LAT52, các mẫu không có màu xanh ở lá nhưng màu xanh lam được tìm thấy ở bao phấn và phấn hoa. Các kết quả được minh họa ở Hình 4.9.
35S-GUS LAT52-GUS LAT59-GUS Đối chứng âm
Mẫu lá
Bao
phấn *
Phấn
hoa *
* Do thời gian hạn chế nên các mẫu này chưa được đánh giá
Hình 4.9. Mẫu lá, bao phấn và hạt phấn của các dòng chuyển gen sau khi nhuộm X-gluc
4.2.4. Đánh giá hoạt động chỉnh sửa genome của hệ thống CRISPR/Cas9
Trong cấu trúc đối chứng, ở thế hệ đầu T0 hiệu quả chuyển gen đạt 100% và tỷ lệ đột biến là 13,33%. Tỷ lệ này tương đồng với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đó. Chẳng hạn như tỷ lệ đột biến tạo bởi hệ thống CRISPR/Cas9 trên cây ngô là 13,1% (Liang et al., 2014), trên một loại rêu Marchantia polymorpha L. là 11% (Sugano et al., 2014), trên Arabidopsis thaliana có tỷ lệ đột biến từ 2,5% lên tới 70% (Fauser et al., 2014) hay trên gạo là 2 – 16% (Xu et al., 2014).
Đối với cấu trúc chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9, hiệu quả chuyển gen là 21,57% (có 11 chồi nhận gen chuyển trên tổng số 51 chồi) và tỷ lệ đột biến là 72,73% (8 trong 11 chồi mang đột biến) trong thế hệ đầu T0. Kết quả này không như mong đợi vì theo giả thuyết, không tìm thấy đột biến ở thế hệ này. Tuy nhiên, số lượng mẫu trong thí nghiệm này còn ít nên độ tin cậy chưa cao, vì vậy cần tăng số lượng mẫu để có kết luận chính xác.
Cuối cùng là cấu trúc chứa hai promoter LAT52 và LAT59 điều khiển gRNA và Cas9, hiệu quả chuyển gen đạt 88,24% (30 trên tổng số 34 chồi nhận toàn bộ gen chuyển) và tỷ lệ đột biến trong thế hệ đầu T0 là 0% (Bảng 4.2), đạt kết quả như kỳ vọng.
Bảng 4.2. Hiệu quả chuyển gen và tỷ lệ đột biến của các cấu trúc dựa trên pKSE401 ADH2-4
Cấu trúc Số lượng chồi nhận gen chuyển Số lượng chồi chuyển gen Hiệu quả mang đột biến Số lượng chồi Tỷ lệ đột biến pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA 35S-Cas9 60 60 100% 8 13,33% pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 51 11 21,57% 8 72,73% pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 34 30 88,24% 0 0%
trong khi Cas9 chịu sự điều khiển của promoter LAT52 thì gRNA vẫn hoạt động mạnh dưới sự điều khiển của promoter U6-26 tạo đột biến ở thế hệ đầu T0. Khi thay thế hoàn toàn bởi các promoter LAT52 và LAT59, không có đột biến xảy ra ở thế hệ đầu T0. Vì vậy, gRNA là nhân tố chỉnh ảnh hưởng đến tỷ lệ đột biến.
Trong cấu trúc đối chứng, đột biến được dự đoán bằng phương pháp PCR (Hình 4.10) và và sử dụng enzyme cắt giới hạn (Hình 4.11). Có 8 trên tổng số 60 mẫu được dự đoán mang đột biến sau khi gen ADH2-4 của các mẫu này được nhân lên để kiểm tra và cắt bởi enzyme BstNI.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Các mẫu cho kết quả đột biến ở gen ADH2-4 là mẫu số 15, 18, 25, 33, 35, 36, 37 và 59
Hình 4.10. Dự đoán đột biến bằng phương pháp PCR
Các mẫu đột biến được tìm thấy sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn hoàn toàn trùng khớp với các mẫu được dự đoán bằng phương pháp PCR.
Mẫu số 1 – 60: Gen ADH2-4 của các cây chứa cấu trúc pKSE401 ADH2-4 P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.11. Dự đoán đột biến bằng enzyme cắt giới hạn BstNI
Kết quả cuối cùng được kiểm chứng thông qua giải trình tự. Các dạng đột biến phổ biến nhất được phát hiện là đột biến mất đoạn. Ngoài ra, đột biến thêm đoạn cũng được tìm thấy (Hình 4.12). Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng tạo đột biến ở cấu trúc đối chứng. Tuy nhiên, đây là kiểu đột biến hoàn toàn ngẫu nhiên, không thể có sự lặp lại một cách chính xác.
Hình 4.12. Trình tự gen ADH2-4 của cấu trúc đối chứng pKSE401 ADH2-4
Trong hai cấu trúc có chứa promoter LAT52 và LAT59, chúng tôi quan tâm những cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0, vì vậy chúng tôi sử dụng giải trình tự để xác nhận.
Hình 4.13. Trình tự gen ADH2-4 ở cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9 (a) và pKSE401 ADH2-4 LAT59-gRNA LAT52-Cas9 (b)
Các cây không chứa đột biến ở thế hệ đầu T0 của cấu trúc pKSE401 ADH2- 4 U6-gRNA LAT52-Cas9 được thẩm tra bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI để đảm bảo chúng không phải là cây chimeric. Bởi vì sau khi tiến hành nuôi cấy mô, một chồi có thể nhận nhiều quần thể tế bào khác nhau trong quá trình hình thành callus và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
a
Hình 4.14. Minh họa các bộ phận khác nhau của cây cà chua được thẩm tra
Mẫu 1, 2: mô phân sinh thu được từ các cành khác nhau Mẫu 3, 4, 5: mẫu lá thu được từ các cành khác nhau P: mẫu đối chứng gen ADH2-4 từ cây cà chua bình thường
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn của các mẫu mô khác nhau
Hình ảnh điện di (Hình 4.15) cho thấy gen ADH2-4 không có sự đột biến khi được nhân lên bằng phương pháp PCR và được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BstNI từ các mẫu mô khác nhau của cây cà chua. Như vậy, cây cà chua thế hệ đầu T0 không chứa đột biến ở các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá). Những cây này được chuyển ra nhà lưới, tiếp tục quá trình sinh trưởng, phát triển, ra hoa và kết quả.
4.3. KIỂM TRA ĐỘT BIẾN Ở THẾ HỆ THỨ HAI T1
nảy mầm. Sau khoảng 15 ngày, cây con thế hệ thứ hai T1 được hình thành như hình 4.16. Sau đó, chúng tôi tiến hành đánh số, thu mẫu, và tách chiết DNA. Đột biến được dự đoán bằng kỹ thuật PCR và sử dụng enzyme cắt giới hạn BstNI cho gen mục tiêu ADH2-4 (Hình 4.17).
Hình 4.16. Các cây con thế hệ thứ hai T1
Mẫu số 1 – 48: Gen ADH2-4 của các cây con thế hệ thứ hai T1
P: mẫu đối chứng (gen ADH2-4 của cây cà chua bình thường)
Hình 4.17. Dự đoán đột biến ở thế hệ thứ hai T1 bằng enzyme cắt giới hạn
Các mẫu có khả năng chứa đột biến được nhân lên, tinh chế từ bản gel và chuyển vào vector pGEM®-T Easy Vector System I (Promega). Dịch khuẩn được cấy trang trên môi trường thạch LB có bổ sung IPTG, X-gal và Ampicillin (phương pháp tách dòng gen – sàng lọc xanh – trắng). Sau đó, các đĩa thạch được ủ ở 370C qua đêm. Cuối cùng, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc có màu trắng, xác thực và sao chép, chuyển đến công ty giải trình tự.
Ở thế hệ này, chúng tôi tìm thấy 2 kiểu alen trên mỗi cây con như giả thuyết ban đầu bao gồm một alen bình thường và một alen đột biến. Cụ thể, cây số 4 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn, cây số 30 có một alen bình thường và một alen mất đoạn, cây số 35 có một alen bình thường và một alen thêm đoạn. Một băng vạch khác các băng 128 bp và 42 bp xuất hiện ở các mẫu đột biến (gen
ADH2-4 bình thường có kích thước 170 bp sẽ được cắt thành hai mảnh là 128 bp và 42 bp bằng enzyme cắt giới hạn BstNI). Như vậy, hình ảnh điện di (Hình 4.17) cho thấy sự dự đoán đột biến phù hợp với kết quả giải trình tự thu được. Mỗi cây con được xác nhận nhiều lần nhằm chứng minh sự đáng tin cậy của kết quả. Vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BstNI (trình tự nhận biết CCAGG) bị phá vỡ ở cây số 4 và cây số 30 được thể hiện ở kết quả giải trình tự (Hình 4.18).
Hình 4.18. Các trình tự đột biến trên thế hệ thứ hai T1 của cấu trúc pKSE401 ADH2-4 U6-gRNA LAT52-Cas9
Cấu trúc CRISPR/Cas9 chứa một promoter LAT52 điều kiển Cas9 cho kết quả đột biến trên gen ADH2-4 ở thế hệ sau T1 với kiểu đột biến dị hợp. Kết quả này chứng minh rằng hệ thống CRISPR/Cas9 chứa promoter đặc hiệu phấn hoa LAT52 có thể tạo ra đột biến trên phấn hoa cà chua.
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Tạo 4 vector và lần lượt chuyển các cấu trúc này vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien là promoter LAT52 – gen GUS, promoter LAT59 – gen GUS, hệ thống CRISPR/Cas9 chứa U6-gRNA LAT52- Cas9 và hệ thống CRISPR/Cas9 chứa LAT59-gRNA LAT52-Cas9.
- Promoter LAT52 hoạt động đặc hiệu trên phấn hoa cà chua.
- Hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng cấu trúc pKSE401 ADH2-4 đã tạo ra đột biến trên gen ADH2-4 ở các mẫu lá của cây cà chua (tỷ lệ đột biến là 13.33%).
- Cấu trúc chứa promoter LAT52 và LAT59 điều khiển Cas9 và gRNA không tạo ra đột biến ở mẫu lá cũng như mô phân sinh của cây cà chua ở thế hệ T0.
- Cấu trúc Cas9 dưới sự điều khiển của promoter LAT52 và gRNA dưới sự điều khiển của promoter U6 tạo ra đột biến ở phấn hoa, thể hiện ở thế hệ thứ hai T1 chứa nhân tố di truyền mang đột biến dị hợp tử.
5.2. KIẾN NGHỊ
Kết quả của nghiên cứu bước đầu cho thấy tiềm năng cải tiến hệ cây trồng thông qua sử dụng các tế bào đơn bào kết hợp với hệ thống CRISPR/Cas9
- Đánh giá hiệu quả tạo đột biến trên phấn hoa sử dụng cấu trúc chứa promoter LAT52 và LAT59.
- Ứng dụng phương pháp trực tiếp chuyển phức hợp gRNA-Cas9 vào hạt phấn tạo thế hệ mới mang cải tiến hiệu quả nhưng không phải là cây chuyển gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài Liệu Tiếng Anh
1. Aust, O., Stahl, W., Sies, H., Tronnier, H., and Heinrich, U. (2005). Supplementation with tomato-based products increases lycopene, phytofluene, and phytoene levels in human serum and protects against UV-light-induced erythema.
Int J Vitam Nutr Res75. pp. 54-60.
2. Bakker, and Winfridus (2006). Enhanced Hybrid Vigor Benefits Breeder and Broiler.
3. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., and Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science315. pp. 1709-12.
4. Bassett, A. R., and Liu, J. L. (2014). CRISPR/Cas9 and genome editing in Drosophila. J Genet Genomics41. pp. 7-19.
5. Brew-Appiah, R. A., Ankrah, N., Liu, W., Konzak, C. F., von Wettstein, D., and Rustgi, S. (2013). Generation of doubled haploid transgenic wheat lines by microspore transformation. PLoS One8, e80155.
6. Bugel, S. (2003). Vitamin K and bone health. Proc Nutr Soc62. pp. 839-43.
7. Caroline Bolton-Smith, Marion ET McMurdo, Colin R Paterson, Patricia A Mole, Julia M Harvey, Steven T Fenton, Celia J Prynne, Gita D Mishra, and Shearer, M. J. (2007). Two-Year Randomized Controlled Trial of Vitamin K1 (Phylloquinone) and Vitamin D3 Plus Calcium on the Bone Health of Older Women. JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH.
8. Carpenter, J. E. (2010). Peer-reviewed surveys indicate positive impact of commercialized GM crops. Nat Biotechnol28. pp. 319-21.
9. Chang, C., and Meyerowitz, E. M. (1986). Molecular cloning and DNA sequence of the Arabidopsis thaliana alcohol dehydrogenase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America83. pp. 1408-1412. 10. Char, S. N., Neelakandan, A. K., Nahampun, H., Frame, B., Main, M., Spalding,
M. H., Becraft, P. W., Meyers, B. C., Walbot, V., Wang, K., and Yang, B. (2017). An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize. Plant Biotechnol J15. pp. 257-268.
11. Chen, X., Lu, X., Shu, N., Wang, S., Wang, J., Wang, D., Guo, L., and Ye, W. (2017). Targeted mutagenesis in cotton (Gossypium hirsutum L.) using the CRISPR/Cas9 system. Sci Rep7, 44304.
12. Chung, H.-J., and Ferl, R. J. (1999). Arabidopsis Alcohol Dehydrogenase Expression in Both Shoots and Roots Is Conditioned by Root Growth Environment.