Nghiên cứu điều kiện chế tạo và bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở trâu, bò.

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM V TH CHIấN Tờn ti: Nghiên cứu điều kiện chế tạo bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò KhóA LUậN TốT NGHIệP §¹I HäC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Chăn nuôi Thú y Lớp : K42 - CNTY Khoa : Chăn ni Thú y Khố học : 2010-2014 Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Minh Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập trường sau tháng thực tập tốt nghiệp sở đến em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Qua đây, em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y thầy, giáo khoa tận tình dìu dắt, giúp đỡ em suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan, TS Lê Minh Khoa Chăn nuôi Thú y - Đại học Nông lâm Thái Nguyên, TS Phạm Thị Tâm Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình bảo hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn tới cô Ths Phạm Thị Trang giúp đỡ em thời gian thực tập Qua đây, em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội thầy, cô giáo khoa giúp đỡ, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian thực tập khoa Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn thầy, với gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện để em hồn thành tốt q trình thực tập tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Vũ Thị Chiên DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Các hóa chất 28 Bảng 3.2: Các máy móc thiết bị 29 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 4.1 Kết xác định mật độ hạt latex nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex 38 Bảng 4.2: Kết xác định nhiệt độ thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex 39 Bảng 4.3: Kết phản ứng CATT để xác định độ nhạy độ đặc hiệu 41 Bảng 4.4: Độ nhạy Kit CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản 42 Bảng 4.5: Độ đặc hiệu Kit CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản 43 Bảng 4.6 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu Kit dạng CATT dựa vào mẫu máu trâu thu thập thực địa 44 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1: Ngun lý phản ứng ngưng kết dạng CATT 33 Hình 4.1: Đánh giá kết sử dụng Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 37 Hình 4.2: Phản ứng so sánh mẫu huyết âm tính (a) mẫu huyết dương tính (b) với tiên mao trùng 37 Hình 4.3: Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - hạt latex (tỷ lệ pha loãng kháng nguyên 1/32, tỷ lệ pha loãng kháng thể 1/16) 40 Hình 4.4: Phương pháp tiêm truyền chuột bạch 44 Hình 4.5: Tiên mao trùng máu chuột sau ngày gây nhiễm 44 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN CATT Cs EDTA ELISA GPBS IFAT IPTG KHKT MSC NXB PBS RNA SDS Se Sp TEA TMT TT VAT VSG : Acid deoxyribonucleic : Card Agglutination Test for Trypanosomiasis : Cộng : Ethylen Diamin Tetra Acetic : Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay : Glycine Phosphat Buffered Saline : Indirect Fluorescent Antibody Test : Isopropyl β - D - thiogalactoside : Khoa học kỹ thuật : Màng sinh chất : Nhà xuất : Phosphat Buffered Saline : Ribonucleic acid : Sodium Dodecyl Sulfat : Sensitivity : Specificity : Tris - axit acetic - EDTA : Tiên mao trùng : Thể trọng : Variant Antigen Tupe : Variant Surface Glucoprotein MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa học tập nghiên cứu khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Những hiểu biết tiên mao trùng bệnh tiên mao trùng gia súc 2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại tiên mao trùng 2.1.2 Đặc điểm dịch tễ học tiên mao trùng 2.1.3 Đặc điểm bệnh lý lâm sàng 2.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 11 2.1.5 Phòng trị bệnh tiên mao trùng gia súc 17 2.2 Những hiểu biết Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 20 2.2.1 Kháng nguyên RoTAT 1.2 Trypanosoma evansi 20 2.2.2 Tách dịng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 21 2.2.3 Biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 22 2.3 Tình hình nghiên cứu tiên mao trùng 23 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 23 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 25 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 3.1.1.Đối tượng nghiên cứu 28 3.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 29 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu 30 3.3.1 Xác định điều kiện chế tạo Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 30 3.3.2 Xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 30 3.3.3 Thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đốn bệnh tiên mao trùng cho trâu, bị 30 3.4 Phương pháp nghiên cứu 30 3.4.1 Phương pháp ELISA 30 3.4.2 Phương pháp PCR 31 3.4.3 Phương pháp gắn kháng nguyên lên hạt latex 32 3.4.4 Phản ứng ngưng kết CATT 33 3.4.5 Phương pháp tách huyết 33 3.4.6 Phương pháp xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 34 3.4.7 Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 34 3.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 35 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết xác định điều kiện sản xuất Kit chẩn đoán huyết học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 36 4.1.1 Xác định điều kiện gắn kháng nguyên - hạt latex 36 4.1.2 Kết xác định nhiệt độ thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex 39 4.1.3 Đánh giá hiệu chẩn đoán phản ứng CATT 40 4.2 Nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit 41 4.3 Kết thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 43 Phần 5: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Tồn 47 5.3 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh tiên mao trùng hay gọi bệnh ngã nước trâu, bò Trypanosoma evansi (T evansi) gây Theo số liệu Phạm Sỹ Lăng (1982) [10], Phan Địch Lân (2004) [13], Phan Văn Chinh (2006) [2], bệnh tiên mao trùng xuất nhiều vùng nước, với tỷ lệ mắc cao: trâu 13 - 30%, bò - 14%, tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 - 20% Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng đến sản lượng thịt sức kéo Vì vậy, cơng tác chẩn đoán bệnh quan trọng, nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh để từ có biện pháp phòng trị bệnh phù hợp, hiệu Trong hệ thống phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng nước ta có nhiều phương pháp áp dụng như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết học, phương pháp chẩn đốn sinh học phân tử phương pháp chẩn đốn huyết học đánh giá có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cho kết nhanh có khả chẩn đốn với số lượng mẫu lớn thời gian ngắn; độ đặc hiệu CATT/ T evansi đạt 98%, ELISA/ T evansi đạt 95% LATEX/ T evansi đạt 82% (Verloo D cs, 2000 [42]) Ưu điểm phương pháp cho kết chẩn đoán nhanh, số lượng mẫu lớn Theo nghiên cứu Bajyana Songa Hamers (1988) [28], kháng nguyên RoTAT 1.2 kháng nguyên bề mặt T evansi, xuất sớm sau ký sinh trùng xuất đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu loài ký sinh trùng khác Trên sở sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để xây dựng quy trình sản xuất Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kit huyết học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng mẻ, phải sử dụng Kit nhập ngoại nên giá thành cao, chưa có khả cho phép sử dụng rộng rãi để chẩn đốn bệnh Vì vậy, để đáp ứng u cầu chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu lớn thời gian ngắn, nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu điều kiện chế tạo bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định điều kiện thiết lập Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa học tập nghiên cứu khoa học Kết đề tài thông tin khoa học điều kiện thích hợp để chế tạo bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò hiệu 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở khoa học để hồn thiện quy trình sản xuất Kit chẩn đốn bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò từ kháng nguyên tái tổ hợp Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Những hiểu biết tiên mao trùng bệnh tiên mao trùng gia súc Bệnh tiên mao trùng Blanchard (1888) phát Việt Nam Sau đó, bệnh xác định phổ biến hầu hết tỉnh, thành nước Bệnh loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây Trâu, bò, ngựa mắc bệnh dễ chết thiếu máu, suy nhược, giảm khả sinh sản sức sản xuất 2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại tiên mao trùng 2.1.1.1 Vị trí tiên mao trùng Trypanosoma evansi hệ thống phân loại động vật học Theo Levine cs (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn cs, 1997 [6]), vị trí tiên mao trùng hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) sau: Ngành Sarcomastigophora Phân ngành Mastigophora Lớp Zoomastigophorasida Bộ Kinetoplastorida Họ Trypanosomatidae, Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trypanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) Congolense Loài Trypanosoma (N) Siminae 39 nguyên gắn lên hạt latex Từ kết bảng 4.1 cho phép xác định công thức công thức tạo hạt latex gắn kháng nguyên với nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 300µg/ml, mật độ hạt latex: OD600 = 0,3 để chế tạo Kit có độ xác cao 4.1.2 Kết xác định nhiệt độ thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Bên cạnh việc xác định công thức gắn kết kháng nguyên lên hạt latex thời gian nhiệt độ gắn yếu tố quan trọng để tạo phức hợp Theo Zhang cs (2011) [49], điều kiện để gắn kháng thể lợn kháng lympho T người 37ºC/30 phút, đó, báo cáo Thomas (1995) [45] lại rằng, kháng nguyên polysaccharide Actinobacillus pleuropneumoniae gắn lên hạt latex nhiệt độ phòng Như vậy, kháng nguyên gắn lên hạt latex phụ thuộc vào chất kháng nguyên Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực thí nghiệm gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex điều kiện 37ºC/2 giờ; 37ºC/30 phút tiếp tục lắc 4ºC/qua đêm Kết thể bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết xác định nhiệt độ thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Điều kiện Nồng độ pha Loại loãng kháng kháng nguyờn nguyờn ẵ Huyt dng ẳ tớnh chun 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 ẵ Huyt õm ẳ tớnh chuẩn 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Điều kiện gắn kháng nguyên hạt latex 37ºC/30 phút; 37ºC/2 4ºC/qua đêm 3+ 4+ 3+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ 2+ 1+ 2+ +/+/- 40 Kết bảng 4.2 kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn lên hạt latex tốt điều kiện lắc 37ºC/30 phút tiếp tục lắc 4ºC/qua đêm Ở điều kiện này, mức độ tạo phản ứng ngưng kết kháng nguyên - hạt latex mạnh hơn; độ pha loãng huyết cho phản ứng cao Như vậy, kháng thể pha loãng theo tỷ lệ 1/16, kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/32 cho phản ứng rõ Hình 4.3: Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - hạt latex (tỷ lệ pha loãng kháng nguyên 1/32, tỷ lệ pha loãng kháng thể 1/16) 4.1.3 Đánh giá hiệu chẩn đoán phản ứng CATT Để đánh giá hiệu chẩn đoán phương pháp huyết học giá trị độ nhạy độ đặc hiệu phải thực gia súc gây nhiễm không gây nhiễm với mầm bệnh Tuy nhiên nghiên cứu này, số lượng gia súc thí nghiệm khơng nhiều (05 trâu gây nhiễm tiên mao trùng 03 trâu khơng gây nhiễm), gây sai số tính giá trị Để xác việc xác định độ nhạy đặc hiệu phản ứng CATT để xác định bệnh tiên mao trùng trâu Việt Nam, xử dụng 52 mẫu huyết trâu thí nghiệm, có: 18 mẫu dương tính với tiên mao trùng kiểm tra phương pháp tiêm truyền chuột phản ứng CATT với kháng nguyên hòa tan tiên mao trùng, 34 mẫu huyết trâu âm tính với tiên mao trùng điều trị Berenil kiểm tra huyết âm tính với tiên mao trùng tháng Kết phản ứng CATT thể hiên bảng 4.3 41 Bảng 4.3: Kết phản ứng CATT để xác định độ nhạy độ đặc hiệu Kết Các mẫu huyết trâu gây nhiễm TMT Các mẫu huyết trâu không gây nhiễm TMT Tổng số Xét nghiệm (+) 17 20 Xét nghiệm (-) 31 32 Tổng số 18 34 52 Từ 18 mẫu máu trâu dương tính với tiên mao trùng có 17 mẫu dương tính với phản ứng CATT sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2, điều đáng ý 05 mẫu máu trâu gây nhiễm với tiên mao trùng phân lập từ Lạng Sơn có kết dương tính Tương tự vậy, 31/34 mẫu máu trâu âm tính với tiên mao trùng phản ứng CATT bao gồm 03 mẫu máu trâu không gây nhiễm tiên mao trùng Kết cho phép phát độ nhạy phản ứng (Se) 94,44 %, độ đặc hiệu phản ứng (Sp) 91,18% Cơng thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu: Độ nhạy phản ứng (Se) = (17/18) × 100 = 94,44% Độ đặc hiệu phản ứng (Sp) = (31/34) × 100 = 91,18% 4.2 Nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit Bệnh tiên mao trùng trâu, bò xảy hầu khắp tỉnh Việt Nam, đó, mức độ mắc bệnh trâu, bị ni miền núi cao tỉnh đồng Vì vậy, cơng tác chẩn đốn để phát bệnh điều quan trọng, đặc biệt trâu, bị vùng sâu vùng xa, điều kiện dân trí thấp Do đó, việc chế tạo Kit dạng CATT đáp ứng cơng tác chẩn đốn bệnh tiên mao trùng vùng khó khăn Bên cạnh tiêu chí độ nhạy, độ đặc hiệu, đơn giản, dễ sử dụng điều kiện bảo quản Kit cần quan tâm Trong nghiên cứu này, xác định thông số bảo quản Kit để đưa điều kiện thích hợp nhằm có khuyến cáo phù hợp cho người sử dụng 42 Các yếu tố bảo quản Kit nghiên cứu nội dung gồm thời gian nhiệt độ Theo khuyến cáo bảo quản loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học phương pháp ELISA, phương pháp CATT, phương pháp IFAT, Kit thường bảo quản - 8ºC tháng Tuy nhiên, tình trạng cấp điện không thường xuyên vùng miền núi nên chúng tơi bố trí thêm thí nghiệm đánh giá Kit nhiệt độ phòng mùa năm Định kỳ hàng tháng kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định Kit Mỗi thí nghiệm thực liên tục tháng, số mẫu huyết dương tính chuẩn 18, âm tính chuẩn 34; số Kit sử dụng để chẩn đoán mẫu Kết theo dõi độ nhạy Kit dạng CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (bảng 4.4): điều kiện bảo quản 4ºC, độ nhạy trung bình phản ứng đạt giá trị cao 98,89% ba tháng đầu tiên, sau giảm xuống 97,78% tháng thứ đạt 96,67% sau - tháng bảo quản Trong đó, độ nhạy Kit bảo quản nhiệt độ phòng đạt 98,89% tháng đầu, sau giảm liên tục qua tháng bảo quản (95,56%; 94%; 93,33%; 92,22% tháng thứ 2; 3; 4; 5) 88,89% tháng thứ Sau tháng bảo quản, độ nhạy Kit giảm 2,2% 4ºC giảm 10% nhiệt độ phòng Kết tương đương với báo cáo Verloo cs (2000) [48] Bảng 4.4: Độ nhạy Kit CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản Tháng theo dõi năm 4ºC (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Nhiệt độ phịng (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Tháng thứ 98,89 ± 2,48 98,89 ± 2,48 Tháng thứ 98,89 ± 2,48 95,56 ± 2,48 Tháng thứ 98,89 ± 2,48 94,0 ± 0,00 Tháng thứ 97,78 ± 3,04 93,33 ± 2,48 Tháng thứ 96,67 ± 3,04 92,22 ± 3,04 Tháng thứ 96,67 ± 3,04 88,89 ± 3,83 43 Độ đặc hiệu Kit CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản (bảng 4.5) thể sau: điều kiện bảo quản 4ºC nhiệt độ phịng độ nhạy trung bình phản ứng đạt giá trị cao 99,41% Sau tháng bảo quản độ đặc hiệu Kit giảm 1,2% 4ºC giảm 1,8% nhiệt độ phòng Ở 4ºC, sau tháng thứ tháng thứ độ đặc hiệu giảm 0,6%; nhiệt độ phịng độ đặc hiệu giảm 0,6% sau tháng Trong điều kiện nhiệt độ phịng độ đặc hiệu Kit giảm liên tục qua tháng: giảm 0,6% tháng thứ so với tháng thứ nhất; tháng thứ tiếp tục giảm 0,6% so với tháng thứ 2; tháng cuối tiếp tục giảm 1,2% Thực tế lần thí nghiệm cho thấy, mẫu chẩn đốn dương tính giả có kết khơng rõ ràng, mẫu nghi ngờ chúng tơi xác định dương tính Có thể sau thời gian bảo quản, hạt latex kết dính khơng đặc hiệu nên thực phản ứng ngưng kết kháng nguyên - latex cho kết không rõ ràng gây sai số Bảng 4.5: Độ đặc hiệu Kit CATT theo thời gian nhiệt độ bảo quản năm 4ºC (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Nhiệt độ phịng (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Tháng thứ 99,41 ± 1,32 99,41 ± 1,32 Tháng thứ 99,41 ± 1,32 98,82 ± 1,61 Tháng thứ 98,82 ± 1,61 98,24 ± 1,61 Tháng thứ 98,24 ± 1,61 97.65 ± 1,32 Tháng thứ 98,24 ± 1,61 97.65 ± 1,32 Tháng thứ 98,24 ± 1,61 97,65 ± 1,32 Tháng theo dõi 4.3 Kết thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Kit dạng CATT sử dụng để thử nghiệm đánh giá 550 mẫu máu trâu thu thập từ tỉnh Cao Bằng, Tuyên Quang, Lai Châu, có 66 mẫu dương tính, 484 mẫu âm tính với bệnh tiên mao trùng xác định phương pháp tiêm truyền chuột bạch 44 Hình 4.4: Phương pháp tiêm truyền chuột bạch Hình 4.5: Tiên mao trùng máu chuột sau ngày gây nhiễm Kết chẩn đoán Kit dạng CATT so sánh với kết chẩn đoán phản ứng PCR phản ứng ELISA Số liệu phương pháp trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu Kit dạng CATT dựa vào mẫu máu trâu thu thập thực địa Phương pháp chẩn đoán KIT CATT Phản ứng ELISA Phản ứng PCR Độ nhạy (%) 65/66 (98,48) 65/66 (98,48) 66/66 (100) Giá trị dự báo dương tính (%) 84,42 82,50 80,49 Độ đặc hiệu (%) 472/484 (97,52) 470/484 (97,11) 468/484 (96,69) Giá trị dự báo âm tính (%) 99,79 99,79 100 45 Kết bảng cho thấy, Kit dạng CATT phát 65/66 trâu dương tính, 12/484 trâu âm tính với tiên mao trùng cho kết dương tính giả Trong đó, phương pháp PCR cho kết 66/66 trâu dương tính, 16/484 trâu âm tính với tiên mao trùng cho kết dương tính giả; phương pháp ELISA cho kết 65/66 trâu dương tính, 14/484 trâu âm tính với tiên mao trùng cho kết dương tính giả Bên cạnh đó, với kết thu giá trị dự báo dương tính âm tính cho thấy: khả để dự đốn cá thể trâu thực mắc bệnh tiên mao trùng kết xét nghiệm dương tính CATT 84,42%, phản ứng ELISA 82,5%, phản ứng PCR 80,49%; khả để dự đoán cá thể trâu thật khơng mắc bệnh tiên mao trùng kết xét nghiệm âm tính phản ứng CATT 99,79%, phản ứng ELISA 99,79%, phản ứng PCR 100% Như vậy, xác xuất chẩn đốn xác mẫu huyết dương tính phản ứng CATT cao so với phản ứng ELISA phản ứng PCR, điều lý giải rằng, cá thể trâu có tiên mao trùng, mật độ ký sinh trùng mức độ thấp dẫn tới kết phản ứng PCR dương tính tiêm truyền chuột bạch cho kết âm tính Bên cạnh số cá thể trâu điều trị khỏi bệnh, ký sinh trùng khơng cịn diện máu trâu IgG lượng nhỏ máu trâu, lượng IgG không đủ để phát phản ứng CATT phát phản ứng ELISA Cũng bảng 4.6 cho thấy, xác suất chẩn đốn xác mẫu âm tính phản ứng PCR cao phản ứng CATT phản ứng ELISA, kết hoàn toàn logic phù hợp với nghiên cứu Holland cs (2000) [35], khả phát phản ứng PCR ký sinh trùng/ml máu, phương pháp tiêm truyền chuột 1,5 ký sinh trùng/ml máu Như vậy, phản ứng PCR âm tính đồng nghĩa với kết cá thể trâu xét nghiệm không mắc bệnh tiên mao trùng Tuy nhiên, số liệu bảng 4.6 chứng tỏ rằng, xác suất để kết luận xác mẫu máu âm tính với bệnh tiên mao trùng phản ứng CATT phản ứng ELISA tương đương nhau, đạt 99,79% 46 Phần KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bệnh tiên mao trùng hay gọi bệnh ngã nước trâu, bò Trypanosoma evansi gây Bệnh xuất nhiều vùng nước, với tỷ kệ mắc cao: trâu 13 - 30%, bị - 14%, tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 - 20% Tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi gia súc vùng núi trung du cao vùng đồng ven biển Trong đó, nước ta, chăn ni gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ yếu tỉnh miền núi trung du - vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho phát triển chăn ni gia súc nhai lại, sở hạ tầng phục vụ cơng tác chẩn đốn điều trị địa phương yếu kém; dẫn tới hệ bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng gây thiệt hại lớn Trong trình tiến hành nghiên cứu đề tài, thu kết sau: 1/ Xác định công thức tạo hạt latex gắn kháng nguyên: nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 300µg/ml, mật độ hạt latex OD600= 0,3 Điều kiện gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex điều kiện ủ, lắc 37ºC/30 phút tiếp tục lắc 4ºC/qua đêm; kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/32, kháng thể 1/16 2/ Thời gian bảo quản Kit lâu độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định giảm Bảo quản Kit 4ºC độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định Kit cao bảo quản Kit nhiệt độ phòng thời gian 3/ Kit dạng CATT thử nghiệm đánh giá 550 mẫu máu trâu, có 66 mẫu dương tính, 484 mẫu âm tính với bệnh tiên mao trùng xác định phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng Khả để dự đoán cá thể trâu thực mắc bệnh tiên mao trùng kết xét nghiệm dương tính phản ứng CATT 84,42%; khả để dự đoán cá thể trâu thật khơng mắc bệnh tiên mao trùng kết xét nghiệm âm tính phản ứng CATT 99,79% 47 5.2 Tồn Do điều kiện thời gian thực tập có hạn, thí nghiệm thực tháng nên chưa có kết luận thật xác Thí nghiệm thực môi trường thuận lợi nên áp dụng vào thực tiễn gặp số khó khăn 5.3 Đề nghị Thử nghiệm Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bị địa phương, từ có biện pháp phịng trị bệnh phù hợp, hiệu 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Phạm Chiến, Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết (1999), “Kết khảo sát ký sinh trùng đường máu đàn bò huyện Mi Dinh Daklak ”, Kết hoạt động KHKT Thú y, tr 53 Phạm Văn Chinh (2006), Bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi trâu, bị ni tỉnh miền Trung biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quốc Doanh, Lương Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ, Phạm Sỹ Lăng (1996), “Kết dùng Trypamidium samorin điều trị bệnh tiên mao trùng trâu bị T evansi gây ra”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Quản lý, số 12/1996, tr 300 - 301 Nguyễn Quốc Doanh (1997), “Hiệu lực Trypazen điều tri bệnh tiên mao trùng trâu T evansi gây ra”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Quản lý, số 4/1997, tr 87 - 88 Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học T evansi (Steel, 1885), Bệnh học chúng gây ra, quy trình bảo quản sử dụng giống T evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Hà Nội Lương Văn Huấn, Lê Hữu Khương (1997), Giáo trình Ký sinh bệnh ký sinh gia súc, gia cầm, Nhà xuất Đại học Quốc gia – TP.HCM Nguyễn Đăng Khải (1995), “Về triệu chứng sảy thai bệnh tiên mao trùng trâu bị T evansi”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 1, tr 69 - 71 Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Lê, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Văn Quang (2008), Giáo trình ký sinh trùng thú y (giáo trình dùng cho bậc cao học), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 123 - 144 Phạm Sỹ Lăng (1978 - 1979), Tập huấn kỹ thuật chẩn đoán khống chế bệnh tiên mao trùng, Hà Nội, tháng năm 2002, Viện Thú y 49 10 Phạm sỹ Lăng (1982), Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trâu, bò Trypanosoma evansi tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoan học Thú y 11 Phạm sỹ Lăng, Lê Ngọc Mỹ (1984), “Một số thay đổi máu trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi (Steel, 1885) tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y, 1979 - 1984 12 Phan Địch Lân (1974), “Thành phần họ mịng Tabanidae vai trị truyền bệnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí KHKT Nơng nghiệp, tập III, tr 23 - 26 13 Phan Địch Lân (2004), Bệnh ngã nước trâu bị, Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội, tr 56 - 73 14 Phan Lục, Trần Văn Quyết Nguyễn Văn Thọ (1996), “Tình hình nhiễm đơn bào ký sinh trùng trâu bò số vùng trung du đồng phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 15 Hà Viết Lượng (1998), Đơn bào ký sinh, đặc điểm dich tễ biện pháp phòng trị bệnh Trypanosomiasis trâu bò thuộc Nam Trung Bộ, Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp, Hà Nội 16 Lê Ngọc Mỹ (1994), “Phương pháp ELISA phát kháng nguyên phương pháp ký sinh trùng học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (T evansi) trâu bị mắc bệnh tự nhiên”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 17 Phan Cự Nhân (2001), Di truyền học động vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 18 Đoàn Văn Phúc, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Đăng Khải (1981), “Thí nghiệm dùng Trypamidium điều trị bệnh tiên mao trùng”, Thông tin thú y - Viện Thú y, Hà Nội 19 Đoàn Văn Phúc (1994), “Kết ứng dụng số phương pháp huyết học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trâu thực địa”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 20 Vương Thị Lan Phương (2004), Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi phân lập từ trâu, bị phía Bắc Việt Nam tinh chế 50 kháng nguyên dùng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội 21 Lê Đức Quyết, Hà Viết Lượng, Nguyễn Đức Tân, Bùi Lập (1995), “Tình hình trâu, bị nhiễm tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) số tỉnh duyên hải miền Trung Tây Nguyên”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 22 Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết, Nguyễn Thị Sâm, Lê Hữu Ngọc Lực (2004), “Điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường máu ứng dụng biện pháp phòng trị thích hợp cho đàn bị số tỉnh Nam Trung Bộ Tây Nguyên”, “Kỷ yếu Viện Thú y 35 năm xây dựng phát triển”, Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội - 2004 23 Hồng Thạch, Phan Hồng Dũng, Hồ Thị Thuận (1996), “Điều tra tình hình nhiễm bệnh tiên mao trùng T evansi nghiên cứu qui trình phịng trị bệnh cho trâu, bị sữa tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 24 Lương Tố Thu (1994), “Kết sản xuất Conjugate huỳnh quang chẩn đoán bệnh tiên mao trùng so sánh độ nhạy với phương pháp chuẩn khác”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 25 Lương Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ (1996), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp ngưng kết nhựa (CATT) để chẩn đốn tình hình bệnh tiên mao trùng (do T evansi) đàn trâu Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IV, số 26 Hồ Thị Thuận (1980), “Kết bước đầu điều tra điều trị bệnh ký sinh trùng đường máu trâu bị mốt số sở chăn ni miền Nam Việt Nam”, Tạp chí KHKT Nơng nghiệp, số 3, tr.103 27 Hồ Thị Thuận, Phan Hoàng Dũng (1996), “Kết điều tra điều trị Trypanosoma evansi số sở chăn ni trâu,bị sữa phía Nam phương pháp ELISA”, Kết nghiên cứu khoa học Thú y, Viện Thú y, tr 50 - 56 Tài liệu tiếng nước 28 Bajyana Songa E., Hamers R (1988), “A card agglutination test (CATT) for 51 veterinary use based on an early VAT RoTAT 1/2 of Trypanosoma evansi”, Ann Soc Belg Med Trop.68, September 1988, page 233 - 240 29 Chen Qijun (1992), “Study on cross immunity of antibodies against differents strains of Trypanosoma evansi”, Seminar Paris, (10), page 152 30 Challier A., Laveissiere C (1973), “Un nouveau piege pour la capture des glossines (Glossina: Diptera, Muscidae): description et essais sur le terrain”, Cahiers ORSTOM Madical Parasitology and Entomology, 11(4), page 251 - 262 31 Davison (1999), Evaluation of diagnostic test for T evansi and then application in epidemiogical studies in Indonesia , PhS thesis Eliburgh 32 Goossens B, Mbwambo H, Msangi A, Geysen D Verysen (2006), “Trypanosomiosis prevalence in cattle on Mafia Island (Tanzania)”, Veterinary Parasitology, Volume 139, Issues - 3, 30 June 2006, pp 74 - 83 33 Hechemy E K., Anacker L R., Philip N R., Kleeman T R., MaCormack N J., Sasowski J S., Michaelson E E (1980), “Detection of Rocky Mountain spotted fever antibodies by a latex agglutination test”, Joural of Clinical Microbiology, 12, (2), page 144 - 150 34 Hoare C A (1972), “The Trypanosomes of Mammais A zoological monograph, Black well scientific Publication”, Oxford and Edinburgh 35 Holland W G., Verloo D., My L N., Thanh N G., Tam P T., Goddeeris B., Vercruysse J Buscher P (2000), “Comparison of serological tests for Trypanosoma evansi natural infections in water buffaloes from north Vietnam”, Veterinary Parasitology, Volume 92, Issues 2, 20 September 2000, page 87 - 96 36 Jordan A N (1974), “Recent developments in the ecology and methods of centrol tsete flies (Giosina spp) (Diptera, Glossinidae) a review”, Bull Entomol Res., (63), page 361 - 399 37 Luckins A G (1988), “Trypanosoma evansi in Asia”, Parasitology today, Volume 4, Issues 5, 20 May 1988, page 132 - 142 38 Liu J H., Ou Y C (1992), “Trypanosoniasis in China (1980 - 1981)”, 52 Seminar Paris, (10), page 152 39 Nishikawa H., Tunlasuvan D (1990), “Serolgical survey of Trypanosomosisand babesiosis in cattle and buffalo in Thailand Published: proceedings of the 7th congress of federation of Asia veterinary association”, Pattaya, (10), page 199 40 Salim B., Bakheit M A., Kamau J., Nakamura I., Sugimoto C (2011), “Molecular epidemiology of camel Trypanosomiasis based on ITS1 rDNA and RoTat 1.2 VSG gene in the Sudan”, Parasit Vectors, (2), page 31 41 Simukoko H., Marcotty T., Phiri I., Geysen D., Vercruysse J., Van den Bossche P (2007), “The comparative role of cattle, goat and pigs in the epidemiology of livestock Trypanosomiasis on the plateau of eastern Zambia”, Veterinary Parasitology, Volume 147, Issues - 4, 20 June 2007, page 231 - 238 42 Sinshaw A., Abebe G., Desquennes M., Yoni W (2006), “Biting flies and Trypanosoma vivax infection in three highland districts bordering lake Tana, Ethiopia”, Veterinary Parasitology, Volume 142, Issues - 2, 30 November 2006, page 35 - 46 43 Sinyangwe L., Delespaux V., Brandt J., Geerts S., Mubanga J., Machila N., Holmes P H Eisler M C (2004), “Trypanocidal drug resistance in eastern province of Zambia”, Veterinary Parasitology, Volume 119, Issues - 3, 30 January 2004, page 125 – 135 44 Sukanto I P., Rayne R C., Partoutomo S., Polytedi F (1992), Experimental infection of Friesian Holstein calves with an Indonesian isolate of Trypanosoma evansi, Europe PubMed Cental publisher, page 115 - 117 45 Thomas J T (1995), “Simplified procedure for preparation of sensitized latex particles to detect capsular polysaccharides: application to typing and diagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae”, Joural of Clinical Microbiology, 33(9), page 2297 - 2303 46 Touratier L., Aims (1979), ”A chievements and prospects of the international working group in Trypanossoma evansi infection”, A 53 Suroerf 5th international Conference Kuala Lampur, (8), page 18 -22 47 Tperrona M C., Leseurand L., Renveom (1992), “Seroepidemiology of vovine Trypanosomiasis in the area of Santamaria de ipire, Venezuela”, Seminar Paris, (10), page 96 48 Verloo D., Holland W G., Claes F., My L.N., Thanh N G., Tam P T., Buscher P., Goddeeris B., Vercruysse J (2000), “A comparative evaluation of parasitological test and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes”, Veterinary Parasitology, Volume 97, Issues 1, May 2001, page 23 - 33 49 Zhang Q., Deng Z., Jia X., Ding W., Wang G (2011), “Development and Evaluation of a Simple Latex Agglutination Test for the Detection of Pig Antibodies Against Human T-cell”, International Journal of Applied Research inVeterinary Medicine, 9(2), page 211 ... ngắn, nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu điều kiện chế tạo bảo quản Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) trâu, bò” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định điều kiện thiết lập Kit chẩn đốn bệnh. .. nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 Để đánh giá khả phát bệnh Kit chế tạo được, tiến hành thử nghiệm chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. .. điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 34 3.4.7 Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên