Phạm Sỹ Lăng (1978 - 1979) [9], công bố, ổ dịch do tiên mao trùng xảy ra tại hai địa điểm là Hoàng Long và Kim Thành gây chết trâu bò với tỷ lệ cao
dao động từ 6,3 - 16,2% tổng đàn. Tỷ lệ nhiễm theo điều tra, ở trâu là 7 - 13%, ở bò là 2 - 7%; nhiễm nặng nhất là trâu ở lứa tuổi 6 - 8 năm tuổị Thường trâu bò càng già, tỷ lệ mắc bệnh càng caọ
Tổng hợp từ các báo cáo của các chi cục thú y ở các tỉnh miền Bắc, thấy số trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng như sau: Từ năm 1960 - 1965, số trâu, bò bị mắc bệnh là 1776 con, chết 520 con; từ năm 1979 - 1983, số gia súc ốm là 4629 con, chết 3243 con; từ năm 1984 - 1988, số gia súc ốm là 4028 con, chết 3710 con.
Lê Ngọc Mỹ (1994) [16] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu, bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu,bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu, bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm T. evansi cao hơn ở đồng bằng.
Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [16], nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ bệnh
tiên mao trùng do T. evansi gây ra cho biết, hiện tượng sảy thai ở trâu, bò mắc
tiên mao trùng rất cao dao động từ 19,23 - 47,82%. Các tác giả cho biết, trong thời gian nghiên cứu, ghi nhận được số trâu, bò mắc tiên mao trùng mà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng chiếm tỷ lệ rất caọ Với 121 mẫu kiểm tra trâu, bò khỏe, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, các tác giả phát hiện 36,17% có tiên mao trùng trong máụ
Theo Lê Đức Quyết và cs (1995) [21], Phạm Chiến và cs (1999) [1], trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6 - 10,3%.
Phan Lục và cs (1996) [14] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của bò ở một số địa phương miền Bắc là 5,9%. Khi nghiên cứu tình hình nhiễm đơn bào ở một số tỉnh miền Trung và đồng bằng phía Bắc Việt Nam thấy, tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu là 28,8%, ở bò là 9,9%. Trong đó, trâu dưới 2 tuổi nhiễm 2,8%, từ 2 - 8 tuổi nhiễm 30,7% và trên 8 tuổi nhiễm tới 40,3%; bò dưới 2 tuổi nhiễm 1,5%, từ 2 - 8 tuổi nhiễm 11,5% và bò trên 8 tuổi nhiễm 28%.
Theo Hoàng Thạch và cs (1996) [23], nghiên cứu về tình hình nhiễm tiên mao trùng của trâu và bò ở khu vực phía Nam cho biết: với 1830 mẫu nghiên cứu tại các tỉnh Sông Bé, Đồng Nai, Lâm Đồng, Long An và Thành
phố Hồ Chí Minh phát hiện 146 mẫu nhiễm tiên mao trùng, chiếm tỷ lệ 7,97%. Trong đó tỷ lệ nhiễm của trâu là 9,98% và ở bò là 12,60%.
Theo Hồ Thị Thuận, Phan Hoàng Dũng (1996) [27] điều tra tình hình nhiễm T. evansi ở một số đàn bò sữa các tỉnh phía Nam như An Phước (Đồng Nai), Đức Trọng (Lâm Đồng), Tân Thắng và các hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí Minh, các hộ chăn nuôi gia đình ở huyện Đức Hòa (Long An), Bến Cát (Sông Bé) bằng phương pháp MI và ELISA thấy tỷ lệ nhiễm trung bình là 7,97%. Nhưng chỉ có trâu bò ở Bến Cát nhiễm 9,98%; ở An Phước là 12,60%; Lâm Đồng là 2,09%; còn ở các nơi khác không có.
Theo Hà Viết Lượng (1998) [15], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%.
Theo Nguyễn Đức Tân và cs (2004) [22], điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường máu ở một số đàn bò thuộc một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên cho biết: Nghiên cứu tổng số 557 mẫu phát hiện 49 mẫu có tiên mao trùng, chiếm 8,8%. Trong đó nhiễm nặng nhất là nuôi tại tỉnh Đắk Lắk, nhiễm 10,3%; nhiễm thấp nhất là đàn bò nuôi tại tỉnh Phú Yên, nhiễm 6,6%; đàn bò nuôi tại tỉnh Khánh Hòa nhiễm 8,5%.
Phan Địch Lân (2004) [13] đã tổng hợp kết quả điều tra 3172 trâu ở các tỉnh đồng bằng: trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,1%), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm cao hơn (10,6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổị
Theo Phan Văn Chinh (2006) [2], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của trâu, bò cao nhất ở 4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là dưới 3 năm tuổi (6,92% và 2,31%).
Trong những năm gần đây, việc phòng trị bệnh tiên mao trùng với các phương pháp chẩn đoán nhanh, các thuốc điều trị mới, bệnh tiên mao trùng do
T. evansi gây ra cũng không còn là một bệnh gây nhiều tác hại cho đàn trâu, bò ở nước ta như những năm trước đâỵ
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Năm 1880, Laveran là người đầu tiên phát hiện Trypanosoma evansi trong máu lạc đà ở bang Punjab (Ấn Độ).
Năm 1885, Steel phát hiện ký sinh trùng này trong máu la ở Miến Điện, mô tả đặc điểm hình thái và đặt tên là Trypanosoma evansi.
Năm 1886, Blanchard cũng tìm thấy T. evansi trong máu la nhập nội vào Bắc Bộ Việt Nam và mô tả các thể bệnh ở la, ngựa, bò.
Năm 1901, Forde phát hiện Trypanosoma gambiense và đến năm 1907 Chagas phát hiện Trypanosoma cruizi.
Năm 1893, Smith và Kilborne đã nghiên cứu về vai trò truyền bệnh của ve trong bệnh tiên mao trùng.
Ở Trung Quốc, cho biết: T. evansi gây bệnh cho hầu hết các loài động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó…
Nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm bệnh Trypanosomiasis, nhiều tác giả đã đưa ra những con số cụ thể:
Năm 1992, Tperone M.C. và cs (1992) [47] đã kiểm tra bò ở Venezuela thấy: bò dưới 3 tháng tuổi nhiễm T. evansi 13% và bò trên 36 tháng tuổi nhiễm 50%.
Theo Sukanto Ị P. và cs (1992) [44]: tỷ lệ lưu hành bệnh tiên mao trùng ở trâu Indonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ lưu hành bệnh ở bò lại cao hơn ở ngựạ
Ở Thái Lan, trâu bò ở hầu khắp các tỉnh trong cả nước đều nhiễm
Trypanosoma evansi nhưng tỷ lệ nhiễm bệnh ở bò cao hơn ở trâu (Nishikawa H., Tuntasuvan D., 1990 [39]).
Theo Simukoko H. và cs (2007) [41], nghiên cứu về dịch tễ bệnh tiên mao trùng ở các vật nuôi như: bò, lợn và dê ở Đông Zambia cho thấy: với 734 bò nghiên cứu phát hiện tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng là 13,5%; trong đó với 324 lợn nghiên cứu, các tác giả phát hiện chỉ có 0,9% trong số đó bị nhiễm; với 33 dê nghiên cứu, các tác giả chưa phát hiện được tiên mao trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Goossens B. và cs (2006) [32], nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở bò thuộc khu vực Mafia Island (Tanzania) cho biết: nghiên cứu 970 mẫu, phát hiện 0,8% có tiên mao trùng trong máụ Sinyangwe và cs (2004) [43], nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng ở khu vực Đông Zambia, cho biết: trong tổng số 1526 mẫu huyết thanh nghiên cứu, phát hiện 14,4% mẫu có kháng thể
tiên mao trùng. Trong đó, nhiễm Trypanosoma congolense chiếm tới 96%, còn lại nhiễm Trypanosoma vivax là 2% và Trypanosoma brucei là 2%.
Sinshaw Ạ và cs (2006) [42] cho biết, nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm
Trypanosoma vivax ở 3 khu vực thuộc Ethiopia cho thấy: bò nhiễm 6,1%, trong đó mùa mưa nhiễm 9,6%, mùa khô nhiễm 3,6%. Tác giả phát hiện 1/122 mẫu máu cừu có tiên mao trùng, chiếm 0,81%; còn đối với dê, tác giả thông báo có 1/676 mẫu nhiễm, chiếm tỷ lệ là 0,14%.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1.Đối tượng nghiên cứu
- Kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi.
- Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
3.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
* Hóa chất sử dụng
Bảng 3.1: Các hóa chất chính
Tên hóa chất Hãng sản xuất
NaOH Merks (Đức)
Tween 20 Trung Quốc
Trimethybenzoic Sigma (Mỹ) H2SO4 Trung Quốc NaCl Merks (Đức) KH2PO4 Merks (Đức) Na2HPO4.2H2O Merks (Đức) KCl Merks (Đức) Hạt latex Merks (Đức)
Xanh Methylen Trung Quốc
Glycine Merks (Đức)
* Các môi trường sử dụng
+ Môi trường PBS
Thành phần Khối lượng (gram)
NaCl KH2PO4 Na2HPO4.2H2O KCl 9 0,254 1,72 0,2 Hòa tan trong 1000ml H2O
+ Môi trường GPBS
Thành phần Khối lượng (gram) NaCl KH2PO4 Na2HPO4.2H2O KCl Glycine 9 0,254 1,72 0,2 7,507 Hòa tan trong 1000ml H2O
* Máy móc và thiết bị sử dụng
Bảng 3.2: Các máy móc và thiết bị chính
Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất
Tủ ấm ổn nhiệt Sanyo (Nhật)
Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ)
Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thommas Scientific(Mỹ) Tủ lạnh - 20o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C, - 80oC Nuaire (Mỹ)
Lò vi sóng Sanyo (Nhật)
Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức) Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Analitika (Đức)
Cân điện tử Adam
Máy hút chân không Speed – Vac 110A Savant (Mỹ)
Máy Vortex Mimishaker, IKA (Đức)
Đĩa ELISA Fementas (Mỹ)
Bản nhựa CATT Fementas (Mỹ)
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nộị
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Xác định điều kiện chế tạo Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
- Xác định các điều kiện hoạt hóa hạt latex để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex.
- Xác định tỷ lệ hàm lượng kháng nguyên và hạt latex để tạo phức hợp.
3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
- Đánh giá ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit.
- Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit.
3.3.3. Thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò.
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
- Thử nghiệm đánh giá khả năng phát hiện bệnh của Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp ELISA
ELISA gián tiếp (Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể trong mẫu xét nghiệm.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: (1) Kháng nguyên - antigen chuẩn được gắn trên bề mặt pha rắn (đĩa ELISA); (2) Kháng thể - antibody chưa biết được phủ lên bề mặt có chứa kháng nguyên; (3) Kháng thể đặc hiệu loài gắn kết với enzyme (conjugate); (4) Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.Trên cơ sở đã chế tạo được kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành phản ứng ELISA nhằm phát hiện bệnh tiên mao trùng.
Quy trình gồm các bước sau:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100 µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trực tiếp vào đĩa ELISẠ Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37o
C trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Sau đó, dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200 µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần và làm khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 3. Gắn kháng thể: 100 µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS - sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần và làm khô.
Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100 µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 5 lần và làm khô.
Bước 5. Cơ chất tạo màu: 100 µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng.
Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.
3.4.2. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là dùng enzym để khuếch đại chọn lọc một đoạn khuôn mẫu ADN theo quy luật số mũ. Với nguyên lý này người ta có thể tạo ra vô số bản sao của một phân tử ADN đơn.
Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng.
Cặp mồi cho PCR chẩn đoán, hầu hết là trình tự mã hóa kháng nguyên của Trypanosoma evansi. Các cặp mồi có kích thước khoảng 20 nucleotides.
Tuỳ mục đích chẩn đoán hay nghiên cứu người ta có thể tiến hành nhân bản những vùng đích đặc trưng hay nhân cả hệ gen của tiên mao trùng.
Để khuếch đại trình tự gen mã hóa RoTAT 1.2 có kích thước 216bp của
Trypanosoma evansi, Bashir salim và cs (2011) [40] đã dùng 1 cặp mồi gồm: Mồi xuôi F1.2 (5’ - GCGGGGTGTTTAAAGCAATA 3’)
Mồi ngược R1.2 (5’ - ATTAGTGCTGCGTGTGTTGG 3’)
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích(µl)
RNase- free water Mồi: R3 - F2 ADN Master – mix 7,1 1,2 0,5 10 Tổng 50 Chu trình phản ứng: PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút - 94ºC/ 1 phút - 60ºC/30 giây 30 cycle - 72ºC/ 30 giây - 72º C/ 5 phút
Kết quả PCR sẽ được điện di trên gel Agarose 1,5% để so sánh với các mẫu chuẩn để kết luận.
3.4.3. Phương pháp gắn kháng nguyên lên hạt latex
Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được gắn lên hạt latex theo phương pháp của Hechemy và cs (1980) [33]. Hạt latex có kích thước 0,81µm (Difco Laboratories, Mỹ) được pha loãng trong dung dịch 0,1M glycine - buffered saline (pH = 8,1) để đạt mật độ OD = 0,3 - 0,5 ở bước sóng 600 nm. Lấy 0,5 ml dung dịch chứa hạt latex rồi trộn với 0,3 ml kháng nguyên hòa tan ở các nồng độ từ 200 - 500µg/ml và 0,2 ml dung dịch huyết thanh bào thai bê 0,1% (Sigma Chemical, Mỹ) rồi bổ sung sodium azide và hỗn hợp đạt hàm lượng 1%.
Hỗn hợp hạt latex - kháng nguyên được ủ, lắc ở các điều kiện 37ºC/2 giờ hoặc ủ, lắc ở 37ºC/30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC/qua đêm. Điều kiện tối ưu để
gắn kháng nguyên lên hạt latex được xác định bằng phương pháp checkerboard để xác định hiệu giá kháng thể cho phản ứng ngưng kết dương tính.
3.4.4. Phản ứng ngưng kết CATT
Phản ứng thực hiện dựa trên nguyên lý kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan được gắn trên hạt latex và kháng thể. Phức hợp kháng nguyên - hạt latex - kháng thể được tạo thành dưới dạng mạng lưới và dễ dàng quan sát được bằng mắt thường (hình 3.1).
Để thực hiện phản ứng, mẫu huyết thanh được pha loãng theo hệ số 2 trong dung dịch glycine buffered saline có 1% huyết thanh bào thai bê và theo thứ tự: 1) phosphate - buffered saline, pH = 7,2; 2) 0,1M glycine - buffered saline, pH = 8,1(GBS); 3) GBS bổ sung 0,1% huyết thanh bào thai bê.
Hình 3.1: Nguyên lý của phản ứng ngưng kết dạng CATT
Trộn 20 µl huyết thanh và 20 µl hạt latex phủ kháng nguyên trên phiến latex, lắc phiến trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả phản ứng sau 5 phút, mẫu huyết thanh được xác định dương tính khi có hiện tượng ngưng kết giọt phản ứng.
3.4.5. Phương pháp tách huyết thanh
Sau 1 tháng gây nhiễm tiên mao trùng, máu trâu được thu để tách huyết thanh theo định kỳ 1 tuần/lần. Máu được lấy ở tĩnh mạch cổ, mỗi lần lấy khoảng 15ml máu cho vào các ống falcon, nhẹ nhàng đặt nghiêng ống khoảng 45º cho
đến khi máu đông, để vào ngăn mát tủ lạnh 30 phút, sau đó bỏ ra để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi ly tâm 3000 vòng/phút để thu huyết thanh.
Huyết thanh thu được đánh dấu mẫu rồi cất vào tủ lạnh bảo quản trong
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});