Để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng sử dụng vector pET 32a (+). Với ưu điểm là có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào vật chủ, có promoter hoạt động mạnh, có gen kháng kháng sinh là chỉ thị để chọn lọc tế bào chứa plasmid tái tổ hợp, pET 32a (+) được sử dụng nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau trong biểu hiện ở mức độ cao của các gen ở vi khuẩn Ẹ coli.
Plasmid pJET - RoTAT 1.2 chứa trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 sau khi được tinh sạch sẽ được sử dụng trực tiếp để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen RoTAT 1.2.
Gen RoTAT 1.2 và vector pET 32a (+) được cắt lần lượt với enzym
Bam HI rồi được điện di và tinh sạch bằng kit Hing Pure Product purification kit (Roche). Sau đó, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với Xho Ị Sản phẩm xử lý enzym cuối cùng sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhaụ Kết quả điện di là xuất hiện một băng duy nhất có kích thước tương tự như kích thước lý thuyết của gen và vector. Điều đó chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai enzym cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lượng tốt.
Sản phẩm phản ứng ghép nối gen được biến nạp vào tế bào Ẹ coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin với nồng độ 100µg/ml. Các khuẩn lạc trắng có khả năng chứa vector tái tổ hợp được lựa chọn để tách chiết plasmid và cắt bằng enzym cắt giới hạn. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào Ẹ coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên đĩa LB có chứa kháng sinh Ampicillin ở 37ºC, qua đêm. Chủng vi khuẩn Ẹ coli BL21(DE3)pLysS là chủng vi khuẩn mang những đặc tính di truyền đã được biến đổi thích hợp cho việc biểu hiện các protein tái tổ hợp từ nhóm vector pET. Chủng này còn mang plasmid pLysS mã hóa cho lyzozyme giúp kiểm
soát chặt chẽ hơn cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp so với chủng BL21(DE3) thông thường. Protein RoTAT 1.2 được biểu hiện ở dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis. Sự biểu hiện protein RoTAT 1.2 trong Ẹ coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng phương pháp SDS -PAGE và tiếp theo là Western blot.
Các dòng tế bào Ẹ coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 thu từ đĩa nuôi cấy rồi tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường lỏng LB có chứa Ampicillin 100µg/ml, ở 37ºC qua đêm đến pha ổn định. Từ dịch nuôi cấy ổn định này, vi khuẩn lại tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh Ampicillin 100µg/ml, lắc trong khoảng 3 giờ để OD600 đạt từ 0,6 - 1 và bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối cùng là 1mM. Điều kiện cảm ứng IPTG là 37ºC trên máy lắc với tốc độ 200rpm trong 4 giờ. Đoạn gen mã hóa cho protein RoTAT 1.2 được chèn vào vùng MCS của vector pET 32ă+) và sự biểu hiện protein với sự kiểm soát của T7 promoter. Trên vector pET 32ă+) có chứa gen lacI mã hóa cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Ptotein RoTAT 1.2 sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấỵ
Để khẳng định chắc chắn khả năng biểu hiện của gen RoTAT 1.2, tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng T. evansi và kháng thể đặc hiệu kháng 6xHis. Protein RoTAT 1.2 sau khi được phân tích trên gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose rồi cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu và sau đó được gắn với protein A gắn peroxidase, hiện màu bằng TMB. Như vậy, kháng nguyên RoTAT 1.2 của
tiên mao trùng Trypanosoma evansi ở vi khuẩn Ẹ coli BL21(DE3) đã được
biểu hiện thành công.