Trong quy trình sản xuất Kit chẩn đoán dạng CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, vấn đề mấu chốt là phải gắn được kháng nguyên lên hạt latex để tạo phức hợp có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể ở độ nhạy cao nhất. Để gắn kháng nguyên lên hạt latex, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm với các yếu tố như sau:
- Mật độ hạt latex: 0,3; 0,4; 0,5
- Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml): 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500
- Huyết thanh dương tính chuẩn được lấy từ trâu gây nhiễm tiên mao trùng, pha loãng trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:8
- Huyết thanh âm tính chuẩn được sử dụng là huyết thanh bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1:8
Phức hợp hạt latex - kháng nguyên được sử dụng để kết hợp với các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính chuẩn. Căn cứ vào kết quả thu được, chúng tôi đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và 1+, 4+ (hình 4.1).
Để tạo phức hợp kháng nguyên và hạt latex có hiệu quả cao trong việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng thì cần phải đạt được 3 yêu cầu: 1) phải gắn được lượng kháng nguyên trên hạt latex đủ để tạo được phản ứng gắn kết kháng nguyên - kháng thể mạnh nhất; 2) mật độ hạt latex phủ kháng nguyên phải đủ để tạo phản ứng ngưng kết mạnh nhất, có thể quan sát rõ ràng bằng mắt thường; 3) phức hợp hạt latex gắn kháng nguyên không tạo phản ứng âm tính giả hoặc dương tính giả với kháng thể đặc hiệụ
Hình 4.1: Đánh giá kết quả sử dụng Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
a) b)
Hình 4.2: Phản ứng so sánh mẫu huyết thanh âm tính (a) và mẫu huyết thanh dương tính (b) với tiên mao trùng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cả kháng thể dương tính và
âm tính chuẩn để xác định mật độ hạt latex và hàm lượng kháng nguyên. Trong đó, bằng kháng thể dương tính chuẩn, chúng tôi có thể xác định được hàm lượng kháng nguyên, còn mật độ hạt latex được xác định dựa vào phản ứng của phức hợp kháng nguyên - hạt latex với huyết thanh âm tính chuẩn. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Kháng nguyên RoTAT 1.2 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml)
Huyết thanh dương tính chuẩn Huyết thanh âm tính chuẩn Mật độ hạt latex (OD600) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 200 +/- +/- + + + - - - - - 250 +/- +/- ++ ++ ++ - - - - +/- 300 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 350 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 400 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 450 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 500 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/-
Kết quả trong bảng 4.1 cho thấy: đánh giá bằng huyết thanh âm tính chuẩn với các công thức tạo kháng nguyên - hạt latex cho kết quả: mật độ hạt latex từ 0,1 - 0,3 cho phản ứng ngưng kết âm tính với tất cả các nồng độ kháng nguyên, ở mật độ hạt latex là 0,4 - 0,5 có hiện tượng tạo phản ứng ngưng kết giả tương ứng với nồng độ kháng nguyên là từ 350µg/ml. Kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex quá cao có thể gây khó khăn trong việc xác định phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong các thí nghiệm sử dụng huyết thanh dương tính chuẩn, khi mật độ hạt latex là 0,1 thì phản ứng ngưng kết luôn cho giá trị nghi ngờ với tất cả các nồng độ kháng nguyên thí nghiệm. Mật độ hạt latex là 0,2 cũng cho kết quả tương tự với nồng độ kháng nguyên là 200 và 250µg/ml, khi tăng hàm lượng kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml thì phản ứng cho kết quả ở mức độ 2+. Các kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex còn thấp dẫn tới số lượng epitope kháng nguyên được gắn lên hạt latex thấp. Đây là nguyên nhân dẫn đến độ nhạy của phức hợp kháng nguyên - hạt latex không caọ
Mật độ hạt latex từ 0,3 - 0,4 thì phản ứng ngưng kết đạt giá trị 1+ ở nồng độ kháng nguyên là 200µg/ml và 2+ ở nồng độ kháng nguyên là 250µg/ml. Khi tăng nồng độ kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml, phản ứng ngưng kết đạt giá trị 4+. Điều này chứng tỏ mức độ tạo phản ứng ngưng kết tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên hay số lượng các epitope của kháng
nguyên được gắn lên hạt latex. Từ các kết quả trong bảng 4.1 cho phép chúng tôi xác định công thức công thức tạo hạt latex gắn kháng nguyên với nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 là 300µg/ml, mật độ hạt latex: OD600 = 0,3 để chế tạo Kit có độ chính xác caọ