3.3.1. Xác định điều kiện chế tạo Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
- Xác định các điều kiện hoạt hóa hạt latex để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex.
- Xác định tỷ lệ hàm lượng kháng nguyên và hạt latex để tạo phức hợp.
3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
- Đánh giá ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit.
- Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit.
3.3.3. Thử nghiệm Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò.
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
- Thử nghiệm đánh giá khả năng phát hiện bệnh của Kit chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp ELISA
ELISA gián tiếp (Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể trong mẫu xét nghiệm.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: (1) Kháng nguyên - antigen chuẩn được gắn trên bề mặt pha rắn (đĩa ELISA); (2) Kháng thể - antibody chưa biết được phủ lên bề mặt có chứa kháng nguyên; (3) Kháng thể đặc hiệu loài gắn kết với enzyme (conjugate); (4) Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.Trên cơ sở đã chế tạo được kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành phản ứng ELISA nhằm phát hiện bệnh tiên mao trùng.
Quy trình gồm các bước sau:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100 µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trực tiếp vào đĩa ELISẠ Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37o
C trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Sau đó, dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200 µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần và làm khô.
Bước 3. Gắn kháng thể: 100 µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS - sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần và làm khô.
Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100 µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 5 lần và làm khô.
Bước 5. Cơ chất tạo màu: 100 µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng.
Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.
3.4.2. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là dùng enzym để khuếch đại chọn lọc một đoạn khuôn mẫu ADN theo quy luật số mũ. Với nguyên lý này người ta có thể tạo ra vô số bản sao của một phân tử ADN đơn.
Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng.
Cặp mồi cho PCR chẩn đoán, hầu hết là trình tự mã hóa kháng nguyên của Trypanosoma evansi. Các cặp mồi có kích thước khoảng 20 nucleotides.
Tuỳ mục đích chẩn đoán hay nghiên cứu người ta có thể tiến hành nhân bản những vùng đích đặc trưng hay nhân cả hệ gen của tiên mao trùng.
Để khuếch đại trình tự gen mã hóa RoTAT 1.2 có kích thước 216bp của
Trypanosoma evansi, Bashir salim và cs (2011) [40] đã dùng 1 cặp mồi gồm: Mồi xuôi F1.2 (5’ - GCGGGGTGTTTAAAGCAATA 3’)
Mồi ngược R1.2 (5’ - ATTAGTGCTGCGTGTGTTGG 3’)
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích(µl)
RNase- free water Mồi: R3 - F2 ADN Master – mix 7,1 1,2 0,5 10 Tổng 50 Chu trình phản ứng: PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút - 94ºC/ 1 phút - 60ºC/30 giây 30 cycle - 72ºC/ 30 giây - 72º C/ 5 phút
Kết quả PCR sẽ được điện di trên gel Agarose 1,5% để so sánh với các mẫu chuẩn để kết luận.
3.4.3. Phương pháp gắn kháng nguyên lên hạt latex
Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được gắn lên hạt latex theo phương pháp của Hechemy và cs (1980) [33]. Hạt latex có kích thước 0,81µm (Difco Laboratories, Mỹ) được pha loãng trong dung dịch 0,1M glycine - buffered saline (pH = 8,1) để đạt mật độ OD = 0,3 - 0,5 ở bước sóng 600 nm. Lấy 0,5 ml dung dịch chứa hạt latex rồi trộn với 0,3 ml kháng nguyên hòa tan ở các nồng độ từ 200 - 500µg/ml và 0,2 ml dung dịch huyết thanh bào thai bê 0,1% (Sigma Chemical, Mỹ) rồi bổ sung sodium azide và hỗn hợp đạt hàm lượng 1%.
Hỗn hợp hạt latex - kháng nguyên được ủ, lắc ở các điều kiện 37ºC/2 giờ hoặc ủ, lắc ở 37ºC/30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC/qua đêm. Điều kiện tối ưu để
gắn kháng nguyên lên hạt latex được xác định bằng phương pháp checkerboard để xác định hiệu giá kháng thể cho phản ứng ngưng kết dương tính.
3.4.4. Phản ứng ngưng kết CATT
Phản ứng thực hiện dựa trên nguyên lý kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan được gắn trên hạt latex và kháng thể. Phức hợp kháng nguyên - hạt latex - kháng thể được tạo thành dưới dạng mạng lưới và dễ dàng quan sát được bằng mắt thường (hình 3.1).
Để thực hiện phản ứng, mẫu huyết thanh được pha loãng theo hệ số 2 trong dung dịch glycine buffered saline có 1% huyết thanh bào thai bê và theo thứ tự: 1) phosphate - buffered saline, pH = 7,2; 2) 0,1M glycine - buffered saline, pH = 8,1(GBS); 3) GBS bổ sung 0,1% huyết thanh bào thai bê.
Hình 3.1: Nguyên lý của phản ứng ngưng kết dạng CATT
Trộn 20 µl huyết thanh và 20 µl hạt latex phủ kháng nguyên trên phiến latex, lắc phiến trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả phản ứng sau 5 phút, mẫu huyết thanh được xác định dương tính khi có hiện tượng ngưng kết giọt phản ứng.
3.4.5. Phương pháp tách huyết thanh
Sau 1 tháng gây nhiễm tiên mao trùng, máu trâu được thu để tách huyết thanh theo định kỳ 1 tuần/lần. Máu được lấy ở tĩnh mạch cổ, mỗi lần lấy khoảng 15ml máu cho vào các ống falcon, nhẹ nhàng đặt nghiêng ống khoảng 45º cho
đến khi máu đông, để vào ngăn mát tủ lạnh 30 phút, sau đó bỏ ra để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi ly tâm 3000 vòng/phút để thu huyết thanh.
Huyết thanh thu được đánh dấu mẫu rồi cất vào tủ lạnh bảo quản trong điều kiện lạnh sâu - 20ºC.
3.4.6. Phương pháp xác định điều kiện bảo quản Kit theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Để xác định điều kiện bảo quản Kit thích hợp, không làm ảnh hưởng đến chất lượng của Kit, chúng tôi tiến hành bảo quản Kit ở hai điều kiện nhiệt độ: nhiệt độ phòng và ở 4 - 8ºC rồi hàng tháng thực hiện thí nghiệm xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của Kit, thí nghiệm được thực hiện trong 6 tháng. Điều kiện bảo quản Kit được xác định bởi các yếu tố và khi đó, độ nhạy và độ ổn định của Kit không thay đổi so với thời điểm Kit mới được tạo rạ
3.4.7. Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
3.4.7.1. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit chế tạo được
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh trâu để chẩn đoán bệnh
Lấy mẫu máu trâu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đạ Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 37ºC, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì cho ống nghiệm vào trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 6ºC trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh li tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầụ Bảo quản huyết thanh ở - 20ºC.
* Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit
Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với tiên mao trùng của trâu được sử dụng để thực hiện xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit.
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng được xác định theo bảng và công thức dưới đây:
Kết quả Bị nhiễm TMT Không bị nhiễm TMT Tổng số
Xét nghiệm (+) A B A + B
Xét nghiệm (-) C D C + D
Tổng số A + C B+ D N
Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như sau:
Độ nhạy của phản ứng (Se) (%) = [A/(A + C)] × 100 Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) (%) = [D/(B + D)] × 100
+ Độ ổn định của Kit được xác định trên 10 mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên, kháng thể đặc hiệu với tiên mao trùng trong các mẫu huyết thanh này được xác định bằng Kit chế tạo với cùng các điều kiện thực hiện. Lặp lại phản ứng 5 lần. Chấm điểm ngưng kết của tất cả các lần phản ứng, xác định hệ số biến động (coefficient of variation - CV) theo công thức của Yang (1990).
3.4.7.2. Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Để đánh giá khả năng phát hiện bệnh của Kit chế tạo được, chúng tôi tiến hành thử nghiệm chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu bằng 3 phương pháp: Kit chế tạo được, phản ứng ELISA, phản ứng PCR. Từ đó, so sánh và đánh giá độ chính xác của Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
Công thức tính:
Giá trị dự báo âm tính (%) = [a/(a+b)] × 100 Giá trị dự báo dương tính (%) = [c/(c+d)] × 100 Trong đó:
+ a: số mẫu âm tính thật + b: số mẫu âm tính giả + c: số mẫu dương tính thật + d: số mẫu dương tính giả
3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008) và phần mềm Minitab 14.0.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả xác định các điều kiện sản xuất Kit chẩn đoán huyết thanh học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
4.1.1. Xác định các điều kiện gắn kháng nguyên - hạt latex
Trong quy trình sản xuất Kit chẩn đoán dạng CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, vấn đề mấu chốt là phải gắn được kháng nguyên lên hạt latex để tạo phức hợp có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể ở độ nhạy cao nhất. Để gắn kháng nguyên lên hạt latex, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm với các yếu tố như sau:
- Mật độ hạt latex: 0,3; 0,4; 0,5
- Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml): 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500
- Huyết thanh dương tính chuẩn được lấy từ trâu gây nhiễm tiên mao trùng, pha loãng trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:8
- Huyết thanh âm tính chuẩn được sử dụng là huyết thanh bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1:8
Phức hợp hạt latex - kháng nguyên được sử dụng để kết hợp với các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính chuẩn. Căn cứ vào kết quả thu được, chúng tôi đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và 1+, 4+ (hình 4.1).
Để tạo phức hợp kháng nguyên và hạt latex có hiệu quả cao trong việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng thì cần phải đạt được 3 yêu cầu: 1) phải gắn được lượng kháng nguyên trên hạt latex đủ để tạo được phản ứng gắn kết kháng nguyên - kháng thể mạnh nhất; 2) mật độ hạt latex phủ kháng nguyên phải đủ để tạo phản ứng ngưng kết mạnh nhất, có thể quan sát rõ ràng bằng mắt thường; 3) phức hợp hạt latex gắn kháng nguyên không tạo phản ứng âm tính giả hoặc dương tính giả với kháng thể đặc hiệụ
Hình 4.1: Đánh giá kết quả sử dụng Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
a) b)
Hình 4.2: Phản ứng so sánh mẫu huyết thanh âm tính (a) và mẫu huyết thanh dương tính (b) với tiên mao trùng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cả kháng thể dương tính và
âm tính chuẩn để xác định mật độ hạt latex và hàm lượng kháng nguyên. Trong đó, bằng kháng thể dương tính chuẩn, chúng tôi có thể xác định được hàm lượng kháng nguyên, còn mật độ hạt latex được xác định dựa vào phản ứng của phức hợp kháng nguyên - hạt latex với huyết thanh âm tính chuẩn. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Kháng nguyên RoTAT 1.2 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml)
Huyết thanh dương tính chuẩn Huyết thanh âm tính chuẩn Mật độ hạt latex (OD600) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 200 +/- +/- + + + - - - - - 250 +/- +/- ++ ++ ++ - - - - +/- 300 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 350 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 400 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 450 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 500 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/-
Kết quả trong bảng 4.1 cho thấy: đánh giá bằng huyết thanh âm tính chuẩn với các công thức tạo kháng nguyên - hạt latex cho kết quả: mật độ hạt latex từ 0,1 - 0,3 cho phản ứng ngưng kết âm tính với tất cả các nồng độ kháng nguyên, ở mật độ hạt latex là 0,4 - 0,5 có hiện tượng tạo phản ứng ngưng kết giả tương ứng với nồng độ kháng nguyên là từ 350µg/ml. Kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex quá cao có thể gây khó khăn trong việc xác định phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong các thí nghiệm sử dụng huyết thanh dương tính chuẩn, khi mật độ hạt latex là 0,1 thì phản ứng ngưng kết luôn cho giá trị nghi ngờ với tất cả các nồng độ kháng nguyên thí nghiệm. Mật độ hạt latex là 0,2 cũng cho kết quả tương tự với nồng độ kháng nguyên là 200 và 250µg/ml, khi tăng hàm lượng kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml thì phản ứng cho kết quả ở mức độ 2+. Các kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex còn thấp dẫn tới số lượng epitope kháng nguyên được gắn lên hạt latex thấp. Đây là nguyên nhân dẫn đến độ nhạy của phức hợp kháng nguyên - hạt latex không caọ
Mật độ hạt latex từ 0,3 - 0,4 thì phản ứng ngưng kết đạt giá trị 1+ ở nồng độ kháng nguyên là 200µg/ml và 2+ ở nồng độ kháng nguyên là 250µg/ml. Khi tăng nồng độ kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml, phản ứng ngưng kết đạt giá trị 4+. Điều này chứng tỏ mức độ tạo phản ứng ngưng kết tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên hay số lượng các epitope của kháng
nguyên được gắn lên hạt latex. Từ các kết quả trong bảng 4.1 cho phép chúng tôi xác định công thức công thức tạo hạt latex gắn kháng nguyên với nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 là 300µg/ml, mật độ hạt latex: OD600 = 0,3 để chế