Để xác định điều kiện bảo quản Kit thích hợp, không làm ảnh hưởng đến chất lượng của Kit, chúng tôi tiến hành bảo quản Kit ở hai điều kiện nhiệt độ: nhiệt độ phòng và ở 4 - 8ºC rồi hàng tháng thực hiện thí nghiệm xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của Kit, thí nghiệm được thực hiện trong 6 tháng. Điều kiện bảo quản Kit được xác định bởi các yếu tố và khi đó, độ nhạy và độ ổn định của Kit không thay đổi so với thời điểm Kit mới được tạo rạ
3.4.7. Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
3.4.7.1. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit chế tạo được
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh trâu để chẩn đoán bệnh
Lấy mẫu máu trâu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đạ Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 37ºC, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì cho ống nghiệm vào trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 6ºC trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh li tâm 1000 vòng/phút để loại bỏ hồng cầụ Bảo quản huyết thanh ở - 20ºC.
* Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit
Các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính với tiên mao trùng của trâu được sử dụng để thực hiện xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit.
+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng được xác định theo bảng và công thức dưới đây:
Kết quả Bị nhiễm TMT Không bị nhiễm TMT Tổng số
Xét nghiệm (+) A B A + B
Xét nghiệm (-) C D C + D
Tổng số A + C B+ D N
Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu như sau:
Độ nhạy của phản ứng (Se) (%) = [A/(A + C)] × 100 Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) (%) = [D/(B + D)] × 100
+ Độ ổn định của Kit được xác định trên 10 mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên, kháng thể đặc hiệu với tiên mao trùng trong các mẫu huyết thanh này được xác định bằng Kit chế tạo với cùng các điều kiện thực hiện. Lặp lại phản ứng 5 lần. Chấm điểm ngưng kết của tất cả các lần phản ứng, xác định hệ số biến động (coefficient of variation - CV) theo công thức của Yang (1990).
3.4.7.2. Phương pháp thử nghiệm Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Để đánh giá khả năng phát hiện bệnh của Kit chế tạo được, chúng tôi tiến hành thử nghiệm chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu bằng 3 phương pháp: Kit chế tạo được, phản ứng ELISA, phản ứng PCR. Từ đó, so sánh và đánh giá độ chính xác của Kit chế tạo theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
Công thức tính:
Giá trị dự báo âm tính (%) = [a/(a+b)] × 100 Giá trị dự báo dương tính (%) = [c/(c+d)] × 100 Trong đó:
+ a: số mẫu âm tính thật + b: số mẫu âm tính giả + c: số mẫu dương tính thật + d: số mẫu dương tính giả
3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học (theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện, 2008) và phần mềm Minitab 14.0.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả xác định các điều kiện sản xuất Kit chẩn đoán huyết thanh học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 học từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
4.1.1. Xác định các điều kiện gắn kháng nguyên - hạt latex
Trong quy trình sản xuất Kit chẩn đoán dạng CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, vấn đề mấu chốt là phải gắn được kháng nguyên lên hạt latex để tạo phức hợp có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể ở độ nhạy cao nhất. Để gắn kháng nguyên lên hạt latex, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm với các yếu tố như sau:
- Mật độ hạt latex: 0,3; 0,4; 0,5
- Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml): 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500
- Huyết thanh dương tính chuẩn được lấy từ trâu gây nhiễm tiên mao trùng, pha loãng trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:8
- Huyết thanh âm tính chuẩn được sử dụng là huyết thanh bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1:8
Phức hợp hạt latex - kháng nguyên được sử dụng để kết hợp với các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính chuẩn. Căn cứ vào kết quả thu được, chúng tôi đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và 1+, 4+ (hình 4.1).
Để tạo phức hợp kháng nguyên và hạt latex có hiệu quả cao trong việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng thì cần phải đạt được 3 yêu cầu: 1) phải gắn được lượng kháng nguyên trên hạt latex đủ để tạo được phản ứng gắn kết kháng nguyên - kháng thể mạnh nhất; 2) mật độ hạt latex phủ kháng nguyên phải đủ để tạo phản ứng ngưng kết mạnh nhất, có thể quan sát rõ ràng bằng mắt thường; 3) phức hợp hạt latex gắn kháng nguyên không tạo phản ứng âm tính giả hoặc dương tính giả với kháng thể đặc hiệụ
Hình 4.1: Đánh giá kết quả sử dụng Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
a) b)
Hình 4.2: Phản ứng so sánh mẫu huyết thanh âm tính (a) và mẫu huyết thanh dương tính (b) với tiên mao trùng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cả kháng thể dương tính và
âm tính chuẩn để xác định mật độ hạt latex và hàm lượng kháng nguyên. Trong đó, bằng kháng thể dương tính chuẩn, chúng tôi có thể xác định được hàm lượng kháng nguyên, còn mật độ hạt latex được xác định dựa vào phản ứng của phức hợp kháng nguyên - hạt latex với huyết thanh âm tính chuẩn. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Kháng nguyên RoTAT 1.2 Nồng độ kháng nguyên (µg/ml)
Huyết thanh dương tính chuẩn Huyết thanh âm tính chuẩn Mật độ hạt latex (OD600) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 200 +/- +/- + + + - - - - - 250 +/- +/- ++ ++ ++ - - - - +/- 300 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 350 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 400 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 450 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/- 500 + ++ ++++ ++++ ++++ - - - - +/-
Kết quả trong bảng 4.1 cho thấy: đánh giá bằng huyết thanh âm tính chuẩn với các công thức tạo kháng nguyên - hạt latex cho kết quả: mật độ hạt latex từ 0,1 - 0,3 cho phản ứng ngưng kết âm tính với tất cả các nồng độ kháng nguyên, ở mật độ hạt latex là 0,4 - 0,5 có hiện tượng tạo phản ứng ngưng kết giả tương ứng với nồng độ kháng nguyên là từ 350µg/ml. Kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex quá cao có thể gây khó khăn trong việc xác định phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong các thí nghiệm sử dụng huyết thanh dương tính chuẩn, khi mật độ hạt latex là 0,1 thì phản ứng ngưng kết luôn cho giá trị nghi ngờ với tất cả các nồng độ kháng nguyên thí nghiệm. Mật độ hạt latex là 0,2 cũng cho kết quả tương tự với nồng độ kháng nguyên là 200 và 250µg/ml, khi tăng hàm lượng kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml thì phản ứng cho kết quả ở mức độ 2+. Các kết quả này chứng tỏ, mật độ hạt latex còn thấp dẫn tới số lượng epitope kháng nguyên được gắn lên hạt latex thấp. Đây là nguyên nhân dẫn đến độ nhạy của phức hợp kháng nguyên - hạt latex không caọ
Mật độ hạt latex từ 0,3 - 0,4 thì phản ứng ngưng kết đạt giá trị 1+ ở nồng độ kháng nguyên là 200µg/ml và 2+ ở nồng độ kháng nguyên là 250µg/ml. Khi tăng nồng độ kháng nguyên lên 300 - 500µg/ml, phản ứng ngưng kết đạt giá trị 4+. Điều này chứng tỏ mức độ tạo phản ứng ngưng kết tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên hay số lượng các epitope của kháng
nguyên được gắn lên hạt latex. Từ các kết quả trong bảng 4.1 cho phép chúng tôi xác định công thức công thức tạo hạt latex gắn kháng nguyên với nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 là 300µg/ml, mật độ hạt latex: OD600 = 0,3 để chế tạo Kit có độ chính xác caọ
4.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex nguyên - hạt latex
Bên cạnh việc xác định được công thức gắn kết kháng nguyên lên hạt latex thì thời gian và nhiệt độ gắn cũng là các yếu tố quan trọng để tạo phức hợp. Theo Zhang và cs (2011) [49], điều kiện để gắn kháng thể của lợn kháng lympho T người là 37ºC/30 phút, trong khi đó, báo cáo của Thomas (1995) [45] lại chỉ ra rằng, kháng nguyên polysaccharide của Actinobacillus pleuropneumoniae được gắn lên hạt latex ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Như vậy, kháng nguyên được gắn lên hạt latex phụ thuộc vào bản chất của kháng nguyên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex ở các điều kiện 37ºC/2 giờ; 37ºC/30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC/qua đêm. Kết quả thể hiện trong bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex Điều kiện Loại kháng nguyên Nồng độ pha loãng kháng nguyên Điều kiện gắn kháng nguyên và hạt latex 37ºC/2 giờ 37ºC/30 phút; 4ºC/qua đêm
Huyết thanh dương
tính chuẩn ½ 3+ 4+ ¼ 3+ 4+ 1/8 3+ 4+ 1/16 3+ 3+ 1/32 2+ 3+ 1/64 2+ 2+ 1/128 1+ 2+
Huyết thanh âm
tính chuẩn ½ +/- +/- ¼ - - 1/8 - - 1/16 - - 1/32 - - 1/64 - - 1/128 - -
Kết quả bảng 4.2 chỉ ra rằng kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn lên hạt latex tốt nhất ở điều kiện lắc ở 37ºC/30 phút rồi tiếp tục lắc ở 4ºC/qua đêm. Ở điều kiện này, mức độ tạo phản ứng ngưng kết kháng nguyên - hạt latex là mạnh hơn; độ pha loãng huyết thanh cho phản ứng cũng cao hơn. Như vậy, kháng thể pha loãng theo tỷ lệ 1/16, kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/32 cho phản ứng rõ nhất.
Hình 4.3: Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - hạt latex (tỷ lệ pha loãng kháng nguyên là 1/32, tỷ lệ pha loãng kháng thể là 1/16)
4.1.3. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của phản ứng CATT
Để đánh giá hiệu quả chẩn đoán của một phương pháp huyết thanh học thì các giá trị độ nhạy và độ đặc hiệu phải được thực trên gia súc gây nhiễm và không gây nhiễm với mầm bệnh. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, số lượng gia súc thí nghiệm không nhiều (05 con trâu gây nhiễm tiên mao trùng và 03 con trâu không gây nhiễm), vì vậy có thể gây sai số khi tính các giá trị nàỵ Để chính xác hơn trong việc xác định độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng CATT để xác định bệnh tiên mao trùng trên trâu ở Việt Nam, chúng tôi xử dụng 52 mẫu huyết thanh trâu thí nghiệm, trong đó có: 18 mẫu dương tính với tiên mao trùng đã được kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột và phản ứng CATT với kháng nguyên hòa tan của tiên mao trùng, 34 mẫu huyết thanh trâu âm tính với tiên mao trùng được điều trị Berenil và kiểm tra huyết thanh âm tính với tiên mao trùng trong 1 tháng. Kết quả phản ứng CATT được thể hiên trong bảng 4.3.
Bảng 4.3: Kết quả phản ứng CATT để xác định độ nhạy và độđặc hiệu
Kết quả
Các mẫu huyết thanh trâu gây
nhiễm TMT
Các mẫu huyết thanh trâu không
gây nhiễm TMT
Tổng số
Xét nghiệm (+) 17 3 20
Xét nghiệm (-) 1 31 32
Tổng số 18 34 52
Từ 18 mẫu máu trâu dương tính với tiên mao trùng có 17 mẫu dương tính với phản ứng CATT khi sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2, điều đáng chú ý là 05 mẫu máu trâu gây nhiễm với tiên mao trùng phân lập được từ Lạng Sơn đều có kết quả dương tính. Tương tự như vậy, trong 31/34 mẫu máu trâu âm tính với tiên mao trùng và phản ứng CATT cũng bao gồm 03 mẫu máu trâu không gây nhiễm tiên mao trùng. Kết quả trên cho phép phát hiện độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,44 %, độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 91,18%.
Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu:
Độ nhạy của phản ứng (Se) = (17/18) × 100 = 94,44% Độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) = (31/34) × 100 = 91,18%
4.2. Nghiên cứu điều kiện bảo quản Kit
Bệnh tiên mao trùng trâu, bò xảy ra ở hầu khắp các tỉnh của Việt Nam, trong đó, mức độ mắc bệnh của trâu, bò nuôi ở miền núi cao hơn ở các tỉnh đồng bằng. Vì vậy, công tác chẩn đoán để phát hiện bệnh là điều hết sức quan trọng, đặc biệt đối với trâu, bò ở vùng sâu vùng xa, điều kiện dân trí thấp. Do đó, việc chế tạo Kit dạng CATT đã đáp ứng được công tác chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở các vùng khó khăn. Bên cạnh các tiêu chí độ nhạy, độ đặc hiệu, đơn giản, dễ sử dụng thì điều kiện bảo quản Kit cũng cần được quan tâm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định các thông số bảo quản Kit để đưa ra các điều kiện thích hợp nhằm có các khuyến cáo phù hợp cho người sử dụng.
Các yếu tố bảo quản Kit được nghiên cứu trong nội dung này gồm thời gian và nhiệt độ. Theo khuyến cáo bảo quản các loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học như phương pháp ELISA, phương pháp CATT, phương pháp IFAT,... thì Kit thường được bảo quản ở 4 - 8ºC trong 6 tháng. Tuy nhiên, do tình trạng cấp điện không thường xuyên ở các vùng miền núi nên chúng tôi bố trí thêm thí nghiệm đánh giá Kit ở nhiệt độ phòng của các mùa trong năm. Định kỳ hàng tháng kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của Kit. Mỗi thí nghiệm được thực hiện liên tục trong 6 tháng, số mẫu huyết thanh dương tính chuẩn là 18, âm tính chuẩn là 34; số Kit sử dụng để chẩn đoán một mẫu là 3.
Kết quả theo dõi độ nhạy của Kit dạng CATT theo thời gian và nhiệt độ bảo quản để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (bảng 4.4): ở điều kiện bảo quản 4ºC, độ nhạy trung bình của phản ứng đạt giá trị cao nhất là 98,89% trong ba tháng đầu tiên, sau đó giảm xuống 97,78% ở tháng thứ 4 và đạt 96,67% sau 5 - 6 tháng bảo quản. Trong khi đó, độ nhạy của Kit khi bảo quản ở nhiệt độ phòng đạt 98,89% trong một tháng đầu, sau đó giảm liên tục qua các tháng bảo quản (95,56%; 94%; 93,33%; 92,22% lần lượt ở các tháng thứ 2; 3; 4; 5) và chỉ còn 88,89% ở tháng thứ 6. Sau 6 tháng bảo quản, độ nhạy của Kit giảm 2,2% ở 4ºC và giảm 10% ở nhiệt độ phòng. Kết quả trên tương đương với báo cáo của Verloo và cs (2000) [48].
Bảng 4.4: Độ nhạy của Kit CATT theo thời gian và nhiệt độ bảo quản
Tháng theo dõi trong năm 4ºC (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Nhiệt độ phòng (% trung bình ± độ lệch chuẩn) Tháng thứ 1 98,89 ± 2,48 98,89 ± 2,48 Tháng thứ 2 98,89 ± 2,48 95,56 ± 2,48 Tháng thứ 3 98,89 ± 2,48 94,0 ± 0,00 Tháng thứ 4 97,78 ± 3,04 93,33 ± 2,48 Tháng thứ 5 96,67 ± 3,04 92,22 ± 3,04 Tháng thứ 6 96,67 ± 3,04 88,89 ± 3,83
Độ đặc hiệu của Kit CATT theo thời gian và nhiệt độ bảo quản (bảng 4.5) được thể hiện như sau: ở điều kiện bảo quản ở 4ºC và ở nhiệt độ phòng thì độ nhạy trung bình của phản ứng đạt giá trị cao nhất đều là 99,41%. Sau 6 tháng bảo quản độ đặc hiệu của Kit giảm 1,2% ở 4ºC và giảm 1,8% ở nhiệt độ phòng.